FI-HG-AAS를 이용한 전처리 과정에서 사용되는 예비환원제의 종류에 따른 요중 비소 분석결과 비교 Comparisons of Urinary Arsenic Analysis by Pre-reductant for Preconditioning via the FI-HG-AAS Method원문보기
Objectives: The method of analyzing urinary arsenic by flow injection hydride generation atomic absorption spectrometry (FI-HG-AAS) is generally used because it shows relatively greater sensitivity, low detection limits, low blocking action, and is simple to operate. In this study, the results of an...
Objectives: The method of analyzing urinary arsenic by flow injection hydride generation atomic absorption spectrometry (FI-HG-AAS) is generally used because it shows relatively greater sensitivity, low detection limits, low blocking action, and is simple to operate. In this study, the results of analysis according to three pre-reductants commonly used in the FI-HG-AAS method were compared with each other. Methods: To analyze urinary arsenic, nineteen urine samples were collected from adults aged 43-79 years old without occupational arsenic exposure. Analysis equipment was FI-HG-AAS (AAnalyst 800/FIAS 400, Perkin- Elmer Inc., USA). The three pre-reductants were potassium iodide (KI/AA), C3H7NO2S (L-cysteine), and a mixture of KI/AA and L-cysteine (KI/AA&L-cysteine). Results: In the results of the analysis, the recovery rate of the method using KI/AA was 82.3%, 95.7% for Lcysteine, and 123.5% for KI/AA and L-cysteine combined. When compared with the results by use of high performance liquid chromatography inductively-coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS), the method using L-cysteine was the closest to those using HPLC-ICP-MS ($98.57{\mu}g/L$ for HPLC-ICP-MS; $74.96{\mu}g/L$ for L-cysteine; $69.23{\mu}g/L$ for KI/AA and L-cysteine; $13.06{\mu}g/L$ for KI/AA) and were significantly correlated (R2=0.882). In addition, they showed the lowest coefficient of variation in the results between two laboratories that applied the same method. Conclusion: The efficiency of hydride generation is considered highly important to the analysis of urinary arsenic via FI-HG-AAS. This study suggests that using L-cysteine as a pre-reductant may be suitable and the most rational among the FI-Hg-AAS methods using pre-reductants.
Objectives: The method of analyzing urinary arsenic by flow injection hydride generation atomic absorption spectrometry (FI-HG-AAS) is generally used because it shows relatively greater sensitivity, low detection limits, low blocking action, and is simple to operate. In this study, the results of analysis according to three pre-reductants commonly used in the FI-HG-AAS method were compared with each other. Methods: To analyze urinary arsenic, nineteen urine samples were collected from adults aged 43-79 years old without occupational arsenic exposure. Analysis equipment was FI-HG-AAS (AAnalyst 800/FIAS 400, Perkin- Elmer Inc., USA). The three pre-reductants were potassium iodide (KI/AA), C3H7NO2S (L-cysteine), and a mixture of KI/AA and L-cysteine (KI/AA&L-cysteine). Results: In the results of the analysis, the recovery rate of the method using KI/AA was 82.3%, 95.7% for Lcysteine, and 123.5% for KI/AA and L-cysteine combined. When compared with the results by use of high performance liquid chromatography inductively-coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS), the method using L-cysteine was the closest to those using HPLC-ICP-MS ($98.57{\mu}g/L$ for HPLC-ICP-MS; $74.96{\mu}g/L$ for L-cysteine; $69.23{\mu}g/L$ for KI/AA and L-cysteine; $13.06{\mu}g/L$ for KI/AA) and were significantly correlated (R2=0.882). In addition, they showed the lowest coefficient of variation in the results between two laboratories that applied the same method. Conclusion: The efficiency of hydride generation is considered highly important to the analysis of urinary arsenic via FI-HG-AAS. This study suggests that using L-cysteine as a pre-reductant may be suitable and the most rational among the FI-Hg-AAS methods using pre-reductants.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 우리나라에서 주로 사용되는 예비환원제에 의한 FI-HG-AAS법과 HPLC-ICP-MS 방법과의 비교 분석을 통하여 각 예비환원제에 따른 분석방법의 타당성을 검증, 각 예비환원제의 신뢰성을 평가하고자 하였다.
