꽃지누아리 에탄올 추출물의 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 항염증 효과 Anti-Inflammatory Effect of Grateloupia imbricata Holmes Ethanol Extract on LPS-Induced RAW 264.7 Cells원문보기
본 연구에서는 홍조류인 꽃지누아리 에탄올 추출물(GIHEE)의 항염증 활성을 확인하기 위해 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 분비되는 염증매개성 물질들의 발현량 억제를 관찰하여 추출물의 항염증 활성을 탐색하고자 하였다. 그 결과 GIHEE 50 및 $100{\mu}g/mL$ 농도 처리 시 LPS로 유도된 염증반응에서 NF-${\kappa}B$ 활성 억제와 더불어 MAPKs의 인산화를 효과적으로 억제함을 보였다. 염증반응 매개인자들인 NO 및 염증성 사이토카인의 생성도 효과적으로 제어함을 보였으며, 특히 GIHEE $50{\mu}g/mL$ 농도에서 TNF-${\alpha}$ 및 IL-$1{\beta}$ 분비량은 각각 약 51% 및 30% 이상, IL-6 분비량은 $100{\mu}g/mL$에서 약 54% 이상의 높은 분비량 감소를 나타내었다. 따라서 GIHEE는 이들 염증매개성 물질들의 활성을 효과적으로 억제함으로써 항염증 활성을 나타내었으며, 염증성 질병의 예방 및 치료에 효과적인 기능성 소재로의 가능성이 충분하다고 사료된다.
본 연구에서는 홍조류인 꽃지누아리 에탄올 추출물(GIHEE)의 항염증 활성을 확인하기 위해 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 분비되는 염증매개성 물질들의 발현량 억제를 관찰하여 추출물의 항염증 활성을 탐색하고자 하였다. 그 결과 GIHEE 50 및 $100{\mu}g/mL$ 농도 처리 시 LPS로 유도된 염증반응에서 NF-${\kappa}B$ 활성 억제와 더불어 MAPKs의 인산화를 효과적으로 억제함을 보였다. 염증반응 매개인자들인 NO 및 염증성 사이토카인의 생성도 효과적으로 제어함을 보였으며, 특히 GIHEE $50{\mu}g/mL$ 농도에서 TNF-${\alpha}$ 및 IL-$1{\beta}$ 분비량은 각각 약 51% 및 30% 이상, IL-6 분비량은 $100{\mu}g/mL$에서 약 54% 이상의 높은 분비량 감소를 나타내었다. 따라서 GIHEE는 이들 염증매개성 물질들의 활성을 효과적으로 억제함으로써 항염증 활성을 나타내었으며, 염증성 질병의 예방 및 치료에 효과적인 기능성 소재로의 가능성이 충분하다고 사료된다.
Algae is a potential resource with various biological activities. In this study, the anti-inflammatory effect of Grateloupia imbricata Holmes ethanol extract (GIHEE) from red algae was investigated in LPS-induced RAW 264.7 cells. As a result, reduced secretion of pro-inflammatory cytokines [tumor ne...
Algae is a potential resource with various biological activities. In this study, the anti-inflammatory effect of Grateloupia imbricata Holmes ethanol extract (GIHEE) from red algae was investigated in LPS-induced RAW 264.7 cells. As a result, reduced secretion of pro-inflammatory cytokines [tumor necrosis factors-${\alpha}$, interleukin (IL)-$1{\beta}$, and IL-6] and nitric oxide (NO) was observed in a dose-dependent manner. Expression of nuclear factor-kappaB (NF-${\kappa}B$) as well as inducible NO synthase and cyclooxygenase-2 proteins was reduced by GIHEE, suggesting that the anti-inflammatory activity of GIHEE is related to suppression of NF-${\kappa}B$ signaling pathways. In addition, GIHEE reduced phosphorylation of mitogen-activated protein kinases. These results suggest that GIHEE can be used as a potential anti-inflammatory therapeutic.
