[논문]혈장 중 극미량 납 분석을 위한 ICP-MS 분석법 검증

이성배; 김용순; 이용훈; 안병준; 김남수; 이병국; 신호상

doi:10.5806/ast.2015.28.5.309

혈장 중 극미량 납 분석을 위한 ICP-MS 분석법 검증
Validation of ICP-MS method for trace level analysis of Pb in plasma 원문보기

분석과학 = Analytical science & technology, v.28 no.5, 2015년, pp.309 - 316

이성배 (산업안전보건연구원 화학물질센터) , 김용순 (산업안전보건연구원 화학물질센터) , 이용훈 (산업안전보건연구원 화학물질센터) , 안병준 (산업안전보건연구원 화학물질센터) , 김남수 (순천향대학교 환경산업의학연구소) , 이병국 (충주의료원 건강관리과) , 신호상 (공주대학교 환경교육과)

초록
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본 연구에서는 ICP-MS의 혈장 중 극미량의 납 분석법을 검증하기 위하여 Class 1,000 이내의 환경조건을 확보한 후 특이성, 일내 및 일간 정확도, 정밀도, 검정곡선 등을 확인하였다. 청정실의 부유 분진량을 측정한 결과, 0.3 µm 크기는 0.3~62개, 0.5 µm 크기는 0.0~28.3 개로 총 부유분진량이 최대 90.3개로 요구 환경에 부합하였다. 우태아 혈청 공시료로 조제한 시료의 MDL (Method detection limit)은 1.77 ng/L이고, LOQ (Limit of quantification)값은 5.55 ng/L 이었다. 검정곡선은 y=1.09×10⁻³ x+4.88×10⁻²이었고, 상관계수 r=0.9999이었다. 분석법 확립을 위한 특이성, 일내 및 일간 정확성, 정밀성, 그리고 검정곡선을 확인한 결과 50 ng/L 이상에서 분석법 확인 기준에 적합하였다. 이를 토대로 분석한 일반인의 혈장 중 납 농도 평균은 55.4 ng/L 이었으며, 현직 근로자는 440 ng/L 이었고, 퇴직 근로자는 132 ng/L 이었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The analytical method of lead in plasma by ICP-MS was validated after securing environment within class 1,000 classification. We tested specificity and accuracy of within-run and between-run. According to measurement of the amount of suspended particulates in a clean room, 0.3~62 particles were detected in 0.3 µm size while 0.0~28.3 particles were observed in 0.5 µm size. Total suspended particulates met required environment with up to 90.3 particles. The MDL (Method detection limit) of the sample which has been fabricated using fetal bovine serum (FBS) blank was 1.77 ng/L, and LOQ (Limit of quantification) was 5.55 ng/L. The slope, intercept and correlation coefficient of the calibration curve were y=1.09×10−3x+4.88×10−2 and r=0.9999, which showed good correlation. The specificity, within-run and between-run accuracy satisfied the standard at more than 50 ng/L. The average lead concentration in plasma of the general people, current workers and retired workers was 55.4 ng/L, 440 ng/L, and 132 ng/L.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

않다. 따라서 본 연구는 생물학적 모니터링에 ICP-MS를 활용하기 위하여 청정실 환경 조건에서 혈장 또는 혈청 중의 납 분석법을 검증하고자 하였다.
본 연구에서는 혈장 중 납의 극미량 분석법 확립을 위하여 필요한 환경조건을 갖춘 후 검증을 수행하였다. 본 분석방법은 사용법이 비교적 간단하고 높은 감도, 낮은 정량한계, 우수한 직선성, 일내 재현성과 일간 재현성은 4% 이하로 기준 값 이내로 정밀성이 확인되었고 정확성도 우수하였다.