이는 비소 노출에 대한 우리나라 국민들의 참고치(reference value)를 제시함에 있어 혼란을 초래할 수 있으며, 예비환원제의 종류, 각 분석기관 사용기기의 분석조건에 따라 상이한 결과를 나타내는 이들 결과를 비교 평가할 수 없다는 문제점을 제기한다. 본 연구는 이러한 문제점을 세가지 예비환원제를 이용한 FI-HG-AAS법과 HPLC-ICP-MS법을 비교함으로써 이러한 문제점들의 원인을 밝히고 증명하였다. 국내에서 고가의 HPLC-ICP-MS 장비를 보유한 실험실은 주로 국가 연구 기관이거나 상업적 분석을 대행하는 실험실뿐이며 그 수도 많지 않다.
제안 방법
3가 비소 표준원액(1,000 µg/L, Aldrich, USA)을 단계적으로 희석하여 100 µg/L로 제조하고 이것을 묽혀 일련의 농도로 매회 사용하며 교정표준 (calibration standard) 용액은 2.0-32.0 µg/L 농도로 조제하였다.
회수율을 검정하기 위한 표준시료를 조제하기 위하여 직업적 노출이 없는 정상인 소변을 1일 간 냉장보관하고 다시 냉동시킨 후 해동하여 여과하였다. As(III)(Arsencic trioxide, Fluka, USA), As(V)(Sodium arsenate dibasic Heptahydrate, Sigma-Aldrich, USA), DMA(Sodium cacodylate trihydrate, Sigma, USA)와 MMA(Disodium methyl arsonate hexahydrate, CHEM SERVICE, USA)의 표준물질을 사용하여 여과한 소변에 알고 있는 4가지 비소 화학종을 첨가하여 조제하였다. 분석의 절차는 CDC(Center for Diseases Control)의 방법(Laboratory procedure manual, Urine arsenic speciation HPLCICPDRCMS, method no.
이와 같이 각 예비환원제로 전처리 한 시료는 FI-HG-AAS로 분석하였다. HPLC-ICP-MS를 이용한 요중 비소의 화학종 분리 분석은 일본 동경대학교 실험실에서 실시하였다.
본 연구에서 사용한 시료의 양이 제한적이고, 다양한 조건 하에서 반복적으로 이루어진 분석에 있어 불가피한 분석오차의 발생 등은 본 연구의 제한이라고 할 수 있다. 또한 본 연구에서는 HPLC-ICP-MS 방법에서 산출된 요중 비소 농도를 참값의 개념으로 적용하였다. 현재까지 알려진 기기분석 방법 중 HPLC-ICP-MS 방법이 일반적으로 가장 정확한 것으로 여겨지지만 이 역시 완전한 참값이라고 할 수는 없다.
본 연구에서는 동일한 대상자에게서 같은 시기에 채취한 소변 시료를 네 가지 방법으로 분석하였다. 네방법에 따른 요중 비소 농도 분석을 위하여 Mann-Whitney test를 수행하여 각 방법 간 분석결과의 농도 값 차이를 검증하였다.
4 M HCl) 예비환원제 1 mL를 첨가한 후 5% KI/5% ascorbic acid 1mL를 넣고 50분 방치, 10 mL로 표선을 맞추었다. 이와 같이 각 예비환원제로 전처리 한 시료는 FI-HG-AAS로 분석하였다. HPLC-ICP-MS를 이용한 요중 비소의 화학종 분리 분석은 일본 동경대학교 실험실에서 실시하였다.
0 µg/L 농도로 조제하였다. 회수율을 검정하기 위한 표준시료를 조제하기 위하여 직업적 노출이 없는 정상인 소변을 1일 간 냉장보관하고 다시 냉동시킨 후 해동하여 여과하였다. As(III)(Arsencic trioxide, Fluka, USA), As(V)(Sodium arsenate dibasic Heptahydrate, Sigma-Aldrich, USA), DMA(Sodium cacodylate trihydrate, Sigma, USA)와 MMA(Disodium methyl arsonate hexahydrate, CHEM SERVICE, USA)의 표준물질을 사용하여 여과한 소변에 알고 있는 4가지 비소 화학종을 첨가하여 조제하였다.
