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문제 정의
- 이번 연구에서는 대한민국약전 (KP)에 품질관리 지표로 설정되어 있는 건조감량, 회분, 산불용성회분, 엑스함량을 조사하여 중국약전 (ChP)과 일본약국방 (JP)의 기준과 비교하였으며, 또한, 국내 재배 익모초의 중금속함량을 조사하였다. 나아가 thin layer chromatography (TLC) 확인시험법 개선사항과 high performance liquid chromatography (HPLC) 성분프로파일 등을 조사하여 익모초의 품질관리 할 수 있는 기본 자료를 확보하여 보고 하고자 한다.
- 2 ppm으로 설정 되었다. 중금속시험은 품질이 안전한 생약재 확보를 위하여 실시하였으며, 또한, 광범위하게 오염되어 있을지 모르는 토양오염으로부터 재배환경이 얼마나 안전한가를 알아보기 위하여 시험을 실시하였다. 이번 연구에서 측정된 재배품의 중금속은 Pb는 0.
제안 방법
- 이번 연구에서는 대한민국약전 (KP)에 품질관리 지표로 설정되어 있는 건조감량, 회분, 산불용성회분, 엑스함량을 조사하여 중국약전 (ChP)과 일본약국방 (JP)의 기준과 비교하였으며, 또한, 국내 재배 익모초의 중금속함량을 조사하였다. 나아가 thin layer chromatography (TLC) 확인시험법 개선사항과 high performance liquid chromatography (HPLC) 성분프로파일 등을 조사하여 익모초의 품질관리 할 수 있는 기본 자료를 확보하여 보고 하고자 한다.
- HPLC 표준크로마토그램 작성을 위하여 식약처에서 고시한 ‘생약 (한약)제제의 성분프로파일 설정가이드라인’을 참조하여 시험하였다 (MFDS, 2010).
- 건조감량시험은 대한민국약전 (KP) 일반시험법 중 생약시험 방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 익모초 가루를 2 - 6 g을 정확히 칭량하여 100℃에서 5시간 동안 건조하여 데시케이터에서 식힌 다음 항량이 될 때까지 건조시킨 후 그 감량을 측정하여 수분함량을 계산하였다. 시험에 사용장비는 Mechanical Convection VS-1202DS3 (Vision Scientific Co.
- 익모초가루시료를 도가니에 넣고 회화로에 옮겨 600 ± 25℃에서 5 -6시간 가열하여 백색 및 회백색의 회분이 얻어질 때까지 가열하였다. 회화가 끝난 후 그대로 식혀 온도가 약 200℃ 로 되었을 때 데시케이터에 옮겨 식힌 후 칭량하여 회분함량을 계산하였다. 얻어진 회분에 묽은 염산 (0.
- 회화가 끝난 후 그대로 식혀 온도가 약 200℃ 로 되었을 때 데시케이터에 옮겨 식힌 후 칭량하여 회분함량을 계산하였다. 얻어진 회분에 묽은 염산 (0.1 N HCl) 25㎖을 조심하여 넣고 5분간 약한 열로 끓여 불용물을 정량용 여과지로 여과하여 잔류물을 열탕으로 잘 씻어 여과지와 함께 건조한 다음 회분함량과 같은 방법으로 3시간 강열하여 데시케이터에서 식힌 다음 그 질량을 정밀하게 칭량하여 산불용성회분 함량 (%)으로 하였다. 시험에 사용 장비는 WiseTherm digital muffle furnace F-05 (Daehan Scientific Co.
- 다시 16 - 20시간 방치한 다음 여과하여, 플라스크 및 잔류물은 여액이 100㎖로 될 때까지 묽은 에탄올로 씻었다. 여액 50㎖를 water bath에서 증발건고 하고 105℃에서 4시간 건조하여 데시케이터에서 식힌 다음 그 질량을 정확히 칭량하고 2를 곱하여 묽은 에탄올엑스의 양으로 계산하였다.
- 45㎛, syringe file로 여과하여 검액으로 하였다. 그리고 leonurine 표준품 약 10㎎을 70% MeOH을 100㎖에 녹인다음 10㎖을 취하여 70% MeOH을 첨가하여 100㎖으로 맞춘 용액을 표준검액으로 하였다. 이렇게 만들어진 검액과 표준검액을 HPLC에 10㎕씩 주입하여 분석하였다.
- 그리고 leonurine 표준품 약 10㎎을 70% MeOH을 100㎖에 녹인다음 10㎖을 취하여 70% MeOH을 첨가하여 100㎖으로 맞춘 용액을 표준검액으로 하였다. 이렇게 만들어진 검액과 표준검액을 HPLC에 10㎕씩 주입하여 분석하였다. 이때 사용한 컬럼은 Sunfire C18 5㎛, 4.
