식물세포배양으로부터 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-디아세틸파클리탁셀의 분리 양상 Separation Behavior of Paclitaxel and Its Semi-synthetic Precursor 10-Deacetylpaclitaxel from Plant Cell Cultures원문보기
본 연구에서는 식물세포배양으로부터 항암물질파클리탁셀 및 이의 반합성전구체 10-디아세틸파클리탁셀의 분리 양상을 조사하였다. 식물세포인 바이오매스를 이용한 분리/정제 공정인 용매를 이용한 바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전을 순차적으로 수행한 결과, 흡착제 처리 공정에서 10-디아세틸파클리탁셀는 파클리탁셀로부터 가장 효과적으로 분리됨을 알 수 있었다. 파클리탁셀 및 10-디아세틸파클리탁셀 분리에 적합한 흡착제 종류, 건조시료/흡착제 비율, 흡착제 처리 온도는 각각 실로퓨트, 1:1.5(w/w), $20^{\circ}C$ 이었다. 최적의 흡착제 처리 조건에서 10-디아세틸파클리탁셀은 74.1% 분리/회수 가능하였다.
본 연구에서는 식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-디아세틸파클리탁셀의 분리 양상을 조사하였다. 식물세포인 바이오매스를 이용한 분리/정제 공정인 용매를 이용한 바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전을 순차적으로 수행한 결과, 흡착제 처리 공정에서 10-디아세틸파클리탁셀는 파클리탁셀로부터 가장 효과적으로 분리됨을 알 수 있었다. 파클리탁셀 및 10-디아세틸파클리탁셀 분리에 적합한 흡착제 종류, 건조시료/흡착제 비율, 흡착제 처리 온도는 각각 실로퓨트, 1:1.5(w/w), $20^{\circ}C$ 이었다. 최적의 흡착제 처리 조건에서 10-디아세틸파클리탁셀은 74.1% 분리/회수 가능하였다.
In this study, we investigated the separation behavior of the anticancer agent paclitaxel and its semi-synthetic precursor 10-deacetylpaclitaxel (10-DAP) from plant cell cultures. As a result of sequential separation/purification performed by biomass extraction with solvent, liquid-liquid extraction...
In this study, we investigated the separation behavior of the anticancer agent paclitaxel and its semi-synthetic precursor 10-deacetylpaclitaxel (10-DAP) from plant cell cultures. As a result of sequential separation/purification performed by biomass extraction with solvent, liquid-liquid extraction, adsorbent treatment, hexane precipitation, and fractional precipitation, the adsorbent treatment was found to be the most effective in separating and recovering 10-DAP from paclitaxel. The optimal adsorbent type, crude extract/adsorbent ratio, and adsorbent treatment temperature were sylopute, 1:1.5 (w/w), and $20^{\circ}C$, respectively. The separation/recovery of 10-DAP from paclitaxel was 74.1% in adsorbent treatment process under optimal conditions.
In this study, we investigated the separation behavior of the anticancer agent paclitaxel and its semi-synthetic precursor 10-deacetylpaclitaxel (10-DAP) from plant cell cultures. As a result of sequential separation/purification performed by biomass extraction with solvent, liquid-liquid extraction, adsorbent treatment, hexane precipitation, and fractional precipitation, the adsorbent treatment was found to be the most effective in separating and recovering 10-DAP from paclitaxel. The optimal adsorbent type, crude extract/adsorbent ratio, and adsorbent treatment temperature were sylopute, 1:1.5 (w/w), and $20^{\circ}C$, respectively. The separation/recovery of 10-DAP from paclitaxel was 74.1% in adsorbent treatment process under optimal conditions.