대상 데이터
KI-AA의 경우, 5% KI/5% AA으로 조제하고 운반체 용액(carrier solution)은 10% HCl을 사용하였다. 수소화물 생성 시약은 0.
국내에서 FI-HG-AAS를 사용하는 A대학 실험실과 본 연구 실험실에서 폐금속광산 주민 시료 중 무작위 추출한 19개의 시료를 각각 분석하여 비교하였다. 두 대학 실험실에서 적용한 방법은 동일하다.
상업용 표준 인증물질(CRM; certified reference material)로 ClinCheck(RECIPE Chemicals, Germany) Urine Control Level I, II와 NIES(The National Institute for Environmental Studies, Ibaraki, Japan) CRM no. 18 human urine을 사용하였고, 표준 인증 물질(SRM; standard reference material)로 SRM 2669 I, II(National Institute of Standard and Technology, NIST, USA)를 사용하였다. ClinCheck Level I, II의 참고 값과 참고범위를 제시하였는데, 이것은 네 가지 비소 화학종이 혼합된 형태로 존재한다.
요중 비소 분석을 위하여 43-79세 분포의 직업력이 없는 성인에게서 채취된 소변 시료를 사용하였다. 소변은 중금속 제거 세척을 실시한 소변 전용 용기(specimen cup, pp)에 일시뇨(spot urine)을 받아 드라이아이스로 채워진 아이스 박스로 이송하였으며, 오염되지 않도록 주의하여 분석 전까지 냉동 보관하였다.
데이터처리
95% 신뢰수준 하에서 통계적 유의성을 검증하였으며(p-value<0.05), 통계분석에는 SPSS statistical software(Ver. 20.0; PASW Statistics, USA)를 사용하였다.
본 연구에서는 동일한 대상자에게서 같은 시기에 채취한 소변 시료를 네 가지 방법으로 분석하였다. 네방법에 따른 요중 비소 농도 분석을 위하여 Mann-Whitney test를 수행하여 각 방법 간 분석결과의 농도 값 차이를 검증하였다. 또한 실험실 간 분석결과 간의 상호관련성을 검증하기 위하여 상관분석을 실시하였다.
네방법에 따른 요중 비소 농도 분석을 위하여 Mann-Whitney test를 수행하여 각 방법 간 분석결과의 농도 값 차이를 검증하였다. 또한 실험실 간 분석결과 간의 상호관련성을 검증하기 위하여 상관분석을 실시하였다. 95% 신뢰수준 하에서 통계적 유의성을 검증하였으며(p-value<0.
각 방법의 검출한계는 공시료를 10회 반복 분석하여 표준편차(SD)를 구하고 검출한계(limit of detection, LOD)는 표준편차의 3배, 정량한계(limit of quantitation, LOQ)는 표준편차에 10배를 적용하였다(NIOSH, 1995; 한국산업보건연구원, 1995; IUPAC, 1997). 방법 검출한계(MDL, method of detection limit)는 비노출 normal urine을 각 예비환원제 별로 전처리하여 각 분석 과정을 거쳐 7회 반복 측정하고 산출한 표준편차에 3.14를 곱하여 계산하였다(Wisconsin Department of Natural Resources, 1996; Thomsen V, 2003). 방법정량한계(MLQ)는 표준편차에 10을 곱하여 산출하였다.
이론/모형
18 CRM은 주로 비소 화학종의 종 분리 분석과 총비소 분석에 사용되며 무기비소와 그 대사산물에 대한 정확한 참고 값을 제공하지 않는다. NIST SRM은 여러 비소 화학종이 존재하며 무기비소와 그 대사산물, 즉 4가지 화학종[AS(III), As(V), MMA, DMA]의 농도를 합한 i-As sum의 참고 값을 FI-HG-AAS법에 사용하였다.