제안 방법

13, 14 검정곡선을 그리기 위한 표준용액은 위와 동일한 방법으로 제조한 뒤 각각의 혈장 시료로부터 용혈 정도를 확인하기 위하여 혈장 내의 철 수준을 분석하였다.^{15, 16} 시료의 전처리 작업은 오염을 막기 위하여 청정실 안의 무균 실험대 내(부유분진량은 1 이하: Table 1 참조)에서 수행하였다.
ICP-MS 분석의 신뢰도 검증을 위해서 먼저 생체시료의 간섭실험을 하였으며, 실험결과 MDL은 1.76 ng/L, LOQ는 5.55 ng/L로 10 ng/L 이하까지 정량분석이 가능하였다. Bárány 등의 연구에 따르면 혈청 중 검출한계는 100 ng/L 이었으나, ²⁹ 본 연구에서는 50 배 이상 더 낮은 검출한계를 얻었으며 이는 장비의 우수성도 있겠지만 청정 분석 환경과 최적 기기조건의 확립이 크게 작용한 것으로 판단된다.
^{15, 16} 시료의 전처리 작업은 오염을 막기 위하여 청정실 안의 무균 실험대 내(부유분진량은 1 이하: Table 1 참조)에서 수행하였다. Table 2 와 같이 표준용액은 표준 우태아 혈청을 사용하여 표준 물 첨가법으로 20, 50, 100, 200, 500, 1, 000, 그리고 2, 000 ng/L를 사용하였다.^{13, 14}
이 정확도는 알고 있는 양의 분석물질을 함유한 시료를 반복적으로 분석하여 구할 수 있다. 대체표준물(surrogate standard)을 이용하여 표준용액(working solution)을 만드는 방법과 동일한 방법으로 만든 임의의 시료 40 ng/ L, 400 ng/L, 그리고 1, 700 ng/L에 대하여 10 회 반복실험을 실시하였다.
또한 공시료로부터 2, 000 ng/L 까지의 농도에 대하여 일간(between-run) 6회(0, 1, 4, 13, 20, 42일)에 걸쳐서 분석을 실시하였으며, 각 농도마다 3 회 반복 시험한 결과를 Table 6과 Fig. 1에 나타내었다. 각 농도별로 측정된 정밀도는 표준시료 이론값의 ±15% 이내를 모두 만족하였으며, 정확도도 20 ng/L 를 제외하고 98.
분석물질의 일정 농도에 대한 ‘정확도’와 ‘정밀도’ 를 확인하기 위해 임의로 조제한 시료에 대하여 일내 (within-run) 및 일간(between-run) 값을 분석하였다. 정확도는 회수율(recovery)을 통하여 비교하였으며, 정밀도는 상대표준편차(RSD)를 이용하여 비교하였다.
시료의 전처리는 Triton X-100, Na₂EDTA, 28% 암모니아수와 미리 제조한 내부표준용액(internal standard solution)인 Rh 1 µg/L 탈이온 희석용액과 혼합하였으며, 분석할 혈장시료는 위에서 제조한 희석용액과 1:9 비율로 혼합하였다.^{13, 14} 검정곡선을 그리기 위한 표준용액은 위와 동일한 방법으로 제조한 뒤 각각의 혈장 시료로부터 용혈 정도를 확인하기 위하여 혈장 내의 철 수준을 분석하였다.
이에 따라 공시료, 20 ng/L, 50 ng/L, 100ng/L, 200 ng/L, 500 ng/L, 1, 000 ng/L, 그리고 2, 000ng/L에 대하여 일간(between-run) 분석을 6 회에 걸쳐서 실시하였으며, 각 농도마다 3 회 반복 실험한 결과를 평균값으로 취하였다. 각 농도별로 측정된 정밀도는 상대표준 편차(relative standard deviation: RSD) 값이 15% 이내에 있어야 한다.
대하여 작성되는 것이다. 표준물질은 Table 3과 같으며, 표준물질 8 개 전체를 사용한 검정곡선과 1, 000ng/L 미만의 하위 5 개 농도와 2, 000 ng/L까지의 상위 5개 농도에 대한 검정곡선을 비교하였다.
혈장시료를 구하는 것이 어렵고, 혈장 중 납과 혈청 중 납은 비슷한 결과를 보여주기 때문에²⁰ 본 연구에서는 혈장과 유사하여 생체시료로 많이 사용되고 있는 우태아 혈청으로 조제한 공시료(blank)를 10 회 반복하여 간섭시험을 수행하였다.