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문제 정의
기존의 연구들은 분리/정제 과정에서 파클리탁셀의 생산 효율(순도, 수율, 조업시간 등)을 높이는 것에만 대부분 초점이 맞춰져 있었으며 10-DAP의 분리 양상에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 식물세포배양 유래 바이오매스에 존재하는 항암물질 파클리탁셀의 분리/정제 과정에서 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-DAP의 분리 양상을 면밀히 조사하였다. 바이오매스를 이용한 분리/정제 공정인 바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제처리, 헥산침전, 분별침전을 순차적으로 수행한 결과, 흡착제처리공정에서 10-DAP는 파클리탁셀로부터 가장 효과적으로 분리됨을 알 수 있었다.
그러므로 바이오매스에 포함되어 있는 10-DAP의 효율적 활용을 위하여 이에 대한 연구가 절실히 요구된다. 따라서 본 연구에서는 식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀의 분리/정제 과정에서 파클리탁셀뿐만 아니라 이의 반합성 전구체인 10-DAP의 분리 양상을 최초로 조사하여 바이오매스 유래 10-DAP의 효율적 분리/회수를 위한 유용한 정보를 제공하고자 한다.
7%)을 보여 흡착제 처리 공정이 다른 분리/정제 공정에 비해 파클리탁셀과 10-DAP의 분리에 가장 적합함을 알 수 있었다. 따라서 흡착제 처리 공정에서 10-DAP의 분리/회수 효율을 극대화하기 위하여, 흡착제 처리 공정에서의 주요 공정 변수(흡착제 종류, 건조시료/흡착제 비율, 흡착제 처리 온도)에 따른 영향을 조사하였다.
제안 방법
마지막으로 최적의 흡착제 종류 및 건조시료/흡착제 비율에서 흡착제처리 온도(20, 30, 40 ℃)의 영향을 조사하였다. 기존 문헌[17]에 의하면, 흡착제 실로퓨트의 경우 건조시료/실로퓨트 비율 1:1.5(w/w)이상에서 불순물뿐만 아니라 다량의 파클리탁셀이 급격히 흡착되기 때문에 본 연구에서는 건조시료/실로퓨트 비율 1:1.5(w/w)까지만 실험을 수행하였다. 또한 흡착제 처리 온도 40 ℃ 이상에서는 파클리탁셀 분해[15]가 발생할 수 있어 본 연구에서는 40 ℃까지만 실험을 수행하였다.
액-액 추출은 동일한 방법으로 3회 반복하였다. 다량의 극성불순물이 포함된 상층(메탄올 농축액 층)은 제거하고 하층(메틸렌 클로라이드 층)은 회수하여 농축기를 이용하여 감압상태에서 농축 한 후 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하였다.
기존 연구[10-12]에서는 각 분리/정제 공정에 따른 파클리탁셀의 생산효율(순도, 수율, 조업시간 등)을 높이는 것에 초점이 맞춰져 연구되었으며 유용 반합성 전구체인 10-DAP 분리/회수에 대해서는 연구가 전무한 실정이다. 따라서 바이오매스로부터 파클리탁셀 뿐만 아니라 10-DAP의 분리 양상을 면밀히 조사하기 위하여, 식물세포배양으로부터 회수한 바이오매스를 이용하여 다섯 단계의 분리/정제(바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전)공정을 순차적으로 수행하였다[10-12,15,16]. Fig.
5, w/w)에 따른 영향을 조사하였다. 마지막으로 최적의 흡착제 종류 및 건조시료/흡착제 비율에서 흡착제처리 온도(20, 30, 40 ℃)의 영향을 조사하였다. 기존 문헌[17]에 의하면, 흡착제 실로퓨트의 경우 건조시료/실로퓨트 비율 1:1.
식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1(w/v)로 하여 상온에서 30분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출하였다. 메탄올 추출액을 모두 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압상태에서 농축하였다.
식물세포배양 후 배양액으로부터 decanter(Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval,BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(celldebris)을 각각 회수하였다.
식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1(w/v)로 하여 상온에서 30분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출하였다. 메탄올 추출액을 모두 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압상태에서 농축하였다.
