선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 최근 보고에 따르면 미나리즙이 과산화지질과 알코올을 급여한 흰 쥐에서 혈중 및 간 조직의 지질 함량을 감소시키고, 간 조직에서 항산화 효소의 활성을 증가시켜 알코올성 지방간 및 간 보호 효과에 효능이 있음을 보고하였다(9). 하지만 항염증에 관한 연구는 미흡함에 따라 본 연구에서는 미나리 추출물이 LPS에 의해 염증반응이 유도된 대식세포에서 항염증 작용 및 생리활성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 미나리 에탄올 추출물 및 그 분획물의 항염증 효과를 알아보기 위해서 LPS에 의해 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포에 대해 추출물이 미치는 항염증 효과를 살펴보았다. 미나리 에탄올 추출물은 nuclear factor-κB(NF-κB)의 활성을 억제함으로써 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 감소시켰고, 결과적으로 NO 생성을 억제하였다.
제안 방법
- 또한, real-time PCR 반응 조건은 50°C에서 2분, 95°C에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95°C에서 15초, 어닐링 온도 60°C에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
- 합성된 cDNA 1 μL를 Taqman primer 1 μL, Taqman Universal Master Mix II(Thermo Fisher Scientific) 10 μL, 3차 증류수 8 μL와 함께 real-time PCR을 수행하였다.
- 5 μg의 total RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 cDNA로 합성하였다.
- 이 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 현탁액과 헥산을 1:1 비율로 분획 깔때기에 넣고 헥산층과 물층으로 분획하였으며, 분획된 헥산층을 다시 감압 농축하여 시료를 얻었다. 이상의 동일한 과정을 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 가하여 각각 분획물을 얻었고, 농축이 완료된 추출물은 동결건조기(Ilsin, Incheon, Korea)를 이용하여 건조 시료로 제조하였다.
- 미나리 용매별 추출물 및 분획물의 RAW 264.7 cell에 대한 세포독성 효과를 측정하기 위해 MTS assay를 실시하였다. 96 well plate에 3×105 cells/well로 분주하고 미나리 용매별 분획물을 농도별로 처리하였다.
- 미나리 용매별 추출물 및 분획물을 농도별로 전처리하고 30분 후에 LPS(500 ng/mL)를 각 세포에 처리하여 24시간 후 배양액에 분비된 NO를 측정하였다. 96 well plate에 세포 배양액과 Griess reagent(Promega)를 1:1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Infinite 200 pro, TECAN)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 세포를 6 cm 배양 용기에 1×105 cells/dish 씩 분주한 후 24시간 배양하여 세포를 안정화시켰다. 미나리 용매별 분획물을 농도별로 세포에 전처리하고 30분 후에 LPS(500 ng/mL)를 처리한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 Tripure Isolation Reagent(Roche)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 5 μg의 total RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용해 cDNA로 합성하였다.
- 미나리 용매별 분획물을 농도별로 처리한 실험군과 대조군을 iNOS, COX-2는 24시간 배양 IκBα, p-IκBα는 30분 배양 후 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 2mM phenyl-methylsulfonyl fluoride, protease inhibitors(completeTM, Roche), 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF과 10 mM EDTA를 함유하는 완충제를 사용하여 세포를 용해시켰다.
- 따라서 추출물 단독 처리에 의한 NO 생성 정도를 측정하기 위해 RAW 264.7 세포에 미나리 추출물을 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/ mL의 농도로 세포에 처리하고 미나리 추출물에 의한 NO 생성 억제 효과를 보기 위해 미나리 추출물을 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 세포에 전처리한 후 LPS 를 24시간 동안 처리하여 이로 인해 생성되는 NO 양을 측정하였다.
- IκBα의 degradation 정도를 확인하기 위하여 immunofluorescence 실험방법을 이용하여 IκBα와 핵을 염색하여 단백질의 양을 측정하였다.
- 1% Tween 20+TBS) 용액을 사용하여 상온에서 2시간 동안 blocking을 실시하였다. iNOS, COX-2, GAPDH에 대한 1차 항체를 membrane에 노출시키고 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit 또는 anti-mouse IgG를 반응시키고 ECL detection reagents(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
- 그런 후에 1% BSA에 든 anti-IκBα(1:100) 및 DAPI를 처리하고 4°C에서 밤새 반응 하였다. 그 후 마지막으로 PBS로 3회 세척 후 cover slip을 fluorescence solution(DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)으로 고정한 다음 fluorescence microscope(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.