대상 데이터

이후 Milli-Q로 제조한 18 M 초순수 탈이온수로 5번 이상 세척하여 깨끗하게 한 다음 수직 층류가 흐르는 Class 1, 000 청정실 내의 무균 실험대 안에서 건조시켰다.^{11, 12} ICP- MS 자동시료주입기 세척용액은 탈이온수와 70%의 99.999+% 전자급(EG: Electronic Grade) HNO₃을 희석하여 1% v/v HNO₃로 제조하여 사용하였다.¹³
Ammonium hydroxide solution, disodium Ethylene Diamine Tetraacetic acid(Na₂-EDTA), Triton X-100, Nitric acid(Aldrich, USA) 특급시약을 구매하였고, Fe 표준시약(Kanto chemical, Japan)은 1, 000 µg/mL 용액을 구매하였다. Pb(1 µg/mL), Rh(1 µg/mL)는 AccuStandard 사(USA) 제품을 구매하였으며, Fetal bovine serum은 HyClone (USA) 제품을 사용하였다.
Pb(1 µg/mL), Rh(1 µg/mL)는 AccuStandard 사(USA) 제품을 구매하였으며, Fetal bovine serum은 HyClone (USA) 제품을 사용하였다. 18 M 초순수 탈이 온수는 Milli-Q(Millipore사, USA)를 사용하여 실험실에서 조제하였다.
분석 기기는 ICP-MS (Agilent Technologies, Model: 7500ce, 미국)를 사용하였다. ICP 및 mass detector의 분석 조건은 Table 2와 같다.
상기와 같이 분석법을 검증하고 시료분석을 위하여 S대학교 환경산업의학연구소의 혈액은행으로부터 일반인, 현직근로자, 그리고 퇴직근로자의 혈장시료를 제공받아 분석하였다. 분석한 시료는 연구 참여에 동의한 연구대상자의 혈장시료만 사용하였으며, 분석한 결과를 Table 8에 나타내었다.
이동 가스로는 아르곤(99.999%)를 사용하였으며, 이 외의 시약은 고순도 분석급으로 사용하였다.

데이터처리

정확도는 회수율(recovery)을 통하여 비교하였으며, 정밀도는 상대표준편차(RSD)를 이용하여 비교하였다. 일내 정확도(100.
특히 납을 정량하기 위한 Pb²⁰⁸은 Pb²⁰⁴, Pb²⁰⁶, Pb²⁰⁷과 비교하였을 때 자연 존재비가 가장 크기 때문에 감도가 가장 좋으며 다른 원소의 동위원소와 겹침이 없어 간섭현상이 거의 없음¹⁷으로 선택하였다. 표준 우태아 혈청을 이용하여 시험분석한계를 측정하였으며 모든 분석값은 3 회 반복 측정치의 평균값으로 산정하였다.