식물세포배양으로부터 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-DAP의 분리 양상을 조사하기 위하여, 기존 문헌[10-12,15,16]에 보고된 파클리탁셀의 상업적 대량 분리/정제에 적합한 유기용매를 이용한 바이오매스(파클리탁셀을 함유한 식물세포) 추출, 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전 공정을 이용하였다.
액-액 추출을 통해 얻은 건조시료를 메틸렌 클로라이드에 20%(v/w) 비율로 녹이고 흡착제를 첨가하여 항온조(PS-1000, EYELA,Japan)에서 교반하여 30분 동안 반응시킨 후 여과하였다. 여과액은35 ℃, 감압상태에서 건조하였다.
, Japan)를 이용하여 기존 문헌[15]에 보고된 흡착제 처리 조건(건조시료/흡착제 비율: 1:1(w/w), 온도: 40 ℃)에서 실험을 수행하였다. 최적의 흡착제 종류가 선정되면 흡착제 처리 온도 40 ℃에서 건조시료/흡착제 비율(1:0.5, 1:1, 1:1.5, w/w)에 따른 영향을 조사하였다. 마지막으로 최적의 흡착제 종류 및 건조시료/흡착제 비율에서 흡착제처리 온도(20, 30, 40 ℃)의 영향을 조사하였다.
최적화된 흡착제 처리 조건[흡착제: 실로퓨트, 건조시료/실로퓨트 비율: 1:1.5(w/w), 흡착제 처리 온도: 20 ℃]을 적용하여 다섯 단계의 분리/정제 공정을 수행하였다. Fig.
여과액은35 ℃, 감압상태에서 건조하였다. 파클리탁셀과 10-DAP 분리에 적합한 흡착제 처리 조건을 선정하기 위하여, 먼저 세 종류의 상용흡착제, 실로퓨트(sylopute, Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan), HP-20(Mitsubishi, Japan), 활성백토(active clay, Mizukalife Chemical Co., Japan)를 이용하여 기존 문헌[15]에 보고된 흡착제 처리 조건(건조시료/흡착제 비율: 1:1(w/w), 온도: 40 ℃)에서 실험을 수행하였다. 최적의 흡착제 종류가 선정되면 흡착제 처리 온도 40 ℃에서 건조시료/흡착제 비율(1:0.
흡착제 처리 온도의 영향을 조사하기 위하여, 최적의 흡착제 실로퓨트, 건조시료/실로퓨트 비율 1:1.5(w/w)에서 흡착제 처리 온도를 20, 30, 40 ℃로 변화시켜 실험을 수행하였다. Fig.
본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. Taxus chinensis로부터 기원된 현탁액 세포는 24 ℃ 암조건에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다.
회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.
이론/모형
실험결과에 대한 신뢰성을 확보하기 위하여 오차구간(error bar)을 표시하였다. 파클리탁셀의 단계 수율(step yield)과 총괄 수율(overallyield)은 각각 다음과 같이 정의하였다.
파클리탁셀 및 10-DAP 함량 분석을 위해 HPLC (high performance liquid chromatography) 시스템(SCL-10AVP, Shimadzu, Japan)과 Capell Pak C18 (250×4.6 mm, Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다.
성능/효과
7%)은 흡착제 처리 조건이 최적화 되지 않은 기존의분리/정제 공정(Fig. 1(a))으로부터 얻은 10-DAP의 총괄 수율(흡착제처리: 51.0%, 헥산 침전: 43.2%, 분별 침전: 34.4%)보다 상당히 감소하였다. 즉, 흡착제 처리 조건이 최적화될 경우 10-DAP 분리/회수가 더욱 용이함을 알 수 있었다.
Fig. 5(a)에서 보는 바와 같이 바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전에서 파클리탁셀의 총괄 수율은 각각 100, 99.1, 81.4, 77.4, 74.2%이었으며,10-DAP의 총괄 수율은 각각 100, 89.9, 23.3, 19.7, 15.7%이었다. 또한 Fig.