Algae is a potential resource with various biological activities. In this study, the anti-inflammatory effect of Grateloupia imbricata Holmes ethanol extract (GIHEE) from red algae was investigated in LPS-induced RAW 264.7 cells. As a result, reduced secretion of pro-inflammatory cytokines [tumor necrosis factors-${\alpha}$, interleukin (IL)-$1{\beta}$, and IL-6] and nitric oxide (NO) was observed in a dose-dependent manner. Expression of nuclear factor-kappaB (NF-${\kappa}B$) as well as inducible NO synthase and cyclooxygenase-2 proteins was reduced by GIHEE, suggesting that the anti-inflammatory activity of GIHEE is related to suppression of NF-${\kappa}B$ signaling pathways. In addition, GIHEE reduced phosphorylation of mitogen-activated protein kinases. These results suggest that GIHEE can be used as a potential anti-inflammatory therapeutic.
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문제 정의
또한 COX-2는 cytokine, 자외선, 세균성 내독소 등에 의해 과잉 발현되어 각종 퇴행성 질환의 발병과 진행에 영향을 미치며, 특히 COX-2의 생성 및 활성 저해로 인해 체내에 발생하는 PGE2등의 염증인자 등과 관련된 염증반응을 촉진한다(28). 따라서 본 실험에서는 GIHEE가 세포질 내에서의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blot 방법을 시행하였다. 그 결과 RAW 264.
꽃지누아리에 관한 연구는 지리적 특성에 따른 지누아리(Grateloupia)속의 계통 분류에 대해 주로 보고가 되고 있으나(14,15), 생리활성에 관한 연구는 미미한 편이다. 따라서 본 연구에서는 꽃지누아리를 대상으로 에탄올 추출물로부터 항염증 활성을 확인하고, 염증성 질환의 예방과 치료제 개발의 기초자료탐색 및 식품산업에서 항염증 활성을 갖는 기능성 식품으로의 가능성을 밝히고자 하였다.
체내에 생성된 NO는 적절한 수준에서는 혈소판억제, 면역조절, 신경전달, 혈관확장 등의 역할을 하지만 과도한 NO의 증가는 염증성 질환을 발생시킬 수 있으며 산소와 결합하여 생성된 peroxynitrite는 세포와 조직에 산화적 손상을 입히게 된다(22). 따라서 생리적 수준의 NO 농도를 유지하는 것은 매우 중요하며, 본 연구에서는 GIHEE의 항염증 효과를 확인하기 위하여 LPS를 이용하여 RAW 264.7 세포에 염증을 유도해 NO를 과량 생성하는 조건을 만들고 GIHEE를 처리하여 NO 생성이 억제되는지 관찰하였다(Fig. 2). LPS 단독 처리군은 LPS를 처리하지 않은 처리군에 비해 약 84% 이상 증가하여 LPS에 의하여 염증반응이 충분히 활성화가 된 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 홍조류인 꽃지누아리 에탄올 추출물(GIHEE)의 항염증 활성을 확인하기 위해 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 분비되는 염증매개성 물질들의 발현량 억제를 관찰하여 추출물의 항염증 활성을 탐색하고자 하였다. 그 결과 GIHEE 50 및 100 μg/mL 농도 처리 시 LPS로 유도된 염증반응에서 NF-κB 활성 억제와 더불어 MAPKs의 인산화를 효과적으로 억제함을 보였다.
제안 방법
LPS에 의해 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포로부터 생성된 염증 관련 사이토카인의 분비량을 측정하기 위해 DMEM 배지를 이용하여 2.5×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 5% CO2 incubator에서 18시간 전 배양한 후 1 μg/mL의 LPS와 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL의 GIHEE를 처리하여 12시간 재배양하였다.
MAPKs의 발현량을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포를 1×106 cells/mL로 18시간 전 배양하고 GIHEE를 처리하여 30분 동안 본 배양한 후 iNOS, COX-2 및 NF-κB와 같은 방법으로 이후의 실험을 진행하였다.
RAW 264.7 세포를 1×106 cells/mL 농도로 well plate에 분주하고 20시간 전 배양 후, 1 μg/mL의 LPS와 꽃지누아리 에탄올 추출물(GIHEE)을 농도별(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL)로 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-15AC, Sanyo)에서 22시간 본 배양하였다.
