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문제 정의
- 본 연구는 단순히 버려지는 커피 폐기물을 극성을 달리하는 용매(methylene chloride, ethyl acetate, methanol)를 사용하여 추출하였고, 추출물들을 농축하여 용매별 폴리페놀 함량 측정과 항산화성(전자공여성) 및 GST 활성저해능 실험을 통하여 이들에 영향을 주는 물질을 먼저 확인함으로써 향후 커피 폐기물을 재활용할 수 있는 기초 자료로 제공하고, 최종적으로는 이들 성분의 분리와 구조를 규명함으로써 기능성 식품이나 화장품의 원료로 재활용하는데 목적이 있다.
제안 방법
- 총 폴리페놀 함량의 산출은 표준물질로 gallic acid를 사용하여 표준 검량선을 구하였고, 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalents(GAE μg/mL extract)로 환산하였다.
- Vortex Mixer는 Thermolyne(Iowa, USA)사의 Type 37600 Mixer를 이용하였다. pH meter기는 Istek(Seoul, Korea)의 p25를 사용하였고, 기질과의 특성조사를 위해서 Hitachi사(Tokyo, Japan) U-2000 UV/VIS Spectrophotometer를 이용하였다.
- 시중의 S사에서 수거한 커피 폐기물은 전 처리 없이 100g 정량하여 500 mL 삼각플라스크에 넣고 300 mL methylene chloride를 부은 후에 상온에서 24시간 정치하였다. 여과를 통하여 여과액과 찌꺼기를 분리하였고, 여과 후 남은 찌꺼기는 다시 300 mL methylene chloride를 가하여 동일한 방법으로 추출을 하는 방법으로 총 3회에 걸쳐서 추출을 하였다. 여과한 용액은 합하여 감압하에 로터리 농축기에서 농축하였고, 농축액은 더 이상의 정제과정 없이 실험에 사용하였다.
- 여과한 용액은 합하여 감압하에 로터리 농축기에서 농축하였고, 농축액은 더 이상의 정제과정 없이 실험에 사용하였다. 위와 같은 방법으로 ethyl acetate와 methanol을 사용하여 추출한 다음에 농축하였고, 농축액은 총 폴리페놀 함량 측정, 전자공여능 측정, glutathion S-transferase 활성 저해능 측정 실험에 사용하였다.
- 1 mL를 첨가하여 혼합한 후, 37℃의 항온조에서 30 min 동안 반응시켰다. 추출물의 전자공여능은 UV spectrophotometer를 사용하였으며, 517 nm에서 흡광도를 측정하였고, 전자공여능(%)은 다음 식에 의하여 구하였다.
- 위와 동일한 조건의 혼합물에 커피 찌꺼기에서 추출 · 농축한 20 μL 시료를 혼합하여 강하게 저어준 다음에 동일한 방법으로 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하여 기본 포합반응의 흡광도와 비교하여 커피 찌꺼기에서의 추출물이 GST 활성 저해제로서 상관관계를 규명하려고 하였다.
- 잘 혼합된 용액에 20 μL의 50 mM CDNB를 넣고 강하게 혼합시킨 후에 340 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하였고, 이를 기본 포합반응으로 하였다.
- 바이오메스의 일종인 커피 폐기물에서 용매를 달리하여 추출을 하였고, 추출물들의 총 폴리페놀 함량, 전자공여능 측정 그리고 glutathione S-transferase의 활성 저해능 실험을 하였다.
대상 데이터
- (Tokyo, Japan) 제품을, sodium chloride는 Duksan Pure Chemical Co. (Kyônggi, Korea) 제품을, potassium chloride는 Daejung(Incheon, Korea) 제품을 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 커피 폐기물은 경기도 분당에 소재지를 둔 전국 규모의 S 커피 체인점에서 무료로 제공하는 것을 가져다가 전처리 과정 없이 곧바로 사용하였다.
- 글루타티온 전달 효소의 기질로 사용된 1-chloro-2,4-dinitro-benzene(CDNB), 1,2-dichloro-4-nitrobenzene(DCNB), 1,2-epoxy-3- (р-nitrophenoxy)propane(EPNP), ethacrynic acid(ETA), cumene hydroperoxide(CP), 4-nitrophenethyl bromide(4-NPB), glutathione 저해제로 사용된 S-hexyl-GSH, hematin은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. Potassium phosphate(mono-basic), potassium phosphate(dibasic)은 Kanto Chemical Co.
- Vortex Mixer는 Thermolyne(Iowa, USA)사의 Type 37600 Mixer를 이용하였다. pH meter기는 Istek(Seoul, Korea)의 p25를 사용하였고, 기질과의 특성조사를 위해서 Hitachi사(Tokyo, Japan) U-2000 UV/VIS Spectrophotometer를 이용하였다.
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu법(Singleton & Rossi 1965)에 따라 측정하였다. 커피 폐기물에서 ethyl acetate로 추출한 시료는 100배, methylene chloride와 methanol로 추출한 시료는 50배로 각각 추출에 사용한 용매로 희석하여 실험에 사용하였다. 이 희석액 0.
- 포합 반응에 대한 초기 반응속도 측정에는 1,2-dichloro-4-nitrobenzene(DCNB)를 사용하였다. 효소 활성 단위는 1분당 1 μmol의 생성물을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 Statistical Package for the Social Science Program(SPSS, version 21)을 사용하여 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였고, 실험군 간의 유의성은 Duncan multiple range test로 p<0.05 수준에서 실시하였으며, 실험 분석은 3회 반복해서 실행한 평균±표준편차로 분석하였다.
이론/모형
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu법(Singleton & Rossi 1965)에 따라 측정하였다.
- DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)의 free radical에 대한 추출 시료의 전자공여능 측정은 Kang 등(2001)의 방법을 이용하여 측정하였다. 95% 에탄올에 용해시킨 0.
- 효소의 최적 pH와 최적 온도는 각각 9.0과 55℃인 것으로 나타났고(Cho & Kong 2005), glutathione S-transferase 효소 활성 저해와 관련한 실험 조건은 Cho HY(2007)가 밝힌 기질 농도의 영향, pH 영향, 온도의 영향 등을 참조하였다.
성능/효과
- 용매에 따른 총 폴리페놀 함량은 통계학적으로 유의적인 관계가 있음을 보였다(p<0.05).
- Table 2에서 보는 바와 같이, 총 폴리페놀 함량은 ethyl acetate에서 가장 높은 함량인 3,060.61±357.12 μg GAE/mL로 나타났고, methylene chloride에서는 가장 낮은 909.09±35.71 μg GAE/mL, 그리고 극성이 가장 큰 메탄올에서는 1,602.27±30.36 μg GAE/mL를 나타내었다.
- 유기 용매별 glutathione S-transferase의 활성 저해능은 통계학적으로 유의한 차이가 있음을 보였다(p<0.05).
- 3. Ethyl acetate 추출물의 glutathione S-transferase의 활성 저해능 92.12±0.56%, methylene chloride의 추출물은 88.48±0.25% 그리고 methanol 추출물에서는 90.85±0.14%를 나타내었다.
- 각 용매에 따른 전자공여능은 통계학적으로 유의한 차이를 나타내고 있으며(p<0.05), methanol 추출물의 전자공여능이 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 aethyl acetate 추출물보다 더 높은 전자공여능을 나타난 것으로 보아서 폴리페놀류와 전자공여능과는 큰 연계성이 없는 것으로 사료되었다.
- 2. Ethyl acetate 추출물의 전자공여능은 80.20±1.45%, methy-lene chloride의 추출물은 81.94±0.45% 그리고 methanol 추출물에서는 85.14±1.53%를 나타내었다.
- 용매에 따른 총 폴리페놀 함량은 p<0.05에서 통계학적으로 유의적인 관계가 있음을 보였다.
- 1. 총 폴리페놀 함량은 ethyl acetate에서 가장 높은 함량인 3,060.61±357.12 μg GAE/mL로 나타났고, methylene chloride에서는 가장 낮은 909.09±35.71 μg GAE/mL 그리고 극성이 가장 큰 메탄올에서는 1,602.27±30.36 μg GAE/mL를 나타내었다.
- 05). 총 폴리페놀 함량 측정의 결과와 유사하게 ethyl acetate 추출물에서 glutathione S-transferase의 활성 저해능이 가장 높게 나타났고, methylene chloride에서 가장 낮은 저해능을 보였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량과 glutathione S-transferase의 활성 저해능과의 상관성에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
- 1) Inhibition effect was %.
- 각 용매에 따른 전자공여능은 통계학적으로 유의한 차이를 나타내고 있으며(p<0.05), methanol 추출물의 전자공여능이 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 aethyl acetate 추출물보다 더 높은 전자공여능을 나타낸 것으로 보아서 폴리페놀류와 전자공여능과는 큰 연계성이 없는 것으로 나타났다.
후속연구
- 05), methanol 추출물의 전자공여능이 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 aethyl acetate 추출물보다 더 높은 전자공여능을 나타낸 것으로 보아서 폴리페놀류와 전자공여능과는 큰 연계성이 없는 것으로 나타났다. 그리고 모든 용매의 추출물에서 80% 이상의 전자공여능이 있는 것으로 나타나, 항산화제와 연계한 단일 물질로의 분리와 구조 규명 등이 필요하다고 사료된다.
- 총 폴리페놀 함량 측정의 결과와 유사하게 ethyl acetate 추출물에서 glutathione S-transferase의 활성 저해능이 가장 높게 나타났고, methylene chloride에서 가장 낮은 저해능을 보였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량과 glutathione S-transferase의 활성 저해능과의 상관성에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 모든 용매의 추출물에서 80% 이상의 전자공여능이 있음을 보여 glutathione S-transferase의 활성 저해능과 연계한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 추출물의 총 폴리페놀 함량과 glutathione S-transferase의 활성 저해능과의 상관성에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 모든 용매의 추출물에서 80% 이상의 전자공여능이 있음을 보여 glutathione S-transferase의 활성 저해능과 연계한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 05), methanol 추출물의 전자공여능이 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 aethyl acetate 추출물보다 더 높은 전자공여능을 나타난 것으로 보아서 폴리페놀류와 전자공여능과는 큰 연계성이 없는 것으로 사료되었다. 모든 용매의 추출물에서 80% 이상의 전자공여능이 있음을 보여 항산화제와 연계한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 05). 총 폴리페놀 함량 측정의 결과와 유사하게 ethyl acetate 추출물에서 glutathione S-transferase의 활성 저해능이 가장 높게 나타났고, methylene chloride에서 가장 낮은 저해능을 보여, 추출물의 총 폴리페놀 함량과 glutathione S-transferase의 활성 저해능과의 상관성에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 모든 용매의 추출물에서 80% 이상의 전자공여능이 있음을 보여 glutathione S-transferase의 활성 저해능과 연계한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 커피 폐기물에서 여러 용매를 이용한 추출물은 총 폴리페놀과 전자공여능 그리고 glutathione S-transferase의 활성 저해능에서 효능이 있는 것으로 사료되어 폐기물을 활용한 항산화제라든가 생리 활성에 관계하는 효소들과의 유의성 검증과 이러한 효능을 주는 물질들의 분리 및 구조 규명이 필요하다고 사료된다.
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