- 미나리 에탄올 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 후 MTS로 세포 생존율을 관찰하였다. 그 결과 500 μg/mL 이상에서 세포독성이 있는 게 관찰되었고, 1,000 μg/mL 농도에서는 20% 이상의 독성이 관찰되었다(Fig.
- NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 Immunoblot 분석을 이용하여 세포질 내의 iNOS 단백질 발현량을 조사하였다. LPS 처리 시에는 iNOS 단백질이 발현이 강하게 유도되었으나, LPS에 미나리 에탄올 추출물을 62.
- 미나리 용매별 분획물을 62, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 RAW 264.7 cell에 처리하고 24시간 후 MTS로 세포 생존율을 관찰하였다.
- 미나리 에탄올 추출물의 항염증 효과를 규명함에 따라 미나리 에탄올 추출물의 용매별 분획물에 대한 항염증 효과를 조사하기 위해 세포독성 및 NO 생성을 분석하였다. 미나리 용매별 분획물을 62, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 RAW 264.
- 미나리 용매별 분획물이 NO 생성 억제기작에 관여하는지 알아보기 위해 immunoblot 분석을 이용하여 세포질 내에 iNOS와 COX-2 단백질의 발현량을 조사하였다. LPS 처리 시에는 iNOS 단백질의 발현이 높게 증가하였고, LPS를 처리하기 전 미나리 용매별 분획물을 62.
- 미나리 용매별 분획물을 전처리한 후 LPS로 자극하여 24시간 후에 세포를 수집하고 세포 내 mRNA를 추출 분리 하여 real time-PCR 방법을 이용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 mRNA 발현량을 확인해 보았다.
- 미나리 용매별 분획물이 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도되는 각종 전염증성 및 염증성 cytokine들의 발현에 대한 영향을 조사하기 위하여 전염증성 및 염증성 cytokine의 mRNA 발현에 대한 미나리 용매별 분획물의 영향을 관찰하였다. 미나리 용매별 분획물을 전처리한 후 LPS로 자극하여 24시간 후에 세포를 수집하고 세포 내 mRNA를 추출 분리 하여 real time-PCR 방법을 이용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 mRNA 발현량을 확인해 보았다.
- 미나리 용매별 추출물 및 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위해 western blot을 이용하여 iNOS와 COX-2, IκBα, 미나리 용매별 추출물 및 분획물의 항염증 효과를 확인하기 위해 western blot을 이용하여 iNOS와 COX-2, IκBα, p-IκBα 단백질의 발현 정도를 분석하였다.
- 본 실험에서는 IκBα의 phosphorylated form을 측정하여 IκBα degradation에 의한 NF-κB 기전을 확인하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)과 fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin은 Gibco/ BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS, CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay), Griess reagent system은 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다.
- 연구에 사용한 마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 penicillin/streptomycin 100 unit/mL와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건 하에 incubator에서 배양하였다.
- 미나리 원시료는 미나리재배농가인 전주 미나리 작목반에서 생산하는 논미나리를 100 g 구입하여 적용하였다. 구입한 미나리 100 g을 대형 건열 건조기(SAM-DR 1700, Samgongsa, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 60°C에서 4일간 건조를 하였고, 그중 건조된 미나리 30 g을 micro hammer- cutter mill(MHK Trading Co.
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)과 fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin은 Gibco/ BRL(Eggenstein, Germany)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS, CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay), Griess reagent system은 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. Tripure Isolation Reagent는 Roche(Basel, Switzerland)에서 구입하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Taqman Universal Master Mix II, Alexa Fluor 514 antibody는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.
- Tripure Isolation Reagent는 Roche(Basel, Switzerland)에서 구입하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Taqman Universal Master Mix II, Alexa Fluor 514 antibody는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. iNOS, COX-2, GAPDH, IκBα, p-IκBα antibodies는 Cell Signaling Technology Inc.
