생물전환에 의한 발효 고려엉겅퀴 Pectolinarin 및 Pectolinarigenin의 분석법 개발 및 검증 Development and Validation of Analytical Method for Pectolinarin and Pectolinarigenin in Fermented Cirsium setidens Nakai by Bioconversion원문보기
생물전환에 의한 고려엉겅퀴 pectolinarin의 pectolinarigenin 전환 시 지표성분의 함량 및 표준화를 위한 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증 결과 HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 retention time과 발효 고려엉겅퀴 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검량선은 상관계수 값이 모두 1로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검출한계는 각각 $4.25{\mu}g/mL$, $2.46{\mu}g/mL$였고, 정량한계는 $12.88{\mu}g/mL$, $7.46{\mu}g/mL$로 나타났다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 함량을 확인한 결과 고려엉겅퀴 0시간, 5시간 발효물에서는 pectolinarin만 관찰되었으며, 19시간 발효물에서 생물전환에 의해 pectolinarin이 pectolinarigenin으로 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 그 이후 28시간부터 72시간까지의 고려엉겅퀴 발효물에서는 pectolinarigenin만 관찰할 수 있었다. 정밀도 측정 결과 pectolinarin 및 pectolinarigenin은 일간 정밀도에서 각각 0.9%, 0.5%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 각각 0.5%, 0.2%로 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 pectolinarin은 99.7~104.0%, pectolinarigenin은 99.7~102.4% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 본 연구 결과 고려엉겅퀴의 지표성분인 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 HPLC를 이용한 동시분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
생물전환에 의한 고려엉겅퀴 pectolinarin의 pectolinarigenin 전환 시 지표성분의 함량 및 표준화를 위한 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증 결과 HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 retention time과 발효 고려엉겅퀴 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검량선은 상관계수 값이 모두 1로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검출한계는 각각 $4.25{\mu}g/mL$, $2.46{\mu}g/mL$였고, 정량한계는 $12.88{\mu}g/mL$, $7.46{\mu}g/mL$로 나타났다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 함량을 확인한 결과 고려엉겅퀴 0시간, 5시간 발효물에서는 pectolinarin만 관찰되었으며, 19시간 발효물에서 생물전환에 의해 pectolinarin이 pectolinarigenin으로 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 그 이후 28시간부터 72시간까지의 고려엉겅퀴 발효물에서는 pectolinarigenin만 관찰할 수 있었다. 정밀도 측정 결과 pectolinarin 및 pectolinarigenin은 일간 정밀도에서 각각 0.9%, 0.5%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 각각 0.5%, 0.2%로 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 pectolinarin은 99.7~104.0%, pectolinarigenin은 99.7~102.4% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 본 연구 결과 고려엉겅퀴의 지표성분인 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 HPLC를 이용한 동시분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
The aim of this study was to investigate a validation method for determination of pectolinarin and pectolinarigenin in fermented Cirsium setidens Nakai. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, detection limits, and quantification limits of pectolinarin and pectolinarigenin w...
The aim of this study was to investigate a validation method for determination of pectolinarin and pectolinarigenin in fermented Cirsium setidens Nakai. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, detection limits, and quantification limits of pectolinarin and pectolinarigenin were measured by HPLC. The results show that the detection limits of pectolinarin and pectolinarigenin were $4.25{\mu}g/mL$ and $2.46{\mu}g/mL$, respectively. The recovery rates of pectolinarin and pectolinarigenin were high in the ranges of 99.7~104.0% and 99.7~102.4%, respectively. Inter-day and intra-day precisions of pectolinarin and pectolinarigenin in fermented Cirsium setidens Nakai were 0.9%, 0.5% and 0.5%, 0.2%, respectively. Therefore, application of pectolinarin and pectolinarigenin was validated by an analytical method as a marker compound in Cirsium setidens Nakai.