각 방법의 검출한계는 공시료를 10회 반복 분석하여 표준편차(SD)를 구하고 검출한계(limit of detection, LOD)는 표준편차의 3배, 정량한계(limit of quantitation, LOQ)는 표준편차에 10배를 적용하였다(NIOSH, 1995; 한국산업보건연구원, 1995; IUPAC, 1997). 방법 검출한계(MDL, method of detection limit)는 비노출 normal urine을 각 예비환원제 별로 전처리하여 각 분석 과정을 거쳐 7회 반복 측정하고 산출한 표준편차에 3.
분석 기기는 FI-HG-AAS(AAnalyst 800/FIAS 400, Perkin-Elmer Inc., USA)를 사용하였다. 분석에 필요한 예비환원제인 5% KI-5% ascorbic acid 용액으로 5 g KI(potassium iodide 99%, Sigma, USA)와 5g ascorbic acid(99%, Sigma, USA)를 탈이온수 100 mL에 용해시켰다.
As(III)(Arsencic trioxide, Fluka, USA), As(V)(Sodium arsenate dibasic Heptahydrate, Sigma-Aldrich, USA), DMA(Sodium cacodylate trihydrate, Sigma, USA)와 MMA(Disodium methyl arsonate hexahydrate, CHEM SERVICE, USA)의 표준물질을 사용하여 여과한 소변에 알고 있는 4가지 비소 화학종을 첨가하여 조제하였다. 분석의 절차는 CDC(Center for Diseases Control)의 방법(Laboratory procedure manual, Urine arsenic speciation HPLCICPDRCMS, method no. ITU003B)을 준수하였다.
성능/효과
3가지 예비환원제의 비교에서 기존의 예비 환원제 (KI/AA)에 의한 전처리법이 과소평가됨을 확인하였고 그 원인은 DMA 의 회수율이 낮아 즉, 수소화물 생성 효율이 떨어지기 때문이라고 판단된다. 3가지 전처리 법에 따라 FI-HG-AAS로 분석한 각각의 평 균농도와 HPLC-ICP-MS 분석 농도와 비교하였을 때 일치도는 L-cysteine전처리법이 가장 높았고 K/ AA & L-Cysteine 전처리, KI / AA 전처리법 순을 나타내었다.
3가지 전처리 법에 따라 FI-HG-AAS로 분석한 각각의 평 균농도와 HPLC-ICP-MS 분석 농도와 비교하였을 때 일치도는 L-cysteine전처리법이 가장 높았고 K/ AA & L-Cysteine 전처리, KI / AA 전처리법 순을 나타내었다.
HPLC-ICP-MS 방법을 이용한 요중 비소 분석 결과, 요중 비소의 평균 농도는 98.57 µg/L이었다.
HPLCICP-MS 분석 결과와 L-cysteine 방법을 통한 분석 결과 간의 상관계수는 0.940(R2 =0.883; p-value<0.010) 이었으며, KI/AA의 경우 상관계수는 0.784(R2 =0.615, p<0.001), KI/AA & L-cysteine에서는 0.821(R2 =0.673, p<0.001)으로 L-cysteine 방법을 적용하였을 때 HPLC-ICP-MS 방법에서의 요 중 비소 분석 결과와 L-cysteine 방법에서의 요중 비소 분석 결과가 가장 높은 상관계수를 나타내었다.
KI/ AA, L-cysteine, 그리고 KI/AA & L-cysteine 방법에서의 요중 비소 분석결과의 평균 농도가 각각 13.06, 74.97, 69.23 µg/L으로 평가되었으며, 네 가지 방법에 따른 요중 비소 농도를 비교하기 위하여 HPLC-ICP-MS를 이용한 요중 비소 농도 결과를 기준(reference)로 하고 각 전처리 방법에서 도출된 평균값과의 차이를 비교한 결과 KI/AA 방법에 따른 요중 비소 분석결과에서만 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(Table 3).
KI/AA & L-cysteine 예비환원제를 사용한 경우 실험실간 평균 농도가 유의한 차이를 나타냈으며 A대학교 실험실이 2배 이상 높게 평가되는 것으로 조사되었다.
L-cysteine 예비환원제의 경우 As(III) 94.1%, As(V) 98.2%, DMA와 MMA에서의 회수율이 각각 87.2%와 103.2% 였으며, KI/AA & L-cysteine에서는 As(III) 84.1%, As(V) 68.5%, DMA 129.2%, 그리고 MMA가 212.1%의 회수율을 나타내었다.