Fig. 1(a)에서 보는 바와 같이 바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전에서 파클리탁셀의 총괄 수율은 각각 100, 99.1, 87.6, 83.3, 79.9%이었으며, 10-DAP의 총괄 수율은 각각 100, 89.9, 51.0, 43.2, 34.4%를 나타내었다. 다섯 단계의 분리/정제 공정을 거친 파클리탁셀의 총괄수율은 79.
또한 흡착제의 비율이 증가할수록 파클리탁셀보다 10-DAP의 흡착량이 상대적으로 많이 증가하여 10-DAP 단계 수율은 대폭 감소함을 알 수 있었다. 그러므로 흡착제 비율을 증가시키는 것만으로도 흡착제 처리를 통해 10-DAP를 다량 흡착/회수할 수 있어 파클리탁셀과의 분리 효율이 향상됨을 알 수 있었다. 따라서 10-DAP의 분리에 가장 적합한 건조시료/실로퓨트 비율은 1:1.
5(w/w), 20 ℃ 이었다. 다섯 단계의 분리/정제 공정에서 최적의 흡착제 처리를 적용한 결과, 기존의 분리/정제 공정에 비해 paclitaxel로부터 10-DAP 분리/회수 효율이 크게 향상되었으며 최적의 흡착제 처리 조건에서 10-DAP를 74.1% 분리/회수 가능하였다. 이러한 연구결과는 바이오매스 유래 파클리탁셀 반합성 전구체 10-DAP의 효율적 회수를 위한 유용한 정보로 활용될 것으로 판단된다.
4%를 나타내었다. 다섯 단계의 분리/정제 공정을 거친 파클리탁셀의 총괄수율은 79.9%를 나타낸 반면 10-DAP의 총괄 수율은 34.4%를 나타내어 분리/정제 과정에서 10-DAP는 파클리탁셀로부터 상당량 분리/제거되었음을 알 수 있었다. 또한 Fig.
5(w/w) 이상에서부터 흡착제 비율이 증가할수록 파클리탁셀의 수율이 감소한다는 기존의 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다[10]. 또한 흡착제의 비율이 증가할수록 파클리탁셀보다 10-DAP의 흡착량이 상대적으로 많이 증가하여 10-DAP 단계 수율은 대폭 감소함을 알 수 있었다. 그러므로 흡착제 비율을 증가시키는 것만으로도 흡착제 처리를 통해 10-DAP를 다량 흡착/회수할 수 있어 파클리탁셀과의 분리 효율이 향상됨을 알 수 있었다.
따라서 본 연구에서는 식물세포배양 유래 바이오매스에 존재하는 항암물질 파클리탁셀의 분리/정제 과정에서 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-DAP의 분리 양상을 면밀히 조사하였다. 바이오매스를 이용한 분리/정제 공정인 바이오매스 추출, 액-액 추출, 흡착제처리, 헥산침전, 분별침전을 순차적으로 수행한 결과, 흡착제처리공정에서 10-DAP는 파클리탁셀로부터 가장 효과적으로 분리됨을 알 수 있었다. 흡착제 처리 공정에서 10-DAP의 분리/회수에 가장 적합한 흡착제 종류, 건조시료/흡착제 비율, 흡착제 처리 온도는 각각 실로퓨트, 1:1.
분리/정제 공정 중 흡착제 처리에서 가장 낮은 10-DAP의 단계 수율(~56.7%)을 보여 흡착제 처리 공정이 다른 분리/정제 공정에 비해 파클리탁셀과 10-DAP의 분리에 가장 적합함을 알 수 있었다. 따라서 흡착제 처리 공정에서 10-DAP의 분리/회수 효율을 극대화하기 위하여, 흡착제 처리 공정에서의 주요 공정 변수(흡착제 종류, 건조시료/흡착제 비율, 흡착제 처리 온도)에 따른 영향을 조사하였다.
