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문제 정의
- 그러나 이러한 sanguinarine의 다양한 항암작용 효능이 보고되었음에도 불구하고 간암세포를 대상으로 이루어진 연구는 매우 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 sanguinarine의 항암활성에 대한 추가적인 자료를 제시하기 위하여 인체 간암세포의 증식억제와 연관된 apoptosis 유도 기전을 HepG2 세포를 대상으로 조사하였으며, 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- Fig. 3의 결과에서 관찰된 sanguinarine 처리에 따른 Bax의 상대적 발현 증가는 미토콘드리아 막 투과성 증가를 일으켜 세포질로의 cytochrome c의 방출을 촉진할 가능성이 높기 때문에[6, 12, 26], 미토콘드리아와 세포질 단백질을 분리하여 cytochrome c 발현의 차이를 비교하였다. 그 결과, sanguinarine 처리 농도 증가에 따라 미토콘드리아 내 cytochrome c의 발현은 감소된 반면, 세포질에서의 발현 증가가 관찰되었다(Fig.
- HepG2 간암세포의 증식에 미치는 sanguinarine의 영향을 조사하기 위하여 정상세포에서는 세포독성이 없는 범위의 농도[37]로 희석된 배지에서 24시간 동안 배양된 세포들을 대상으로 MTT assay를 실시하였다. Fig.
- 이상에서 관찰된 sanguinarine 처리에 의한 apoptosis 유발 현상과 연관된 몇 가지 기본적인 기전 해석의 일환으로 DR 및 Bcl-2 family에 속하는 주요 인자들의 발현 변화를 조사하였다. 대표적인 apoptosis 유발경로 중, extrinsic pathway의 개시에 관여하는 Fas/FasL 경로[16, 27]에 미치는 sanguinarine의 영향을 조사한 결과, sanguinarine 처리 농도의 증가에 따라 Fas의 발현이 전사 및 번역 수분에서 모두 증가하였다 (Fig.
대상 데이터
- 단백질 분석을 위하여 사용된 Fas, Fas ligand (FasL), Bcl-2, Bcl-xL, Bax, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), cytochrome c 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, cytochrome c oxidase IV (COX IV), Akt, p-Akt, extracellular signal-regulated kinase (ERK), p-ERK, c-jun N-terminal kinase (JNK), p-JNK, p38, p-p38 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Immuno blotting을 위해 2차 항체로 사용된 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse 및 anti-rabbit 항체와 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액은 Amersham Life Science Corp.
- PI3K/Akt 및 MAPKs 신호전달계 각각에 해당되는 억제제들은 CalBiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 에서 구입하였다. 단백질 분석을 위하여 사용된 Fas, Fas ligand (FasL), Bcl-2, Bcl-xL, Bax, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), cytochrome c 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, cytochrome c oxidase IV (COX IV), Akt, p-Akt, extracellular signal-regulated kinase (ERK), p-ERK, c-jun N-terminal kinase (JNK), p-JNK, p38, p-p38 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 sanguinarine (13-methylbenzodi-oxolo[5,6-]-1,3-dioxolo[4,5-I] phenanthridinium)은 Sigma-Aldrich Co. (St.
- 본 실험에 사용한 HepG2 인체 간암세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위해 10% FBS 및 1%의 penicillin/streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하였고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다
- Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 10 mM의 농도로 methanol에 희석한 후, 적정 농도로 배지에 희석하여 처리 하였다. 세포의 배양을 위한 RPMI-1640 배지, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1%의 penicillin/streptomycin은 Gibco BRL (Gaithersburg, NY, USA)에서 구입하였다. 세포증식 측정을 위해 사용된 3-(4,5-dimethyl-2 thiazolyl)-2,5-diphnyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)와 MMP (Δψm) 값의 변화 측정을 위한 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1) 및 ROS의 생성을 억제하기 위하여 사용된 N-ace-tylcysteine (NAC)은 Sigma-Aldrich Co.
