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문제 정의
- 본 연구에서는 어류에서 기존의 aluminum hydroxide gel 혹은 mineral oil emulsion adjuvant 보다 더욱 효과적이고, 효율적이며 생체 내에서 부작용이 없는 안전한 molecular adjuvant의 개발을 위하여 넙치로부터 유용한 면역관련 분자들을 클로닝 하였고, 이들로부터 재조합단백질을 제작하였다. 제작된 재조합단백질들을 이용하여 넙치의 백혈구를 자극하여 면역능 유도를 조사하였다.
- 이번 연구에서는 넙치의 중요 면역관련 유전자로 알려진 TNF-α, CD40, IL-1β와 G-CSF의 molecular adjuvant로의 가능성 및 활용을 조사하기 위하여 재조합단백질 제작을 시도하였다.
제안 방법
- coli BL21 (DE3)에 transformation하였다. 0, 0.1, 0.5 mM로 준비된 IPTG (isopropyl-D-thiogalactoside)를 transformation 된 E. coli BL21에 첨가하여 37℃에서 4시간동안 배양하여 넙치 면역 관련 유전자 재조합단백질의 발현을 유도하였다.
- 2) rPoGCSF의 pH별 처리에 따른 면역관련 유전자의 발현 유도능 조사 rPoGCSF를 pH 2, 4, 6, 8, 10, 12에서 24시간 처리 후 넙치 백혈구를 자극하여 IL-1β와 TNF 발현량을 조사하였다.
- 4가지의 넙치 면역관련 유전자 재조합단백질 제작 후보군 중에서 G-CSF를 선정하여 fusion partner로 MBP (Maltose binding protein, 40 kDa)를 G-CSF의 N-말단에 붙여서 cloning 하였고 상술한대로 IPTG를 첨가하여 재조합단백질의 발현을 유도하였다. 발현이 유도된 G-CSF 재조합단백질은 MBP affinity resin을 이용하여 정제하였다.
- 제작된 primer를 이용하여 PCR로 증폭시킨 후 gel extraction을 통하여 각 면역유전자들을 추출한 뒤 pET 22b vector에 cloning을 하였다. Cloning 이후 각 유전자의 삽입 여부와 amino acid의 서열에 mutation 여부를 sequencing을 통해 확인한 후에 각각의 넙치 면역유전자들이 삽입된 pET 22b vector를 E. coli BL21 (DE3)에 transformation하였다. 0, 0.
- Insoluble form으로 발현된 4가지의 면역유전자 재조합단백질 중에서 G-CSF를 선정하여 E. coli BL21 (DE)에서 안정적으로 soluble form으로 발현시키기 위하여 fusion partner로 MBP를 G-CSF의 N-말단에 붙여서 재 클로닝을 수행하였으며, IPTG 유도를 통해 25℃에서 soluble form의 재조합단백질(rPoGCSF)이 생산되는 것을 확인할 수 있었다([Fig. 2]). 특히, E.
- Molecular adjuvant로 이용될 rPoGCSF의 pH 조건에 따른 활성 변화 조사는 rPoGCSF (100μg/mL)를 pH 2, 4, 6, 8, 10, 12에서 24시간 노출시킨 후 실험에 사용하였다.
- Molecular adjuvant로 이용될 rPoGCSF의 온도별 조건에 따른 활성 변화 조사를 수행하기 위하여 rPoGCSF (100μg/mL)를 10, 20, 25, 30, 35 및 42℃에서 24시간 노출시킨 후 실험에 사용하였다.
- rPoGCSF를 10, 20, 25, 30, 35, 42℃에서 24시간 처리 후 넙치 백혈구를 자극하여 IL-1β와 TNF 발현량을 조사하였다.
- 각 유전자들의 ORF를 증폭시키기 위해 5‘에는 EcoR I과 3’에는 Xho I 효소가 인식하는 염기를 추가하여 primer를 제작하였다([Table 1]).
- 각 조건에서 노출된 rPoGCSF는 pH조건별 자극과 같은 방법으로, 넙치 백혈구와 1시간, 3시간, 12시간, 24시간 반응시킨 후 quantitative real-time PCR법을 이용하여 IL-1β와 TNF의 발현량을 조사하였다.
- 각 조건에서 노출된 rPoGCSF를 넙치 백혈구와 1시간, 3시간, 12시간, 24시간 반응시킨 후 quantitative real-time PCR법을 이용하여 면역관련 유전자인 IL-1β와 TNF의 발현량을 조사하였다.