성능/효과

이는 위에서도 언급하였듯이 표준시료 20 ng/L가 매우 낮은 농도이기 때문에 생체시료 영향을 크게 받게 되어 정밀도가 떨어진 것이다. 3 종류의 검정 곡선을 비교한 결과 생체시료영향을 많이 받은 20 ng/L를 제외한 상위 농도군의 직선성이 더 우수하였으며, 분석한계와 배경평균농도 또한 더 좋은 결과를 얻을 수 있었다.
40 ng/L 시료의 평균은 40.3 ng/L, 표준편차는 1.09, 그리고 상대표준편차(relative standard deviation: RSD)는 2.71%이었으며, 400 ng/L 시료의 경우에 평균은 400 ng/L, 표준편차는 5.85, 그리고 RSD는 1.46% 이었고, 1, 700 ng/L 시료의 경우에 평균은 1, 706 ng/L, 표준편차는 17.4, 그리고 RSD는 1.02%이었다. 모든 시료의 RSD값은 생체시료분석법 검증 기준 이론값의 ±15%이내의 정밀도를 나타내었으며, 정확도는 각각 100.
1에 나타내었다. 각 농도별로 측정된 정밀도는 표준시료 이론값의 ±15% 이내를 모두 만족하였으며, 정확도도 20 ng/L 를 제외하고 98.4~105.5% 범위였다. 다만, 20 ng/L의 경우 최저 정량한계(LLQ: low limit of quantification)에서 ±20%이내이어야 하나 RSD값이 22.
검정곡선을 검증한 결과 모든 농도군을 활용한 검정 곡선의 직선성은 모두 r=0.9998이상으로 우수하였으며, 상위 농도군을 활용한 검정곡선의 경우 직선성이 하위 농도군을 활용한 검정곡선보다 더 좋은 결과를 나타내었다. 이는 위에서도 언급하였듯이 표준시료 20 ng/L가 매우 낮은 농도이기 때문에 생체시료 영향을 크게 받게 되어 정밀도가 떨어진 것이다.
56이었다. 공시료를 10회에 걸쳐 일내 (within-run) 측정한 데이터의 신호-대-잡음비를 통하여 계산한 시험분석한계(MDL: method detection limit)은 1.76 ng/L, 정량한계(LOQ: limit of quantification)는 5.55 ng/L이었다.
0 ng/L) 이었으며, 납 노출 사업장에 근무하는 현직 근로자의 혈장 중 납 농도 평균은 441 ng/L(중앙값 423 ng/L) 이었고, 납 노출 사업장에 근무 경력이 있는 퇴직 근로자의 혈장 중 납 농도 평균은 132 ng/L(중앙값 133 ng/L) 이었다. 따라서 본 분석법으로 일반적으로 분석하는 일반인, 현직근로자, 그리고 퇴직근로자의 혈장 중 납농도 분석이 가능함을 확인하였다.
이전 연구¹³와 같이 US FED STD 209E 청정실 등급기준 ISO 6을 만족하는 청정실 설비를 갖추고 전처리시 오염의 최소화, 납이 함유되지 않은 초자기구와 고순도 시약 사용, 그리고 높은 감도와 재현성이 좋은 ICP-MS를 사용함으로써 검출한계를 낮출 수 있었다. 또한 광범위한 생물학적 모니터링을 위해서는 신속하고 간단한 분석 방법이 필요하였으며 이러한 필요충분조건을 가지고 있는 ICP-MS가 적절하다고 판단하였다.
02%이었다. 모든 시료의 RSD값은 생체시료분석법 검증 기준 이론값의 ±15%이내의 정밀도를 나타내었으며, 정확도는 각각 100.7%, 100.1%, 그리고 100.4%이었다.
본 분석방법은 사용법이 비교적 간단하고 높은 감도, 낮은 정량한계, 우수한 직선성, 일내 재현성과 일간 재현성은 4% 이하로 기준 값 이내로 정밀성이 확인되었고 정확성도 우수하였다. 상기와 같이 ICP-MS 분석법 검증을 수행하여 10 ng/L 단위의 혈장 중 납 농도 측정이 가능함을 확인하였다.
본 연구는 혈장 중 납 분석을 위한 국내·외에 정도 관리 프로그램이 없기 때문에 상기와 같이 분석법 검증을 수행하였으며, 납에 노출되지 않은 일반인의 경우 혈장 중 납 농도 평균이 90 ng/L~200 ng/L임을 감안하면, ^{13, 30-32} 예상되는 농도 전 범위가 포함되어 있기 때문에 ICP-MS를 혈장 중 납 농도 분석에 적용이 가능하다고 판단된다. 다만, 50 ng/L 미만의 극미량 농도를 분석하기 위해서는 생체시료의 영향을 줄일 수 있는 방법을 모색해야 할 것이다.
30 개/ft³에 불과한 작업대의 시료보관 장치로부터 자동 주입되었다. 분석자도 무진복, 두건, 마스크, 청정장갑 그리고 청정화 등을 착용하고 실험하기 때문에 분석결과에 거의 영향을 주지 않았으며, 실험기간 동안 Class 1, 000 청정실 수준의 환경을 유지하였다.
본 분석방법은 사용법이 비교적 간단하고 높은 감도, 낮은 정량한계, 우수한 직선성, 일내 재현성과 일간 재현성은 4% 이하로 기준 값 이내로 정밀성이 확인되었고 정확성도 우수하였다. 상기와 같이 ICP-MS 분석법 검증을 수행하여 10 ng/L 단위의 혈장 중 납 농도 측정이 가능함을 확인하였다. 다만, 본시험에서 50 ng/L 미만의 농도를 분석함에 있어서 신뢰성을 확보하기 위하여 생체시료 영향을 더 줄일 수 있는 추가적인 연구가 필요하다.
0% 수준으로 10⁻⁹ 단위(ng/L)의 극미량까지 분석해야 하기 때문에 ICP- MS를 활용하는 것이 필요하다. 이전 연구¹³와 같이 US FED STD 209E 청정실 등급기준 ISO 6을 만족하는 청정실 설비를 갖추고 전처리시 오염의 최소화, 납이 함유되지 않은 초자기구와 고순도 시약 사용, 그리고 높은 감도와 재현성이 좋은 ICP-MS를 사용함으로써 검출한계를 낮출 수 있었다. 또한 광범위한 생물학적 모니터링을 위해서는 신속하고 간단한 분석 방법이 필요하였으며 이러한 필요충분조건을 가지고 있는 ICP-MS가 적절하다고 판단하였다.
3 개/ft³ 이었다. 총 부유 분진량이 가장 많은 곳은 ICP-MS 장비 위로 평균 90.3 개/ft³ 이었으며, 가장 적은 곳은 무균 실험 대내로 총 부유 분진량이 평균 0.30 개/ft³로 거의 발생하지 않아 시료의 전처리시 오염이 최소화될 수 있었다. ICP-MS 위의 부유 분진량이 가장 많았으나, 시료의 경우 총 부유 분진량 평균이 4.
2에 비교하여 나타내었다. 하위 5 개 농도의 검정곡선은 Y=1.07×10⁻³X+ 4.91×10⁻², 상관계수는 0.9998, 그리고 검출한계는 1.94 ng/L 이었으며, 상위 5 개 농도의 검정곡선은 Y=1.09×10⁻³X+4.80×10⁻², 상관계수는 0.9999, 그리고 검출한계는 1.91 ng/L이었고, 표준물질 8 개 전체에 대한 검정곡선은 Y=1.09×10⁻³X+4.88×10⁻², 상관계수는 0.9999, 그리고 검출한계는 1.91 ng/L 이었다.
71%)는 매우 우수하였으나, 일간 정확도와 정밀도의 경우에는 20 ng/L 에서 생체시료 확인 지침 표준시료 이론값의 ±15%이내를 충족시키지 못하였다. 하지만, 50 ng/L 이상부터 2, 000 ng/L 까지 모든 시료에 대하여 0일에서 42일까지 6회에 걸쳐 측정한 정확도(98.4~105.5%) 및 정밀도(0.61~8.75%)는 생체시료 확인 지침 표준시료 이론값의 ±15%이내를 모두 만족하였다. 20 ng/L 의 경우에 있어서 생체시료 확인 지침 최저정량한계 ±20%를 벗어난 이유는 매우 낮은 농도이기 때문에 생체시료의 영향(matrix effect)을 많이 받은 결과로 판단된다.