검출한계는 KI / AA가 0.018 µg/l L-cysteine은 0.45 µg/l, KI / AA & L-cysteine은 0.53 µg/l으로 나타났다(Table 5).
국가 연구사업의 대상이 된 특정지역 주민의 요 19개를 무작위 추출하여 FI-HG-AAS를 사용하고 있는 A대학교 실험실(Lab-A)과 본 실험실(Lab-B)에서 각각의 3가지 예비환원제를 사용하여 교차분석을 실시한 결과 L-cysteine만 단독으로 사용한 경우 유의하게 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 기존의 KI/AA을 사용한 분석법은 유의한 차이가 있었으나 두 실험실 모두에서 현저히 과소평가됨을 확인할 수 있었다.
국가 연구사업의 대상이 된 특정지역 주민의 요 19개를 무작위 추출하여 FI-HG-AAS를 사용하고 있는 A대학교 실험실(Lab-A)과 본 실험실(Lab-B)에서 각각의 3가지 예비환원제를 사용하여 교차분석을 실시한 결과 L-cysteine만 단독으로 사용한 경우 유의하게 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 기존의 KI/AA을 사용한 분석법은 유의한 차이가 있었으나 두 실험실 모두에서 현저히 과소평가됨을 확인할 수 있었다. KI/AA & L-cysteine 예비환원제를 사용한 경우 실험실간 평균 농도가 유의한 차이를 나타냈으며 A대학교 실험실이 2배 이상 높게 평가되는 것으로 조사되었다.
동일한 시료를 이용하여 FI-HG-AAS 방법에서 적용되는 세 종류의 예비환원제(KI/AA, L-cysteine, KI/AA & L-cysteine)의 종류별로 분석결과를 비교한 결과, 세 가지 예비 환원제를 이용한 FI-HG-AAS 방법에 있어 L-cysteine 을 예비환원제로 이용한 분석결과가 가장 적합한 회수율을 보였으며, HPLC-ICP-MS를 적용한 방법과의 분석결과 차이가 가장 적고, 실험실 간 분석결과의 차이도 가장 적은 것으로 평가되었다.
또한 각 시료별로 A 실험실과 B 실 험실에서 산출된 요중 비소 농도의 변이계수를 산출한 결과, KI/AA & L-cysteine을 예비환원제로 이용하여 분석한 경우 평균 변이계수가 45.92%였으며, KI/AA의 경우 16.82%, L-cysteine의 경우 11.06%로 평가되었다(Table 4).
본 연구에서, 세 가지 예비환원제를 이용한 FI-HGAAS 방법에 있어 L-cysteine을 예비환원제로 이용한 분석결과가 가장 적합한 회수율을 보였으며, HPLC-ICP-MS를 적용한 방법과의 분석결과 차이가 가장 적고, 실험실 간 분석결과의 차이도 가장 적은 것으로 평가되었다.
Table 1은 직업적 노출이 없는 정상인의 소변에 알고 있는 농도의 4가지 비소화학종 당 2가지 농도 수준 3세트씩 총 24개의 시료를 각 예비환원제로 전 처리 후 분석한 결과이다(총 72개시료). 분석 농도에서 소변 자체의 농도를 빼고 보정한 농도를 산출한 결과 KI/AA 예비환원제에서의 회수율은 평균 82.3%를 나타내었다. L-cysteine 예비환원제의 경우 평균 95.
동일한 시료를 이용하여 FI-HG-AAS 방법에서 적용되는 세 종류의 예비환원제(KI/AA, L-cysteine, KI/AA & L-cysteine)의 종류별로 분석결과를 비교한 결과, 세 가지 예비 환원제를 이용한 FI-HG-AAS 방법에 있어 L-cysteine 을 예비환원제로 이용한 분석결과가 가장 적합한 회수율을 보였으며, HPLC-ICP-MS를 적용한 방법과의 분석결과 차이가 가장 적고, 실험실 간 분석결과의 차이도 가장 적은 것으로 평가되었다. 예비환원제를 사용한 전처리가 적용된 FI-HG-AA 방법에 있어 수소화율 생성은 결과 수치에 영향을 미치는 중요한 변수이며, 본 연구에서 도출된 결과는 과소평가가 발생할 수 있는 KI/AA 방법보다는 L-cysteine을 적용한 요중 비소 방법이 가장 합리적임을 보여준다.