- 세포의 배양을 위한 RPMI-1640 배지, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1%의 penicillin/streptomycin은 Gibco BRL (Gaithersburg, NY, USA)에서 구입하였다. 세포증식 측정을 위해 사용된 3-(4,5-dimethyl-2 thiazolyl)-2,5-diphnyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)와 MMP (Δψm) 값의 변화 측정을 위한 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1) 및 ROS의 생성을 억제하기 위하여 사용된 N-ace-tylcysteine (NAC)은 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였다. 단백질 분석을 위하여 사용된 Fas, Fas ligand (FasL), Bcl-2, Bcl-xL, Bax, poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), cytochrome c 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
이론/모형
- Caspases 활성 변화의 측정 Caspase-3, -8 및 -9의 활성 정도는 colorimetric assay kit에 제시된 방법에 준하여 조사하였다. 이를 위하여 준비된 세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정량하여 각각 20 μg의 단백질을 fluorogenic peptide 기질[caspase-3, Asp-Clu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA); caspase-8, Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA; caspase-9, Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA] 100 μM이 함유된 extraction buffer [40 mM HEPES (pH 7.
성능/효과
- 또한 Fig. 3의 결과에서 알 수 있듯이, sanguinarine의 처리에 따라, anti-apoptotic Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현은 큰 변화가 없었으나, pro-apoptotic Bax의 발현이 전사 및 번역 수준에서 모두 증가되었다. 특히 intrinsic pathway에서 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 단백질로 알려진 Bcl-2 family에 속하는 단백질 중, Bcl-2 및 Bcl-xL과 같은 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질은 미토콘드리아 막의 탈분극을 억제하여 막 투과성을 감소시킨다[6, 12].
- 이러한 MMP의 소실이 ROS 생성의 증가에 의한 것인지를 조사하기 위하여 NAC를 선처리 한 후 sanguinarine이 처리한 배지에서 배양된 세포의 MMP 값을 조사한 결과 정상 배지에서 배양된 세포의 값에 매우 근접하게 나타나(Fig. 5A), sanguinarine 처리에 의한 MMP 값의 소실, 즉 미토콘드리아의 기능 소실은 ROS 생성 의존적인 현상임을 알 수 있었다. 아울러 sanguinarine 처리에 의한 apoptosis 유발에 caspase의 활성이 관여하는지의 여부를 조사한 결과, sanguinarine이 처리된 배지에서 배양된 HepG2 세포에서 extrinsic 및 intrinsic pathway의 각 initiator caspase에 해당되는 caspase-8과 -9뿐 만 아니라, 두 pathway의 effector caspase인 caspase-3의 활성 또한 유의적으로 증가되었다(Fig.
- 1B). Sanguinarine에 의한 apoptosis가 caspase 의존적으로 일어나는지를 조사하기 위하여 effector caspase (caspase-3/7)의 대표적인 기질 단백질[14]에 해당되는 PARP의 단편화 여부를 조사한 결과, sanguinarine의 처리 농도가 증가할수록 단편화된 85 kD PARP의 발현이 점차 증가되었다(Fig. 1C).
- 결론적으로 sanguinarine에 의한 HepG2 간암 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었으며, 여기에는 extrinsic 및 intrinsic pathway 동시에 관여할 것으로 추정된다. 아울러 이 과정에는 ROS 생성에 따른 미토콘드리아의 기능 손상이 동반되었으며, 세포 내 PI3K/Akt 및 ERK 신호 전달경로 변화가 동반되었음을 확인할 수 있었다.
- 3의 결과에서 관찰된 sanguinarine 처리에 따른 Bax의 상대적 발현 증가는 미토콘드리아 막 투과성 증가를 일으켜 세포질로의 cytochrome c의 방출을 촉진할 가능성이 높기 때문에[6, 12, 26], 미토콘드리아와 세포질 단백질을 분리하여 cytochrome c 발현의 차이를 비교하였다. 그 결과, sanguinarine 처리 농도 증가에 따라 미토콘드리아 내 cytochrome c의 발현은 감소된 반면, 세포질에서의 발현 증가가 관찰되었다(Fig.4A). 한편 다양한 세포 내, 외 신호에 의하여 발생하는 ROS는 DNA 및 미토콘드리아의 손상을 야기하여 apoptosis 유발 촉진 신호로 작용한다[10, 29].
- 5B). 그러나 NAC의 전처리에 의한 ROS의 생성을 차단한 경우 caspase의 활성은 거의 완벽하게 차단되었으며, PARP의 단편화도 일어나지 않았다(Fig. 5C).