- 자극한 백혈구로부터 RNA purificationkit (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 total RNA를 분리하였으며, cDNA를 합성하기 위하여, 추출한 total RNA는 Recombinant DNase I-RNase free kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 DNase를 처리하였다. 그 후, cDNA synthesis kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA)를 사용하여 DNase를 처리한 total RNA를 cDNA로 합성시켰다.
- 넙치 두신에서 percoll(Sigma-Aldrich Co., USA)을 이용하여 넙치 두신으로부터 백혈구를 분리한 후 넙치 재조합단백질(rPoGCSF)을 10, 1, 0.1 μg/mL의 농도로 첨가하여, 1, 3, 6, 12, 24시간 자극하였다.
- 넙치의 면역관련 유전자로는 G-CSF, TNF-α, NKEF, TLR2, TLR3, IL-1β, IL-6를 선정하였으며, 이들의 specific primer들을 이용하여 rPoGSCF의 농도별/시간별 자극에 따른 발현 변화를 확인하였다.
- 4가지의 넙치 면역관련 유전자 재조합단백질 제작 후보군 중에서 G-CSF를 선정하여 fusion partner로 MBP (Maltose binding protein, 40 kDa)를 G-CSF의 N-말단에 붙여서 cloning 하였고 상술한대로 IPTG를 첨가하여 재조합단백질의 발현을 유도하였다. 발현이 유도된 G-CSF 재조합단백질은 MBP affinity resin을 이용하여 정제하였다.
- 제작된 재조합단백질들을 이용하여 넙치의 백혈구를 자극하여 면역능 유도를 조사하였다. 뿐만 아니라, pH 및 온도에 따른 재조합단백질의 안정성을 조사하였다.
- 시간별 자극에 대한 넙치 면역관련 유전자들의 발현 정도를 알아보기 위해, 합성된 cDNA template 1 μl와 forward primer, reverse primer 각각 1 μl씩, SYBR Green I (TaKaRa, Japan) 12.5μl, PCR grade water 9.5 μl를 혼합하여 totalvolume 25 μl이 되도록 한 후 Thermal Cycler DICE Real-Time System (Takara)을 이용하여 quantitative real-time PCR을 수행하였다.
- 1 μg/mL의 농도로 첨가하여, 1, 3, 6, 12, 24시간 자극하였다. 자극한 백혈구로부터 RNA purificationkit (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 total RNA를 분리하였으며, cDNA를 합성하기 위하여, 추출한 total RNA는 Recombinant DNase I-RNase free kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 DNase를 처리하였다. 그 후, cDNA synthesis kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA)를 사용하여 DNase를 처리한 total RNA를 cDNA로 합성시켰다.
- 각 유전자들의 ORF를 증폭시키기 위해 5‘에는 EcoR I과 3’에는 Xho I 효소가 인식하는 염기를 추가하여 primer를 제작하였다([Table 1]). 제작된 primer를 이용하여 PCR로 증폭시킨 후 gel extraction을 통하여 각 면역유전자들을 추출한 뒤 pET 22b vector에 cloning을 하였다. Cloning 이후 각 유전자의 삽입 여부와 amino acid의 서열에 mutation 여부를 sequencing을 통해 확인한 후에 각각의 넙치 면역유전자들이 삽입된 pET 22b vector를 E.
- 본 연구에서는 어류에서 기존의 aluminum hydroxide gel 혹은 mineral oil emulsion adjuvant 보다 더욱 효과적이고, 효율적이며 생체 내에서 부작용이 없는 안전한 molecular adjuvant의 개발을 위하여 넙치로부터 유용한 면역관련 분자들을 클로닝 하였고, 이들로부터 재조합단백질을 제작하였다. 제작된 재조합단백질들을 이용하여 넙치의 백혈구를 자극하여 면역능 유도를 조사하였다. 뿐만 아니라, pH 및 온도에 따른 재조합단백질의 안정성을 조사하였다.
대상 데이터
- 넙치로부터 molecular adjuvant를 제작하기 위하여 넙치 면역관련 후보 유전자로는 TNF-α, G-CSF, IL-1β, CD40를 선정하였으며, 이들의 유전자의 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank database에 이미 등록되어 있는 유전자들을 선정하여 이번 연구에 이용하였다.
데이터처리
- 결과의 통계 처리는 ANOVA-test를 실시하여 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 평균간의 유의성을 SPSS Version 10 (SPSS, Michigan Avenue, Chicago, IL, USA, 1997) program을 사용하여 95 %수준에서 검정하였다.