The aim of this study was to investigate a validation method for determination of pectolinarin and pectolinarigenin in fermented Cirsium setidens Nakai. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, detection limits, and quantification limits of pectolinarin and pectolinarigenin were measured by HPLC. The results show that the detection limits of pectolinarin and pectolinarigenin were $4.25{\mu}g/mL$ and $2.46{\mu}g/mL$, respectively. The recovery rates of pectolinarin and pectolinarigenin were high in the ranges of 99.7~104.0% and 99.7~102.4%, respectively. Inter-day and intra-day precisions of pectolinarin and pectolinarigenin in fermented Cirsium setidens Nakai were 0.9%, 0.5% and 0.5%, 0.2%, respectively. Therefore, application of pectolinarin and pectolinarigenin was validated by an analytical method as a marker compound in Cirsium setidens Nakai.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 생물전환을 통한 발효 고려엉겅퀴를 건강기능식품 원료로 개발 시 원료의 표준화를 위하여 고려엉겅퀴 지표성분인 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 분석방법 및 분석법 검증에 대한 연구를 실시하였다.
제안 방법
HPLC를 이용한 분석방법은 추출방법에 따라 추출한 발효 고려엉겅퀴 추출물을 일간(inter-day)과 일내(intra-day)로 나누어 정밀도 실험을 실시하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고 intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간마다 3회 9반복하여 HPLC로 분석하였다.
HPLC를 이용한 분석방법은 추출방법에 따라 추출한 발효 고려엉겅퀴 추출물을 일간(inter-day)과 일내(intra-day)로 나누어 정밀도 실험을 실시하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고 intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간마다 3회 9반복하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 각각의 정량한 값은 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 백분율로 나타내었다.
추출방법에 따른 수율은 고려엉겅퀴 0, 5, 19, 28, 52, 72시간 발효물에서 5시간 발효물은 6%, 그 외 0, 19, 28, 52, 72시간 발효물은 10%로 나타났다. Pectolinarin과 pectolinarigenin의 HPLC 분석은 Kim 등(28)의 방법을 변형하여 실시하였으며 서로 다른 두 개의 표준물질을 동시분석 하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co.
건조 고려엉겅퀴에 효소처리 및 멸균공정을 거친 후 배양배지화한 액상 고려엉겅퀴에 표고 균사를 접종하여, 표고 균사에 의한 생물전환 발효공정을 통해 고려엉겅퀴 발효물을 생산한 후 2차 생물전환 공정의 효소처리 공정을 수행하였다. 발효미생물로 선정한 표고 균사의 접종량 및 배양시간을 최적화하기 위하여 종균배양에서의 growth curve fitting을 통해 각 발효미생물의 배양상태를 확인하고 growth curve에서 cell mass 농도에 따라 3 point를 선정하였으며, 접종량이 각각 10%, 20%가 되도록 본 발효배양에 접종한 후 배양시간 및 접종량을 비교하여 최적화를 진행하였다.
농도를 알고 있는 발효 고려엉겅퀴 추출물에 표준용액 pectolinarin 31.25, 62.5, 125 μg/mL와 pectolinarigenin 15.625, 31.25, 62.5 μg/mL의 세 가지 농도를 각각 첨가하여 HPLC로 분석하였다.
정확성은 회수율을 측정하여 나타내었다. 농도를 알고 있는 발효 고려엉겅퀴 추출물에 표준용액을 각각 3가지 농도로 첨가한 뒤 HPLC로 분석하여 검출되는 농도를 측정하였다. Table 4와 같이 pectolinarin은 첨가된 농도 31.
1). 따라서 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 최대흡수파장을 340 nm로 하여 분석하였다. Jeong 등(32)에 의하면 pectolinarin 및 pectolinarigenin을 332 nm에서 분석하였다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
발효 고려엉겅퀴 추출물을 정해진 조건에서 분석하였을 때 측정 결과 값 사이의 근접성을 확인하여 정밀성을 분석하였다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin은 Table 2와 같이 일간 정밀도에서 각각 0.
발효 고려엉겅퀴에 함유된 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 분석을 위한 시료의 전처리는 Kim 등(30)의 방법을 변형하여 제조하였다. 고려엉겅퀴 시간별 발효물 시료 5 g을 추출용기에 넣고 80% ethanol 150 mL를 사용하여 70°C 조건에서 3시간 환류추출 하였다.