- 이상에서 관찰된 sanguinarine 처리에 의한 apoptosis 유발 현상과 연관된 몇 가지 기본적인 기전 해석의 일환으로 DR 및 Bcl-2 family에 속하는 주요 인자들의 발현 변화를 조사하였다. 대표적인 apoptosis 유발경로 중, extrinsic pathway의 개시에 관여하는 Fas/FasL 경로[16, 27]에 미치는 sanguinarine의 영향을 조사한 결과, sanguinarine 처리 농도의 증가에 따라 Fas의 발현이 전사 및 번역 수분에서 모두 증가하였다 (Fig. 2).
- 따라서 이들 신호계의 제어 현상에 대한 이해는 항암제 발굴 과정에서 해당 후보물질의 세포 내 역할에 대한 많은 정보를 제공하여 준다. 따라서 sanguinarine 처리에 따른 HepG2 세포의 apoptosis 유도 과정에서 이들 신호 전달계의 관여 여부를 부가적으로 조사한 결과, sanguinarine의 처리 시간의 증가에 따라 인산화된 Akt 단백질의 발현은 점차 감소되었으며, MAPKs에 속한 3가지 인자들(ERK, JNK 및 p38)은 다소 시간 차이는 있었으나, sanguinarine 처리에 따라 활성이 증가되었다(Fig. 6A).
- 한편 다양한 세포 내, 외 신호에 의하여 발생하는 ROS는 DNA 및 미토콘드리아의 손상을 야기하여 apoptosis 유발 촉진 신호로 작용한다[10, 29]. 따라서 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 간암세포의 apoptosis 유발이 ROS 생성과 연관성이 있는지의 여부를 조사한 결과, sanguinarine의 처리 15 분부터 ROS의 생성이 증가되어 30 분 처리군에서 ROS의 생성이 가장 높게 나왔으며, 그 이후부터는 점차 감소되는 경향성을 보였다(Fig. 4B).
- 이러한 sanguinarine 처리에 따른 각 kinase의 활성 변화가 apoptosis 유도와 어떤 연관성이 있는지를 조사한 결과, PI3K 및 ERK 저해제(LY294002 및 PD98059)를 처리하여 PI3K/Akt 및 ERK 경로를 인위적으로 차단한 경우 sanguinarine에 의한 증식 억제는 더욱 증가되었지만, JNK 및 p38 저해제(SP600125 및 SB203580)는 sanguinarine에 의한 증식 억제에는 유의적인 영향을 미치지 못하였다. 따라서 대표적인 세포 내 증식억제 신호계인 PI3K/Akt 및 ERK의 활성 저하가 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 세포의 증식억제 및 apoptosis 유도에 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 5A), sanguinarine 처리에 의한 MMP 값의 소실, 즉 미토콘드리아의 기능 소실은 ROS 생성 의존적인 현상임을 알 수 있었다. 아울러 sanguinarine 처리에 의한 apoptosis 유발에 caspase의 활성이 관여하는지의 여부를 조사한 결과, sanguinarine이 처리된 배지에서 배양된 HepG2 세포에서 extrinsic 및 intrinsic pathway의 각 initiator caspase에 해당되는 caspase-8과 -9뿐 만 아니라, 두 pathway의 effector caspase인 caspase-3의 활성 또한 유의적으로 증가되었다(Fig. 5B).
- 결론적으로 sanguinarine에 의한 HepG2 간암 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었으며, 여기에는 extrinsic 및 intrinsic pathway 동시에 관여할 것으로 추정된다. 아울러 이 과정에는 ROS 생성에 따른 미토콘드리아의 기능 손상이 동반되었으며, 세포 내 PI3K/Akt 및 ERK 신호 전달경로 변화가 동반되었음을 확인할 수 있었다.
- 4B). 아울러, sanguinarine 처리에 의한 ROS의 생성은 대표적인 ROS scavenger인 NAC의 전처리에 의하여 현저하게 감소되었다. 이상의 결과는 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 간암세포의 apoptosis 유발에는 ROS의 생성과 미토콘드리아에서 cytochrome c의 유리가 동반되어 있으며, 이는 미토콘드리아의 기능 이상과 연관이 있음을 보여주는 것이다.
