RAW264.7 대식세포에서 장대나물 추출물의 Nitric oxide 및 Prostaglandin E2생성 저해효과 Inhibitory Effects of Extracts from Arabis glabra on Lipopolysaccharide Induced Nitric Oxide and Prostaglandin E2 Production in RAW264.7 Macrophages원문보기
본 연구에서는 장대나물(Arabis glabra)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandi nE2 (PGE2) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 장대나물의 hexane과 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 IC50 value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E2 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 21.0과 18.0 ㎍/㎖였다. 따라서 본 연구 결과는 장대나물의 hexane, chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 장대나물(Arabis glabra)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을 유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandi nE2 (PGE2) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 장대나물의 hexane과 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 IC50 value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E2 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 21.0과 18.0 ㎍/㎖였다. 따라서 본 연구 결과는 장대나물의 hexane, chloroform과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Arabis glabra is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for blood cleaning, detoxification, abscess, gastrospasm, arthritis, contraction and diarrhea. Generally drugs that are used for arthritis have antinocicept...
Arabis glabra is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for blood cleaning, detoxification, abscess, gastrospasm, arthritis, contraction and diarrhea. Generally drugs that are used for arthritis have antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of A. glabra using the ethanolic extract and its sub-fractions. To evaluate the anti-inflammatory effects, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2) on RAW 264.7macrophages. Our results indicated that hexane and chloroform fraction significantly inhibited the LPS-induced NO and PGE2 production in the cells. The hexane fraction inhibitory activity for NO tests with IC50 values showed in 21.0 ㎍/㎖. The chloroform fraction inhibitory activity for PGE2 tests with IC50 values showed in 18.0 ㎍/㎖. These efficacy are expected to be able to present the potential for the development of health functional food for the prevention inflammatory diseases because it has sufficient preventive medical possibilities. Further, it is determined that it is necessary to further study the mechanism of cytokine and protein expression associated with inflammation.
Arabis glabra is a localized common rhizomatous flowering plant, This plant is often used in Korean traditional systems of medicine as a remedy for blood cleaning, detoxification, abscess, gastrospasm, arthritis, contraction and diarrhea. Generally drugs that are used for arthritis have antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of A. glabra using the ethanolic extract and its sub-fractions. To evaluate the anti-inflammatory effects, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2) on RAW 264.7macrophages. Our results indicated that hexane and chloroform fraction significantly inhibited the LPS-induced NO and PGE2 production in the cells. The hexane fraction inhibitory activity for NO tests with IC50 values showed in 21.0 ㎍/㎖. The chloroform fraction inhibitory activity for PGE2 tests with IC50 values showed in 18.0 ㎍/㎖. These efficacy are expected to be able to present the potential for the development of health functional food for the prevention inflammatory diseases because it has sufficient preventive medical possibilities. Further, it is determined that it is necessary to further study the mechanism of cytokine and protein expression associated with inflammation.
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문제 정의
따라서 본 연구자들은 사전에 이루어진 식물화학적 성분 연구 결과를 바탕으로 생리 활성 연구 시 기대할 만한 효과를 얻을 것으로 예상한 바 장대나물의 용매추출물을 이용한 분획물들을 대상으로 LPS 유도 RAW264.7 cell에서의 항염증 활성(NO, PGE2) 효과를 평가하여 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고자 본 연구를 수행하였다.
본 연구는 장대나물 추출․분획물을 이용하여 LPS 유도를 통한 대식세포주인 RAW 264.7macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 장대나물에서 추출․분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다.
본 연구에서는 장대나물(Arabis glabra)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.
장대나물 분획물들을 이용하여 murine macrophage cell인 RAW 264.7 cell에서 lilpopolysaccaride (LPS)에 의해 유도된 염증 성대 사산 물인 Nitric oxide의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물이 NO와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 chloroform 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다.
제안 방법
장대나물에서 추출․분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출․분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 선택하였다. 상기의 두 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다.
Griess reagent [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine-HCl]를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로서 측정하였다. Griess reagent를 100 ㎕ 씩 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
MTT assay 수행 결과 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7세포의 배양액 중에 생성된 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. Table 3과 Fig.
positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다. 두 분획물의 IC50가 각각 45.
Nitric oxide screening 실험에서 억제효과를 나타내는 분획물들을 LPS에 의해 유도되는 또 다른 염증성 대사산물인 PGE2 의 생성 저해효과를 NS398 {N-[2-(Cyclohe-xyl-oxy)-4- nitrophenyl]methanesulfonamide : COX-2 선택적 생성 억제제}이라는 positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다.
, USA) 배지에서 37℃, 5% CO2조건을 유지하여 배양하였다. RAW 264.7세포에 시료 용액의 여러 농도(10, 20, 40 μM)를 1시간 전 처리한 후 LPS를 처리하고 24시간 배양하였다.
건조중량 약 1.2 ㎏의 세절한 장대나물을 에탄올 1 L에 침지하여 상온에서 8시간 동안 환류추출기(TOPS, USA)를 이용하여 추출 후 진공여과된 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복 후 회전식 진공농축기(Tokyo Rikakikai Co.
및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride (LPS)로 염증을유발시켜 nitric oxide (NO)와 prostaglandi nE2 (PGE2) 같은 염증 유발인자들의 억제효과를 확인하였다. 장대나물의 hexane 과 chloroform 분획물의 염증 유발인자 억제 시 IC50 value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E2 생성을 농도 의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 21.