5 µg/g creatinine16) 등의 값이 보고된 바 있다. 이상의 국가 연구 사업 결과들에서, 요중 비소의 농도는 예비환원제의 종류, 각 분석기관 사용기기의 분석조건에 따라 상당히 넓은 범위의 상이한 결과를 나타내었으며 결과적으로 이들 결과를 비교, 평가하기 어렵다는 문제점을 제기할 수 있다.
5%의 회수율을 보였다. 종 별로 구분하였을 때, As(III)와 As(V)에서는 KI/AA 예비환원제 방법이 가장 높은 회수율을 보였던 반면 DMA에서는 가장 낮은 회수율을 나타냈다. L-cysteine 예비환원제의 경우 As(III) 94.
5%의 좋은 회수율을 나타냈으나 As(III), As(V), DMA, MMA가 혼합된 표준 인증물 질(SRM)인 NIST 시료에서는 각기 다른 양상을 나타내었다. 즉 KI/AA 예비환원제에서는 73.2%, 58.6%의 회수율을 보였으며, L-cysteine만 사용한 전처리에서는 92.5%, 100.3%로 가장 근접한 회수율을 나타내었다. 한편 KI / AA & L-cysteine 예비환원제에서는 112.
현재까지 알려진 기기분석 방법 중 HPLC-ICP-MS 방법이 일반적으로 가장 정확한 것으로 여겨지지만 이 역시 완전한 참값이라고 할 수는 없다. 하지만 본 연구를 통하여 국내에서 사용되는 예비환원제 KI/AA의 경우 비소 화학종 중 DMA가 현저히 낮게 과소평가됨을 확인하였고 L-cysteine 예비환원제를 사용한 방법이 HPLC-ICP-MASS 법과 근사한 측정값을 나타냈다. 또한 같은 분석 방법을 사용하는 실험실간의 차이는 기기마다 다른 수소 화율에 따른 결과임을 알 수 있었다.
후속연구
본 연구에서 사용한 시료의 양이 제한적이고, 다양한 조건 하에서 반복적으로 이루어진 분석에 있어 불가피한 분석오차의 발생 등은 본 연구의 제한이라고 할 수 있다. 또한 본 연구에서는 HPLC-ICP-MS 방법에서 산출된 요중 비소 농도를 참값의 개념으로 적용하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
만성적인 무기비소 노출은 인체에 어떤 영향을 미치는가?
무기와 유기 3가 비소 화합물은 5가의 형태보다 더욱 잠재적인 독성을 가지는 것으로 알려져 있다. 만성적인 무기비소 노출은 피부 병변, 폐와 피부암, 신장 손상, 중추신경계 손상과 당뇨의 위험을 증가시키는 것으로 보고된다. 1-3)
비소의 노출에 대한 생물학적 지표로는 무엇이 사용되는가?
비소의 노출에 대한 생물학적 지표로는 혈액, 요, 모발, 손발톱 등이 사용된다. 이들 중 혈액 내 비소는 몇 시간 이내에 혈액으로부터 배출되기 때문에 아주 최근의 노출만을 반영한다.
비소의 노출에 대한 지표로서 혈액, 요, 모발, 손발톱이 사용되는데 각각의 특징은 어떠한가?
비소의 노출에 대한 생물학적 지표로는 혈액, 요, 모발, 손발톱 등이 사용된다. 이들 중 혈액 내 비소는 몇 시간 이내에 혈액으로부터 배출되기 때문에 아주 최근의 노출만을 반영한다. 4,5) 모발과 손발톱의 경우 외부오염에 의한 영향을 받을 수 있으며, 비교적 손 쉽고 정확한 방법으로서 요를 통한 비소 농도 분석방법이 일반적으로 사용되고 있다. 6-8)
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