건조 고려엉겅퀴에 효소처리 및 멸균공정을 거친 후 배양배지화한 액상 고려엉겅퀴에 표고 균사를 접종하여, 표고 균사에 의한 생물전환 발효공정을 통해 고려엉겅퀴 발효물을 생산한 후 2차 생물전환 공정의 효소처리 공정을 수행하였다. 발효미생물로 선정한 표고 균사의 접종량 및 배양시간을 최적화하기 위하여 종균배양에서의 growth curve fitting을 통해 각 발효미생물의 배양상태를 확인하고 growth curve에서 cell mass 농도에 따라 3 point를 선정하였으며, 접종량이 각각 10%, 20%가 되도록 본 발효배양에 접종한 후 배양시간 및 접종량을 비교하여 최적화를 진행하였다.
5 μg/mL의 세 가지 농도를 각각 첨가하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 결과를 다음 식을 이용하여 회수율(recovery)로 나타내어 HPLC 분석방법의 정확성을 확인하였다.
사용된 효소는 0.1~0.2%, 1~2%로 첨가하여 50~60°C 조건에서 1~3시간 동안 shaking(250 rpm) 하여 효소/기질반응을 수행하였다.
생물전환에 의한 고려엉겅퀴 pectolinarin의 pectolinarigenin 전환 시 지표성분의 함량 및 표준화를 위한 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증 결과 HPLC를 이용한 분석 방법에서 표준용액의 retention time과 발효 고려엉겅퀴 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다.
표준물질 pectolinarin, pectolinarigenin 및 발효 고려엉겅퀴 추출물을 HPLC로 분석한 뒤 chromatogram을 비교하여 pectolinarin 및 pectolinarigenin이 선택적으로 분리가 되는지 확인하였으며 PDA(photo diode array) spectrum을 이용하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.
표준물질 pectolinarin의 농도는 31.25, 62.5, 125, 250, 500 µg/mL, pectolinarigenin의 농도는 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250 μg/mL로 제조하여 HPLC를 이용, 3회 반복 측정하였으며, chromatogram에 대한 면적과 농도비의 관계를 표시하는 검량선을 작성하고 작성한 검량선의 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
효소처리 생물전환공정 최적화를 위해 배양산물인 배양균사체의 세포벽을 구성하고 있는 성분 중 유용물질을 세포벽으로부터 효율적으로 추출하고자 cellulase, hemi-cellulase, pectinase, β-glucanase, β-glucosidase, lysozyme 등 다양한 세포벽 분해효소를 사용하여 공정 최적화 실험을 수행하였다.
대상 데이터
0%) pectolinarin은 Carbosynth(Compton, UK)에서 구입하였으며, pectolinarigenin은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.(Chengdu, China)에서 구입하였다. 용매로 사용한 acetonitrile은 J.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
고려엉겅퀴 생물전환산물의 회수는 추출 및 제제화 작업 후 동결건조 하여 분말을 수득하고 실험에 사용하였다.
본 실험에서 사용한 고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 강원도 정선에서 2014년에 재배한 것을 사용하였다. 표준물질(purity≥98.
Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고 intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간마다 3회 9반복하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 각각의 정량한 값은 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 백분율로 나타내었다.
이론/모형
HPLC를 이용한 분석방법은 ICH(International Conference for Harmonization) 가이드라인(31)을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(detection limit, DL) 및 정량 한계(quantitation limit, QL)를 이용하여 과학적으로 분석법의 유효성을 확인하였다.
성능/효과
발효 고려엉겅퀴 추출물을 정해진 조건에서 분석하였을 때 측정 결과 값 사이의 근접성을 확인하여 정밀성을 분석하였다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin은 Table 2와 같이 일간 정밀도에서 각각 0.9%, 0.5%를 나타내었으며 일내 정밀도에서는 0.5%, 0.2%로 5% 이하의 우수한 정밀도를 나타내었다. 고려엉겅퀴 발효시간에 따른 pectolinarin 및 pectolinarigenin 함량의 변화를 확인한 결과 발효 전 pectolinarin의 함량이 116.