- 특히 intrinsic pathway에서 미토콘드리아 막 투과성을 조절하는 단백질로 알려진 Bcl-2 family에 속하는 단백질 중, Bcl-2 및 Bcl-xL과 같은 anti-apoptotic Bcl-2 family 단백질은 미토콘드리아 막의 탈분극을 억제하여 막 투과성을 감소시킨다[6, 12]. 이는 결과적으로 내막과 외막 사이에 존재하는 cytochrome c의 방출을 억제하여 apoptosis를 억제하지만, pro-apoptotic Bax는 미토콘드리아 막으로 이동하여 막 투과성을 증가시킴으로써 cytochrome c의 방출을 촉진하여 apoptosis를 유도하기 때문에 sanguinarine 처리에 의한 apoptosis 유발에 extrinsic 및 intrinsic pathway 모두가 관여할 가능성을 보여주는 결과이다.
- 5C). 이들 결과에서 sanguinarine에 의한 HepG2 간암세포의 apoptosis 유발은 ROS 생성에 의한 미토콘드리아 기능 손상과 이에 따른 extrinsic 및 intrinsic pathway가 동시에 활성화되어 일어나는 현상임을 알 수 있었다.
- 5A). 이러한 MMP의 소실이 ROS 생성의 증가에 의한 것인지를 조사하기 위하여 NAC를 선처리 한 후 sanguinarine이 처리한 배지에서 배양된 세포의 MMP 값을 조사한 결과 정상 배지에서 배양된 세포의 값에 매우 근접하게 나타나(Fig. 5A), sanguinarine 처리에 의한 MMP 값의 소실, 즉 미토콘드리아의 기능 소실은 ROS 생성 의존적인 현상임을 알 수 있었다.
- 6A). 이러한 sanguinarine 처리에 따른 각 kinase의 활성 변화가 apoptosis 유도와 어떤 연관성이 있는지를 조사한 결과, PI3K 및 ERK 저해제(LY294002 및 PD98059)를 처리하여 PI3K/Akt 및 ERK 경로를 인위적으로 차단한 경우 sanguinarine에 의한 증식 억제는 더욱 증가되었지만, JNK 및 p38 저해제(SP600125 및 SB203580)는 sanguinarine에 의한 증식 억제에는 유의적인 영향을 미치지 못하였다. 따라서 대표적인 세포 내 증식억제 신호계인 PI3K/Akt 및 ERK의 활성 저하가 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 세포의 증식억제 및 apoptosis 유도에 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 1A에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이, sanguinarine의 처리 농도가 증가할수록 HepG2 세포의 증식이 유의적으로 감소되었다. 이러한 증식 억제가 apoptosis 유발과 관련성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 annexin V-FITC/PI 염색을 이용한 flow cytometry 분석을 실시한 결과, sanguinarine의 농도가 증가할수록 apoptosis가 유발된 세포(V+ /PI−)의 빈도가 유의적으로 증가되어 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 간암세포의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있음을 알 수 있었다(Fig. 1B).
- 아울러, sanguinarine 처리에 의한 ROS의 생성은 대표적인 ROS scavenger인 NAC의 전처리에 의하여 현저하게 감소되었다. 이상의 결과는 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 간암세포의 apoptosis 유발에는 ROS의 생성과 미토콘드리아에서 cytochrome c의 유리가 동반되어 있으며, 이는 미토콘드리아의 기능 이상과 연관이 있음을 보여주는 것이다.
- 이상의 결과에서 sanguinarine 처리에 의한 HepG2 간암세포의 미토콘드리아 기능 상실 가능성을 보여주었기에, MMP 값에 미치는 sanguinarine의 영향을 JC-1 염색에 의한 flow cytometry 분석[5, 28]으로 조사한 결과, sanguinarine이 함유된 배지에서 배양된 HepG2 세포에서 MMP의 소실이 매우 증가되었다(Fig. 5A).
후속연구
- 2). Fas의 발현 증가는 최소한 FasL와의 결합 촉진 가능성을 높여주는 결과로 해석이 가능하기 때문에 extrinsic pathway의 활성 가능성을 간접적으로 보여주지 것이라 생각된다. 또한 Fig.
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