- 합성된 cDNA 1 μL를 Taqman primer 1 μL, Taqman Universal Master Mix II(Thermo Fisher Scientific) 10 μL, 3차 증류수 8 μL와 함께 real-time PCR을 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 http://www.life technologies.com에서 주문 후 사용하였고, 분석하고자 하는 유전자 특이적 gene의 정보는 Table 1에 나타내었다. 또한, real-time PCR 반응 조건은 50°C에서 2분, 95°C에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95°C에서 15초, 어닐링 온도 60°C에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
- 구입한 미나리 100 g을 대형 건열 건조기(SAM-DR 1700, Samgongsa, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 60°C에서 4일간 건조를 하였고, 그중 건조된 미나리 30 g을 micro hammer- cutter mill(MHK Trading Co., Bucheon, Korea)을 이용하여 50 mesh로 분쇄하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치±표준편차(mean±SD)로 나타내고, 각 실험군과의 유의성의 차이는 SPSS(18.0, Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA) 통계 패키지 프로그램을 활용 Duncan's multiple range test로 분석하여 P-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 세포 용해액을 15,000×g로 4°C에서 30 분간 원심분리하여 단백질이 포함된 상층액을 얻은 후 Bradford method를 이용해 정량하였다.
성능/효과
- LPS만 처리한 군에서는 미나리 에탄올 추출물 단독 처리군과 비교하여 NO의 생성량이 현저하게 증가하였으며, 미나리 에탄올 추출물을 전처리하고 LPS를 처리한 실험군에서는 62.5 μg/mL 이상에서 농도 의존적으로 유의성 있게 NO의 생성을 억제하였다(Fig. 2).
- 그 결과 500 μg/mL 이상에서 세포독성이 있는 게 관찰되었고, 1,000 μg/mL 농도에서는 20% 이상의 독성이 관찰되었다(Fig. 1).
- LPS 처리 시에는 iNOS 단백질이 발현이 강하게 유도되었으나, LPS에 미나리 에탄올 추출물을 62.5 μg/mL 이상 처리한 실험군에서 LPS에 의한 iNOS의 발현량이 농도 의존적으로 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
- 2). 이러한 결과를 통해 미나리 에탄올 추출물이 NO를 효과적으로 억제함으로써 항염증 기능에 관여하는 것을 확인하였다.
- 또한, LPS만 처리한 군에서는 COX-2 발현량이 강하게 유도되었으나, 62.5, 125, 250, 500 μg/mL 미나리 에탄올 추출물 전처리로 LPS에 의한 COX-2 발현량이 농도 의존적으로 현저히 줄어들었다(Fig. 3).
- 미나리 부탄올 분획물은 세포독성이 없고 생존율이 올라가는 경향을 보였으며, 미나리 헥산 분획물은 125 μg/mL 농도 이상에서 세포독성이 나타났으며, 메틸렌클로라이드와 에틸아세테이트는 1,000 μg/mL 농도에서 세포독성이 RAW 264.7 cell에서 세포독성이 관찰되었다(Fig. 5).
- 결과적으로 미나리 에탄올 추출물은 전사인자인 NF-κB 의 활성화를 감소시키고, downstream signaling molecule 인 iNOS와 COX-2의 전사를 억제하며, NO의 생성을 감소시켜 항염증 효과를 가짐을 유추할 수 있었다.
- IκBα의 phosphorylated form과 total form의 발현 양상을 살펴본 결과 p-IκBα의 발현량이 증가함에 따라 상대적으로 IκBα 발현량이 감소하는 것을 관찰하였다.
- RAW 264.7세포에 LPS 처리 시 p-IκBα 발현이 증가하였고, 62.5, 125, 250, 500 μg/mL 미나리 에탄올 추출물을 전처리했을 때 LPS에 의해 증가한 p-IκBα 발현량을 억제시켰다(Fig. 3).
- 미나리 용매별 분획물을 62.5, 125, 250, 500 μg/mL의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO 양을 측정하였을 때 LPS 단독 처리군은 미나리 용매별 분획물 단독 처리군과 비교하여 NO의 생성량이 현저하게 증가하였으며, 미나리 헥산 분획물을 전처리하고 LPS를 처리한 실험군에서는 62.5 μg/mL 이상에서 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제하였지만 세포독성에 따른 NO의 감소인 것을 확인하고 추후 실험에서 제외하였다.
- 그뿐만 아니라 LPS 처리 시 증가한 COX-2 발현량이 미나리 에틸아세테이트 분획물 전처리 그룹에서 62.5, 125, 250, 500 μg/mL 농도의 미나리 용매별 분획물 전처리에 따라 현저히 감소하였다(Fig. 7B).
- LPS 처리 시에는 iNOS 단백질의 발현이 높게 증가하였고, LPS를 처리하기 전 미나리 용매별 분획물을 62.5 μg/mL 이상 전처리한 실험군에서 LPS에 의한 iNOS의 발현량이 농도 의존적으로 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7A).