RAW 264.7 세포의 생존율을 MTT assay를 통해 측정하여 GIHEE 농도별(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL) 세포독성을 비교하였다(Fig. 1).
iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 NF-κB p65의 발현량을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 NF-κB p65를 사용하여 1:500으로 희석하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다.
이를 4℃, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 그 후 각 well에 dimethyl sulfoxide를 첨가하고 이를 microplate reader(Model 550, Bio-Rad, Richmond, VA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도(optical density, O.D.)를 측정하였다. 세포증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.
꽃지누아리 건조 분말에 10배의 95% 에탄올을 가하고, 교반기(H-0820, Dongwon Science Co., Busan, Korea)를 이용하여 24시간 동안 상온에서 교반하여 추출하였다. 원심분리기(UNION 32R, Hanil Co.
따라서 GIHEE가 RAW 264.7 세포에 독성을 보이지 않는 것을 확인하고 0.1, 1, 10, 50 및 100 μg/mL 농도의 GIHEE를 처리하여 항염증 활성에 대해 측정하였다.
반응 후 PBST로 세척하고 희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 분주하여 실온에서 1시간 반응시켰다.
따라서 인체 내 염증반응에서 이들 전염증성 사이토카인들의 발현량을 조절하는 것은 중요하다. 본 실험에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인의 발현 정도를 ELISA kit을 통해 알아보았다. 그 결과(Fig.
1% naphthalenediamine dihydrochloride, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite(NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
세포배양액 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 사이토카인의 분비량을 ELISA kit(Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
, Busan, Korea)를 이용하여 24시간 동안 상온에서 교반하여 추출하였다. 원심분리기(UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)를 이용하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 취하였고, 이후 남은 잔사를 이와 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다. 추출한 상층액은 37℃에서 감압농축기(RE200, Yamoto Co.
7 세포를 1×106 cells/mL로 18시간 전 배양하고 GIHEE를 처리하여 30분 동안 본 배양한 후 iNOS, COX-2 및 NF-κB와 같은 방법으로 이후의 실험을 진행하였다. 인산화된 p38 protein kinase(p38), extracellular signal-regulated kinase(ERK),c-Jun N-terminal kinase(JNK) 및 p38, ERK, JNK의 발현량을 검토하기 위하여 anti-mouse p-p38, p-ERK, p-JNK, p38, ERK, JNK(Cell Signalling Technology Inc., Danvers, MA, USA) 항체를 1:500으로 희석하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 꽃지누아리(Grateloupia imbricataHolmes)는 부산 기장군 연화리에서 채취한 것으로 담수로 깨끗하게 수세한 후 동결건조 하여 분말화하고 진공 포장상태로 -20℃에서 저장하며 사용하였다.
7 세포(KCLB 40071)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에 10% inactivated fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는 80~90% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였고 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.
데이터처리
실험 결과의 통계 처리는 SAS program(Statistical Analytical System V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 평균값을 분산분석한 후, Duncan의 다중검정법으로 P<0.05 수준에서 항목 간의 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 NF-κB p65의 발현량을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 NF-κB p65를 사용하여 1:500으로 희석하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다. 2차 항체로 horseradish peroxidase가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 다음 TBSS로 3회 세정하여 ECL 기질과 1~3분간 반응 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool(GeneGnome5, Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여 가시화하였다.
BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질을 정량하였으며 30 μL의 lysate를 Laemmli(19)의 방법을 사용하여 10% SDS-PAGE로 분리하였다.
1, 1, 10, 50, and 100 μg/mL) for 24 h. Cell proliferation was determined by MTT assay. Proliferation index (%)=(sample O.
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(17). RAW 264.
세포질 내 생성되는 iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 세포핵 내 NF-κB p65의 발현량에 GIHEE가 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot을 이용하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후 Sheeba와 Asha(18)의 방법에 따라 실험을 진행하였다. iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65의 경우 cytosol lysis buffer[50 mM HEPES(pH 7.
BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질을 정량하였으며 30 μL의 lysate를 Laemmli(19)의 방법을 사용하여 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 Towbin 등(20)의 방법을 참고하여 polyvinylidene difluoride membrane(Bio-Rad)에 1시간 동안 전사시켜 5% skim milk가 포함된 tris buffered saline(TBSS, pH7.5) 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 하였다. iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 NF-κB p65의 발현량을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 NF-κB p65를 사용하여 1:500으로 희석하고 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다.
세포질 내 생성되는 iNOS, COX-2, phospho-NF-κB p65 및 세포핵 내 NF-κB p65의 발현량에 GIHEE가 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot을 이용하였다.
성능/효과
2). LPS 단독 처리군은 LPS를 처리하지 않은 처리군에 비해 약 84% 이상 증가하여 LPS에 의하여 염증반응이 충분히 활성화가 된 것을 알 수 있었다. LPS와 GIHEE를 농도별(0.
LPS와 GIHEE를 농도별(0.1, 1, 10, 50, 100 μg/mL)로 함께 처리한 군에서는 NO 생성 억제 활성을 보였으며, 100 μg/mL로 처리하였을 경우 LPS 처리군과 비교 시약 25% 감소함을 보였다.
그 결과 GIHEE 50 및 100 μg/mL 농도 처리 시 LPS로 유도된 염증반응에서 NF-κB 활성 억제와 더불어 MAPKs의 인산화를 효과적으로 억제함을 보였다.
그 결과 RAW 264.7 세포에 LPS(1μg/mL)를 처리하였을 경우 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현이 확연히 증가하였고, GIHEE 처리로 단백질 발현이 감소한 것을 확인하였다(Fig. 4).
1). 그 결과 모든 처리 농도에서 negative control 군과 비교 시 세포 생존율이 유의적인 차이를 보이지 않았음을 확인하였다. 따라서 GIHEE가 RAW 264.
그 결과(Fig. 3A-C) LPS를 처리한 대조군에서는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비량이 각각 1,584.51, 59.95 및 407.78 pg/mL로 높은 분비량을 보였으나 GIHEE를 처리하였을 경우 그 분비량이 농도 의존적으로 감소함을 나타내었다.
염증반응 매개인자들인 NO 및 염증성 사이토카인의 생성도 효과적으로 제어함을 보였으며, 특히 GIHEE 50 μg/mL 농도에서 TNF-α 및 IL-1β 분비량은 각각 약 51% 및 30% 이상, IL-6 분비량은 100 μg/mL에서 약 54% 이상의 높은 분비량 감소를 나타내었다. 따라서 GIHEE는 이들 염증매개성 물질들의 활성을 효과적으로 억제함으로써 항염증 활성을 나타내었으며, 염증성 질병의 예방 및 치료에 효과적인 기능성 소재로의 가능성이 충분하다고 사료된다.
활성화된 ERK는 다양한 전사인자를 인산화할 수 있으며, JNK 신호전달 경로는 LPS나 TNF-α와 같은 염증유발 인자에 반응하는 세포에서 활성화되고 세포의 형태적 증대와 사이토카인의 전사에 관여한다(32). 따라서 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에 대해GIHEE가 JNK, ERK, p38의 인산화에 미치는 영향을 살펴본 결과(Fig. 5) LPS 처리군에서는 대조군보다 발현량이 확연히 증가하였으나, LPS와 GIHEE를 함께 처리한 경우 LPS 처리군에 비해 MAPKs의 인산화가 농도 의존적으로 감소하는 결과를 나타내었다. 이 결과는 잘피 에탄올 추출물의 항염증 활성 효과에서 추출물 농도 의존적으로 MAPKs의 인산화 농도가 감소함을 보인 것과 유사하다(33).
염증반응 매개인자들인 NO 및 염증성 사이토카인의 생성도 효과적으로 제어함을 보였으며, 특히 GIHEE 50 μg/mL 농도에서 TNF-α 및 IL-1β 분비량은 각각 약 51% 및 30% 이상, IL-6 분비량은 100 μg/mL에서 약 54% 이상의 높은 분비량 감소를 나타내었다.