분석법 검증 결과 HPLC를 이용한 분석 방법에서 표준용액의 retention time과 발효 고려엉겅퀴 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검량선은 상관계수 값이 모두 1로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검출한계는 각각 4.
46μg/mL로 나타났다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 함량을 확인한 결과 고려엉겅퀴 0시간, 5시간 발효물에서는 pectolinarin만 관찰되었으며, 19시간 발효물에서 생물전환에 의해 pectolinarin이 pectolinarigenin으로 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 그 이후 28시간부터 72시간까지의 고려엉겅퀴 발효물에서는 pectolinarigenin만 관찰할 수 있었다.
Pectolinarin 표준용액 31.25, 62.5, 125, 250, 500 µg/ mL와 pectolinarigenin 표준용액을 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250 µg/mL로 희석하여 HPLC로 분석한 결과 표준검량선이 pectolinarin 및 pectolinarigenin 각각 y=22270x +23949와 y=43835x+4251.7로 나타났으며 상관계수(R2)값이 pectolinarin과 pectolinarigenin 모두 우수한 직선성을 보였다(Fig. 3).
생물전환을 통한 고려엉겅퀴 pectolinarin의 pectolinarigenin 전환으로 두 성분을 동시에 분석할 수 있는 동시분석 조건이 요구된다. Spectrophotometer를 사용하여 200 nm 부터 400 nm까지의 흡수파장을 분석한 결과 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 최대흡수파장이 같은 것으로 나타났다(Fig. 1). 따라서 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 최대흡수파장을 340 nm로 하여 분석하였다.
검출한계와 정량한계는 ICH 가이드라인에 근거하여 분석한 결과 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검출한계는 각각 4.25 μg/mL, 2.46 μg/mL로 측정되었으며, 정량한계는 pectolinarin 및 pectolinarigenin 각각 12.88 μg/mL, 7.46 μg/mL로 나타났다.
2%로 5% 이하의 우수한 정밀도를 나타내었다. 고려엉겅퀴 발효시간에 따른 pectolinarin 및 pectolinarigenin 함량의 변화를 확인한 결과 발효 전 pectolinarin의 함량이 116.64 mg/g에서 발효 초기 5시간까지는 변화가 없는 것으로 나타났다(Table 3). 그러나 19시간 발효물에서 pectolinarin 함량이 46.
64 mg/g에서 발효 초기 5시간까지는 변화가 없는 것으로 나타났다(Table 3). 그러나 19시간 발효물에서 pectolinarin 함량이 46.89 mg/g으로 감소하고 pectolinarigenin 함량이 31.18 mg/g으로 증가하였으며, 28시간 발효 이후부터는 pectolinarin이 사라지고 pectolinarigenin 함량이 52.86 mg/g으로 증가한 후 72시간까지 그 수준을 유지하는 것으로 나타나 발효가 진행될수록 pectolinarin이 pectolinarigenin으로 전환되는 것을 확인할 수 있었다.
2%로 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 pectolinarin은 99.7~104.0%, pectolinarigenin은 99.7~102.4% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 본 연구 결과 고려엉겅퀴의 지표성분인 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 HPLC를 이용한 동시분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
4% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. 본 연구 결과 고려엉겅퀴의 지표성분인 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 HPLC를 이용한 동시분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
생물전환에 의한 고려엉겅퀴 pectolinarin의 pectolinarigenin 전환 시 지표성분의 함량 및 표준화를 위한 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증 결과 HPLC를 이용한 분석 방법에서 표준용액의 retention time과 발효 고려엉겅퀴 추출물의 retention time이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Pectolinarin 및 pectolinarigenin의 검량선은 상관계수 값이 모두 1로 나타나 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다.