- 6). 이를 바탕으로 미나리 에탄올 추출물의 용매별 분획물 중 메틸렌클로라이드 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서만 항염증 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
- 7A). 메틸렌클로라이드 그룹에 비해 에틸아세테이트 그룹이 낮은 농도에서도 iNOS의 발현량을 확연히 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 그뿐만 아니라 LPS 처리 시 증가한 COX-2 발현량이 미나리 에틸아세테이트 분획물 전처리 그룹에서 62.
- 이러한 결과를 종합해 볼 때 미나리 용매별 분획물 중 에틸아세테이트 그룹이 iNOS 및 COX-2의 발현을 가장 강하게 저해함으로써 NO의 생성을 억제함에 따라 항염증 효과를 나타낸다고 생각한다.
- 미나리 에틸아세테이트 분획물 처리군에서 TNF-α는 LPS 단독처리군과 비교하여 125 μg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 감소하였고, IL-6, IL-1β는 62.5 μg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 상기의 mRNA 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 그 결과 미나리 메틸렌클로라이드 분획물 처리군에서 TNF-α는 LPS 단독처리군과 비교하여 차이가 없었으며, IL-6는 500 μg/mL 농도에서 유의성 있게 감소한 것을 확인할 수 있었고, IL-1β는 62.5 μg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 상기의 mRNA 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.
- 미나리 에탄올 추출물은 nuclear factor-κB(NF-κB)의 활성을 억제함으로써 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 감소시켰고, 결과적으로 NO 생성을 억제하였다.
- 8). 실험 결과 에틸아세테이트 분획물 처리군에서 염증 관련 mRNA의 발현이 감소된 것으로 미루어 보아 에틸아세테이트 분획물에서 염증 관련 mRNA를 감소시킬 수 있는 생리활성 물질이 다량 함유된 것을 확인할 수 있었다.
- 미나리 에탄올 추출물은 nuclear factor-κB(NF-κB)의 활성을 억제함으로써 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 감소시켰고, 결과적으로 NO 생성을 억제하였다. 또한, 미나리 에탄올 추출물의 헥산, 부탄올, 에틸아세테이트 그리고 메틸렌클로라이드 분획물을 처리했을 때 에틸아세테이트와 메틸렌 클로라이드 분획물 전처리 실험군에서 LPS에 의해 유도된 NO의 형성이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 그중 미나리 에틸아세테이트 분획물은 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량 및 전염증성 사이토카인을 현저히 감소시킴에 따라 우수한 항염증 효과를 확인하였다.
- 또한, 미나리 에탄올 추출물의 헥산, 부탄올, 에틸아세테이트 그리고 메틸렌클로라이드 분획물을 처리했을 때 에틸아세테이트와 메틸렌 클로라이드 분획물 전처리 실험군에서 LPS에 의해 유도된 NO의 형성이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 그중 미나리 에틸아세테이트 분획물은 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량 및 전염증성 사이토카인을 현저히 감소시킴에 따라 우수한 항염증 효과를 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 미나리 에탄올 추출물, 그 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 염증을 완화시키는 유효성분이 많은 것을 규명하였고 향후 에틸아세테이트 분획물에서 어떠한 유효성분이 있는 지에 대해 추후 실험이 필요할 것으로 보인다.
후속연구
- 그중 미나리 에틸아세테이트 분획물은 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량 및 전염증성 사이토카인을 현저히 감소시킴에 따라 우수한 항염증 효과를 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 미나리 에탄올 추출물, 그 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 염증을 완화시키는 유효성분이 많은 것을 규명하였고 향후 에틸아세테이트 분획물에서 어떠한 유효성분이 있는 지에 대해 추후 실험이 필요할 것으로 보인다. 또한, 이러한 항염증 효능을 규명함으로써 향후 기능성 식품 소재로의 이용 가능성을 제시한다.
- 따라서 본 연구 결과는 미나리 에탄올 추출물, 그 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 염증을 완화시키는 유효성분이 많은 것을 규명하였고 향후 에틸아세테이트 분획물에서 어떠한 유효성분이 있는 지에 대해 추후 실험이 필요할 것으로 보인다. 또한, 이러한 항염증 효능을 규명함으로써 향후 기능성 식품 소재로의 이용 가능성을 제시한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.