후속연구

판단된다. 다만, 50 ng/L 미만의 극미량 농도를 분석하기 위해서는 생체시료의 영향을 줄일 수 있는 방법을 모색해야 할 것이다.
상기와 같이 ICP-MS 분석법 검증을 수행하여 10 ng/L 단위의 혈장 중 납 농도 측정이 가능함을 확인하였다. 다만, 본시험에서 50 ng/L 미만의 농도를 분석함에 있어서 신뢰성을 확보하기 위하여 생체시료 영향을 더 줄일 수 있는 추가적인 연구가 필요하다. 현재 ICP-MS를 사용하는 분야가 점차 확대되어 가고 있으며, 본 연구에서 검증한 ICP-MS를 이용한 혈장 및 혈청 중 납 분석법은 머지않아 납의 생물학적 모니터링으로 활용함에 있어서 AAS를 대체할 것으로 판단된다.
다만, 본시험에서 50 ng/L 미만의 농도를 분석함에 있어서 신뢰성을 확보하기 위하여 생체시료 영향을 더 줄일 수 있는 추가적인 연구가 필요하다. 현재 ICP-MS를 사용하는 분야가 점차 확대되어 가고 있으며, 본 연구에서 검증한 ICP-MS를 이용한 혈장 및 혈청 중 납 분석법은 머지않아 납의 생물학적 모니터링으로 활용함에 있어서 AAS를 대체할 것으로 판단된다.

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동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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