25 μg/mL로 설정하였다. 이상의 결과를 볼 때 고려엉겅퀴의 pectolinarin 및 pectolinarigenin은 HPLC를 이용하여 동시분석이 가능하며 정량분석이 가능한 것으로 나타났다. 이들 성분들을 고려엉겅퀴의 지표성분으로 선정 시 분석법 검증을 통하여 이들 원료의 표준화가 가능할 것으로 사료된다.
그 이후 28시간부터 72시간까지의 고려엉겅퀴 발효물에서는 pectolinarigenin만 관찰할 수 있었다. 정밀도 측정 결과 pectolinarin 및 pectolinarigenin은 일간 정밀도에서 각각 0.9%, 0.5%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 각각 0.5%, 0.2%로 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 pectolinarin은 99.
특이성은 불순물, 분해물, 추출물 등이 혼합된 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 의미하며 다른 물질의 간섭 없이 분리될 수 있는 것으로 특이성을 확인하게 된다. 표준용액과 발효 고려엉겅퀴를 추출한 용액의 chromatogram을 비교하여 pectolinarin과 pectolinarigenin peak를 확인한 결과 Fig. 2와 같이 다른 물질의 간섭 없이 분리되었으며 표준용액의 retention time (RT)과 추출물의 RT 값이 일치하였으며 표준용액과 발효 고려엉겅퀴 추출물의 PDA spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다 (Fig. 1).
후속연구
이상의 결과를 볼 때 고려엉겅퀴의 pectolinarin 및 pectolinarigenin은 HPLC를 이용하여 동시분석이 가능하며 정량분석이 가능한 것으로 나타났다. 이들 성분들을 고려엉겅퀴의 지표성분으로 선정 시 분석법 검증을 통하여 이들 원료의 표준화가 가능할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
고려엉겅퀴는 무엇인가?
고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 국화과(Cirsium)에 속하는 다년생 야생 초본으로서 한국의 강원도 산지에 자생하며, 민간에서는 곤드레라고 불리기도 한다. 국내에 자생하는 Cirsium 속 엉겅퀴에는 엉겅퀴(Cirsium japonicum), 큰엉겅퀴(Cirsium pendulum), 고려엉겅퀴(C.
한방에서 고려엉겅퀴는 어떤 질환 치료에 이용해 왔는가?
setidens), 바늘엉겅퀴(Cirsium rhinoceros), 도깨비엉겅퀴(Cirsium schantarense), 버들잎엉겅퀴(Cirsium lineare), 흰잎엉겅퀴(Cirsium vlassovianum), 물엉겅퀴(Cirsium nipponicum) 등 8종이 있으며(1), 항산화 성분인 페놀성 화합물을 포함하고 있고(2-6) 간 보호 작용(3,4), 알코올 유도 지질의 산화 예방(5), 알코올성 간경화 보호 효과(6) 등의 생리활성이 보고되고 있다. 고려엉겅퀴는 5월경에 채취하여 식용으로 사용되고 있으며(7), 한방에서 지상부 또는 지하부를 대계라 하여 경혈, 지혈, 소종의 효능으로 토혈, 혈뇨, 대하, 간염 및 고혈압 등의 치료에 약용으로 이용해 왔다(8-10).
미생물로 원하는 산물을 제조하는 기술인 생물전환기술은 어떤 방법으로 무엇을 유도하는 작업인가?
생물전환기술이란 생합성(biosynthesis), 생촉매(biocatalysis) 등의 용어와 같은 의미를 가지며, 미생물이 가지고 있는 효소적 기능을 이용하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 기술을 말한다. 즉 미생물 발효 또는 효소처리 등의 생물학적 방법을 통해 천연물 생리활성물질의 구조적 변화를 유도하여 유효성분의 함량 증가, 흡수율 개선 및 새로운 기능성분의 생성을 유도하는 작업이다. 기존의 발효공정이 상대적으로 간단한 원료물질에서 출발하는 반면, 생물 전환공정은 미생물 또는 효소의 기질에 대한 선택성을 이용하여 전구물질로부터 산물을 생산한다는 점에서 차이를 나타낸다(17).
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