이 결과는 잘피 에탄올 추출물의 항염증 활성 효과에서 추출물 농도 의존적으로 MAPKs의 인산화 농도가 감소함을 보인 것과 유사하다(33). 위의 결과를 종합해볼 때 GIHEE 처리가 LPS로 유도된 염증성 사이토카인, iNOS 및 COX-2와 같은 상기 인자들의 활성화와 관련하여 MAPKs 신호전달 경로를 효과적으로 억제함으로써 항염증 작용을 하는 것으로 보인다.
이 결과는 GIHEE가 대식세포에서 LPS에 의해 활성화되는 NF-κB signaling을 저해하고 전사인자로부터 증가하는 다양한 염증매개물들이 단백질 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 보인 것으로 생각된다.
인산화된 NF-κB p65 및 NF-κB p65는 LPS 처리로 증가하였으며, GIHEE 처리 시 농도가 증가함에 따라 발현이 감소하였다.
특히 50 및 100 μg/mL의 농도에서 NF-κB p65 단백질 발현이 효과적으로 억제됨을 확인하였다.
특히 GIHEE 50 μg/mL 농도에서 TNF-α 및 IL-1β분비량이 각각 약 51% 및 30% 이상 감소함을 보였으며,IL-6 분비량은 가장 높은 처리 농도인 100 μg/mL에서 약 54% 이상의 분비량 감소를 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대식세포는 어떻게 염증반응에 관여하는가?
염증반응의 대표적 증상으로는 열, 부종, 홍반 등이 있으며 이는 손상된 부위를 회복시키는 생체 방어 기작으로 염증매개인자의 활성화에 따라 나타난다(2). 대식세포는 능동 및 수동 면역반응에서 매우 중요한 역할을 하며 lipopolysaccharide(LPS)의 자극에 의하여 활성화되어 interleukin-6(IL-6), tumor necrosis factor-α(TNF-α) 및 IL-1β 등의 염증매개 사이토카인을 생성하여 염증반응에 관여하게 된다(3). 또한 활성화된 대식세포는 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2)와 같은 효소를 생산하며 각각 nitric oxide(NO) 및 prostaglandin E2(PGE2)와 같은 다양한 염증 매개들을 생산하여 숙주에 치명적인 결과를 초래한다고 알려졌다(4).
본 연구에서 꽃지누아리 에탄올 추출물은 어떤 항염증 효과를 보였는가?
7 세포로부터 분비되는 염증매개성 물질들의 발현량 억제를 관찰하여 추출물의 항염증 활성을 탐색하고자 하였다. 그 결과 GIHEE 50 및 100 μg/mL 농도 처리 시 LPS로 유도된 염증반응에서 NF-κB 활성 억제와 더불어 MAPKs의 인산화를 효과적으로 억제함을 보였다. 염증반응 매개인자들인 NO 및 염증성 사이토카인의 생성도 효과적으로 제어함을 보였으며, 특히 GIHEE 50 μg/mL 농도에서 TNF-α 및 IL-1β 분비량은 각각 약 51% 및 30% 이상, IL-6 분비량은 100 μg/mL에서 약 54% 이상의 높은 분비량 감소를 나타내었다. 따라서 GIHEE는 이들 염증매개성 물질들의 활성을 효과적으로 억제함으로써 항염증 활성을 나타내었으며, 염증성 질병의 예방 및 치료에 효과적인 기능성 소재로의 가능성이 충분하다고 사료된다.
과도한 NO의 생성이 일으키는 문제점은?
또한 활성화된 대식세포는 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2)와 같은 효소를 생산하며 각각 nitric oxide(NO) 및 prostaglandin E2(PGE2)와 같은 다양한 염증 매개들을 생산하여 숙주에 치명적인 결과를 초래한다고 알려졌다(4). 특히 과도한 NO의 생성은 염증반응을 촉진할 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진함으로써 염증을 심화시켜 조직 손상, 유전자 변이 및 신경 손상을 일으킨다고 보고된다(5). 이처럼 다양한 염증매개체들의 발현은 전사인자인 nuclear factor-kappaB(NF-κB), mitogen-activated protein kinase(MAPK)를 포함한 여러 가지 염증매개 신호 네트워크의 활성화를 통하여 외래인자의 탐식작용을 활성화하고 염증반응에 관여하게 된다(6).
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