, Korea) 완충용액으로 세척한 후 각각의 well에 H2O2 (BBC Biochemical, USA) 100 ㎕ 및 여러 농도의 시료 100 ㎕를 첨가하여 45분간 배양한 후 상등액을 제거하고 PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 배지 200 ㎕를 주입하여 다시 24시간 배양하였다. 배양액 속에 5 ㎎/㎖ MTT 시약 50 ㎕을 가하여 4시간 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO (Sigma Chemical Co., USA) 100 ㎕를 첨가한 후 540 ㎚에서 ELISA microplate reader (Bio-Tek Instruments Co., USA) 로흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.
Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출․분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 선택하였다. 상기의 두 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다. 장대나물 chloroform 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
7macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 장대나물에서 추출․분획한 총 4개의 농축물을 MTT assay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 추출물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증지표인 Nitric oxide (NO)의 생성을 유도하고 각 추출․분획물을 처리하여 NO 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 선택하였다.
대상 데이터
RAW264.7세포를 10% FBS 및 penicillin (100 ㎕/㎖), strep-tomycin (100 U/㎖)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco, Co., USA) 배지에서 37℃, 5% CO2조건을 유지하여 배양하였다. RAW 264.
본 실험에서 사용한 장대나물은 2013년 7월 강원도 양구군 동면 일대에서 자생하는 전초를 채집하여 상지대학교 제약공학과 박희준 교수에 의뢰하여 감정을 받고 건조한 후 세절하여 사용하였고, 표본은 고령지농업연구소 유기분석실험실(표본 번호 NIHA-자 01)에 보관되어 있다.
데이터처리
실험치의 값은 3번의 독립된 실험을 시행하여 mean ± SDs로나타냈으며 분석은 one-way ANOVA와 Dunnett’s post-hoc test를 통해 p < 0.05를 통계학적으로 유의성이 있음을 나타내었다.
이론/모형
세포의 독성 정도를 확인하기 위하여 MTT (Sigma Chemical Co., USA) 시험법으로 측정하였다. 96 well plate (Falcon T.
장대나물 분획물의 항염증 효과를 규명하기에 앞서 RAW264.7 세포에 독성을 통한 염증 매개 물질의 저해효과 가능성을 배제하는, 즉 독성이 없는 최적 용량을 설정하기 위하여 MTT assay 를 실시하였다. Viability가 80%가 넘는 농도가 최적 용량이라고 판단하였고 Table 2에서 볼 수 있듯이 장대나물의 hexane 분획물이 50 ㎍/㎖이상 에서 IC80 값을 가졌으며, 다른 분획물들은 100 ㎍/㎖의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
성능/효과
다른 분획물들은 NIL에 준하는 효과를 나타내지 못하였다. Hexane 분획물과 chloroform 분획물의 IC50가 각각 21.0, 83.9 ㎍/㎖으로 NO 생성을 농도 의존적으로 가장 잘 저해하였으나, 다른 분획물과의 비교 시 유의성 있게 높은 것으로 판단하기 어렵기에 다른 염증성 대사산물들의 저해 효과를 추가적으로 확인하였다.
7 세포에 독성을 통한 염증 매개 물질의 저해효과 가능성을 배제하는, 즉 독성이 없는 최적 용량을 설정하기 위하여 MTT assay 를 실시하였다. Viability가 80%가 넘는 농도가 최적 용량이라고 판단하였고 Table 2에서 볼 수 있듯이 장대나물의 hexane 분획물이 50 ㎍/㎖이상 에서 IC80 값을 가졌으며, 다른 분획물들은 100 ㎍/㎖의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다. 두 분획물의 IC50가 각각 45.4, 18.0 ㎍/㎖으로 LPS에 의해 유의성 있게 증가한 PGE2생성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다(Table 4, Fig. 2).
앞선 NO assay에서는 hexane 분획물이 가장 높은 저해 효과를 나타내었지만, PGE2 assay는 chloroform 분획물이 hexane 분획물보다 PGE2생성을 보다 효과적으로 저해하였다. 장대나물 분획물들을 이용하여 murine macrophage cell인 RAW 264.
상기의 두 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해효과를 확인하였다. 장대나물 chloroform 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
후속연구
7 cell에서 lilpopolysaccaride (LPS)에 의해 유도된 염증 성대 사산 물인 Nitric oxide의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 장대나물의 hexane 분획물과 chloroform 분획물이 NO와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 chloroform 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다.
0 ㎍/㎖였다. 따라서 본 연구 결과는 장대나물의 hexane, chloroform과 같은 비 극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성 질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
따라서 본 연구 결과는 장대나물의 hexane, chloroform과 같은 비 극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성 질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구진은 앞으로 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 전사인자인 iNOS, COX-2, NF-κB 및 cAMP response element (CRE), SRE (serum response element), activator protein-1 (A P-1), mitogenactivated protein kinase (MAPK) 등(Feldman et al., 1996; Karin and Ben-Neriah, 2000)의 다양한 전사 조절인자들의 신호전달 양상을 연구함으로써 장대나물의 비 극성용매 분획물들이 어떠한 경로를 통해 항염증 효과를 보이는지 그 기전을 밝히고 추후 in vivo 실험을 바탕으로 향후 염증성 질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시하고자 한다.
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