성능/효과
- IL-1β 발현량은 pH 조건별로 차이가 보이지 않았으나, 처리시간이 길어질수록 증가하여 24시간째 모든 실험구가 대조구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다.
- IL-1β 발현량은 처리 24시간째 모든 실험구에서 대조구에 비하여 유의적으로 높은 값을 나타내었으며, 특히 20℃와 25℃ 실험구는 다른 온도구의 24시간째 발현량에 비하여 유의적으로 높은 발현을 나타내었다(p<0.05, [Fig. 5A]).
- IL-1β와 TNF의 발현량은 자극 시간별로 차이는 있었으나, 조사한 모든 pH 조건에서 자극하지 않은 대조구에 비하여 높은 발현량을 보여 넓은 pH 범위에서 안정하였다.
- IL-1β와 TNF의 발현량은 자극 시간별로 차이는 있었으나, 조사한 모든 온도조건에서 자극하지 않은 대조구에 비하여 높은 발현량을 보여 온도에 안정하여 넙치 사육 수온 및 백신 접종 시기인 20～25℃에서 가장 높은 활성을 나타내므로 adjuvant로 사용 시 효능이 높을 것으로 판단되었다.
- TNF 발현량은 모든 실험구에서 처리 12시간까지는 대조구와 유사한 경향을 나타내었으나 24시간째는 대조구에 비하여 유의적으로 높은 발현을 나타내었다. 특히 25℃ 실험구는 다른 실험구의 24 시간째 발현량에 비하여 유의적으로 높은 발현을 나타내었다(p<0.
- IL-1β 발현량은 pH 조건별로 차이가 보이지 않았으나, 처리시간이 길어질수록 증가하여 24시간째 모든 실험구가 대조구에 비하여 유의적으로 높게 나타났다. pH 6과 pH 10 실험구에서 처리 24시간째 대조구의 각각 32.3배와 32.7배로 가장 높은 발현량을 나타내었다([Fig. 4A]). 넙치 백혈구의 TNF 발현량은 자극 3시간까지는 대조구와 유사한 발현량을 나타내었으나, 12시간째 다소 높은 발현량을 나타내었다.
- ① G-CSF: 1 ㎍/㎖, 12시간에 가장 높은 발현량을 나타내었으며, 10, 1, 0.1 ㎍/㎖의 농도별 자극에 대해 농도가 높을수록 발현량이 높아지는 경향을 나타내어 G-CSF 재조합 단백질의 활성에 의해 G-CSF 유전자의 발현량이 증가한 것으로 판단된다. ([Fig.
- ② TNF-α: 시간이 경과함에 따라 발현량이 증가하는 경향을 보였으며, 1, 0.1 ㎍/㎖의 농도별 자극에 대해 발현량이 높아지는 경향을 나타내었다 ([Fig. 3B]).
- ⑥ IL-6: 자극 6시간 까지는 10, 1, 0.1 ㎍/㎖의 농도별 자극에 대해 농도가 높을수록 발현량이 높아지는 경향을 나타내었으며, 12시간째에 가장 높은 발현을 보였다.([Fig.
- ⑦ NKEF: 시간이 경과함에 따라 발현량이 증가하는 경향을 보였으며, 10, 1, 0.1 ㎍/㎖의 농도별 자극에 대해 농도가 높을수록 발현량이 높아지는 경향을 나타내어 G-CSF 재조합 단백질에 의해 NKEF 유전자의 발현량이 증가한 것으로 판단된다([Fig. 3G]).
- IL-1β와 TNF의 발현량은 자극 시간별로 차이는 있었으나, 조사한 모든 pH 조건에서 자극하지 않은 대조구에 비하여 높은 발현량을 보여 넓은 pH 범위에서 안정하였다. 넙치 체액의 pH를 고려 시 adjuvant로서 높은 활성을 나타낼 수 있으며, 산성에서도 안정하므로 경구백신의 adjuvant로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 자극 24시간째 모든 온도에서 대조구에 비하여 유의적으로 높은 발현량을 나타내었다(p<0.05, [Fig. 4B]).
- 하지만 SDS-PAGE 분석 결과, TNF-α (약 26 kDa), CD40 (약 33 kDa), IL-1β (약 30 kDa)와 G-CSF (약 25 kDa)는 pellet에서만 발현이 확인되어 모든 재조합단백질은 insoluble form으로 발현이 되었다([Fig. 1]).
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