1%의 10-DAP를 분리/회수 가능하였다. 이상의 결과로부터 바이오매스에 존재하는 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-DAP를 효율적으로 분리/회수하기 위하여 흡착제 처리가 핵심 공정임을 알 수 있었다.
7% 보다 상당히 감소하였다. 즉, 흡착제 처리 조건의 최적화로 흡착제 처리를 통해 74.1%의 10-DAP를 분리/회수 가능하였다. 이상의 결과로부터 바이오매스에 존재하는 파클리탁셀 및 이의 반합성 전구체 10-DAP를 효율적으로 분리/회수하기 위하여 흡착제 처리가 핵심 공정임을 알 수 있었다.
4%)보다 상당히 감소하였다. 즉, 흡착제 처리 조건이 최적화될 경우 10-DAP 분리/회수가 더욱 용이함을 알 수 있었다. 또한 최적의 흡착제 처리 공정에서의10-DAP의 단계 수율(Fig.
6%를 나타내었다. 특히 흡착제 처리 공정에서 10-DAP의 단계 수율이 가장 많이 감소(~56.7%)하였으며, 이를 통하여 흡착제 처리 공정이 파클리탁셀과 10-DAP의 분리에 가장 많은 영향을 미치는 것으로 확인하였다.
6%이었다. 흡착제 처리 온도가 높을수록 파클리탁셀의 단계 수율은 소폭 감소한 반면 10-DAP는 소폭 증가하였다. 하지만 전반적으로 온도에 따른 차이는 미미함을 알 수 있었다.
6%이었다. 흡착제의 비율이 증가할수록 파클리탁셀과 10-DAP의 단계 수율은 전반적으로 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 활성백토를 이용한 흡착제처리 공정에서 건조시료/흡착제 비율 1:0.
후속연구
1% 분리/회수 가능하였다. 이러한 연구결과는 바이오매스 유래 파클리탁셀 반합성 전구체 10-DAP의 효율적 회수를 위한 유용한 정보로 활용될 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
파클리탁셀 생산법 중 식물세포배양법의 장점은?
파클리탁셀(paclitaxel)은 주목(yew tree)의 표피에서 발견된 디테르페노이드(diterpenoid)계 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi’s sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer) 등의 치료에 대해 미국 식품의약국(food and drug administration, FDA)허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이다[1]. 파클리탁셀의 주요 생산방법은 주목나무로부터 직접추출법[2], 반합성법[3], 식물세포배양법[4]이 있으며, 이들 중 식물세포배양법은 지역, 기후, 환경 등에 영향을 받지 않고 생물반응기내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량생산할 수 있다는 장점이 있다[5]. 식물세포배양법의 경우 항암물질 파클리탁셀 뿐만 아니라 파클리탁셀의 반합성에 이용될 수 있는 유용 전구체인 10-디아세틸파클리탁셀(10-deacetylpaclitaxel, 10-DAP)도 상당량 생산된다[6].
파클리탁셀은 무엇인가?
파클리탁셀(paclitaxel)은 주목(yew tree)의 표피에서 발견된 디테르페노이드(diterpenoid)계 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi’s sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer) 등의 치료에 대해 미국 식품의약국(food and drug administration, FDA)허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이다[1]. 파클리탁셀의 주요 생산방법은 주목나무로부터 직접추출법[2], 반합성법[3], 식물세포배양법[4]이 있으며, 이들 중 식물세포배양법은 지역, 기후, 환경 등에 영향을 받지 않고 생물반응기내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량생산할 수 있다는 장점이 있다[5].
파클리탁셀 식물 세포배양 공정의 다섯 단계의 분리/정제 공정 중 10-DAP의 분리에 가장 큰 영향을 준 것은?
특히 흡착제 처리 공정에서 10-DAP의 단계 수율이 가장 많이 감소(~56.7%)하였으며, 이를 통하여 흡착제 처리 공정이 파클리탁셀과 10-DAP의 분리에 가장 많은 영향을 미치는 것으로 확인하였다.
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