- 5 g을 정확히 달아 70% MeOH과 100% MeOH을 사용하여 추출하였으며, 두 추출액을 비교하여 70% MeOH을 추출용매로 선정하였다. 이와 같이 선정된 70% MeOH을 50㎖을 넣고 30, 60, 90 분을 비교 검토하여 60분으로 설정하였으며, 1회 초음파 추출하였다. 추출액을 여과지로 1차 여과 한 후 0.
- 45㎛, syringe filter로 여과하여 검액으로 사용하였다. 최적의 분리조건을 얻기 위하여 휘발성염인 formic acid을 0.1% 첨가한 물과 acetonitrile (ACN)로 용매구배를 주어 분리하였다. 분석에 사용된 UV파장은 210㎚, 254㎚, 270㎚, 365㎚을 비교 검토하여 270㎚로 설정하였고, 검액 조제시 분석컬럼의 경우 4.
- 그러나 기존 TLC확인시험 방법에 따라 시험을 할 경우 stachydrine HCl과 확인해야 할 다른 반점이 매우 흐리게 나타나 확인하기 어려웠다. 따라서 명확한 stachydrine HCl의 반점을 확인하고자 기존 추출방법을 변경하여 시험을 실시하였다. 기존 추출된 검액을 다시 증발건고 시킨 후 메탄올 1㎖로 녹여 박층크로마토그램을 실시하였을 때 기존방법에 비하여 명확한 stachydrine HCl의 반점을 확인 할 수 있었다 (Fig.
- 점적량을 증가시키는 방법도 고려하였으나 실험자의 개인적인 차이에 따라 실험결과가 다르게 나타날 수 있어 재현성있는 시험결과를 만들 수 있는 시험방법을 제안하기 위하여 추출시료를 증발건고하는 방법을 선택하였다. 따라서 기존 대한민국약전에서 제시한 익모초의 확인시험 방법보다 개선된 방법에 따라 시험하게 되면 재현성 있는 명확한 stachydrine HCl의 반점을 확인할 수 있을 것으로 사료된다.
- 익모초의 시료의 품질관리방법으로 성분프로파일 연구를 수행하였다. 5.
- 익모초의 시료의 품질관리방법으로 성분프로파일 연구를 수행하였다. 5.94분에 leonurine, 16.43분에 rutin과 26.78분에 myricetin의 피크를 확인하였고 이들 성분을 중심으로 성분프로파일을 작성하였다 (Fig. 3).
- 관측된 피크의 반복성을 확인하기 위하여 시료를 한 개의 로트에서 6회 반복하여 추출하고 측정하였으며, 측정된 피크 중 leonurine 피크를 기준으로 rutin과 myricetin의의 상대유지 시간 (relative retention time, RRT)과 상대적면적 (relative peak area, RPA)를 계산하였다. 유지시간과 면적, 상대유지시간 및 상대면적의 평균, 표준편차와 상대표준편차를 계산하여 적합한 반복성을 보이는지 확인 한 결과 RT과 RRT 그리고 RA와 RPA값 모두 RSD < 6%로 높은 반복성을 가진 것을 확인하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 재배품은 국내에서 생산되는 익모초 2년생으로 7 - 8월경에 수확된 익모초를 대상으로 영월에서 1구, 단양에서 3구, 금산에서 1구, 영천과 산청에서 각각 5구씩 총 15개 시료를 가천대학교 본초학교실에서 재배농가로부터 직접 수집하고 관능위원이 기원을 감별한 것을 제공받아 연구에 사용하였다 (Table 1).
- 시험에 사용된 TLC plate는 Silica Gel 60 F254 (0.25㎜, Merk, Darmstadt, Germany)를 사용하였으며, 기기분석에 사용된 용매는 HPLC급 (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 시약은 모두 특급 시약을, 물은 HPLC용 (Merck, Darmstadt, Germany)을 구입하여 사용하였다.
- 25㎜, Merk, Darmstadt, Germany)를 사용하였으며, 기기분석에 사용된 용매는 HPLC급 (Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 시약은 모두 특급 시약을, 물은 HPLC용 (Merck, Darmstadt, Germany)을 구입하여 사용하였다. 정량에 사용되는 leonurine은 식약처에서 분양하는 leonurine 표준품 (leonurine-2009, MFDS, Cheongju, Korea)을 구매하여 사용하였다.
- 시약은 모두 특급 시약을, 물은 HPLC용 (Merck, Darmstadt, Germany)을 구입하여 사용하였다. 정량에 사용되는 leonurine은 식약처에서 분양하는 leonurine 표준품 (leonurine-2009, MFDS, Cheongju, Korea)을 구매하여 사용하였다. 그리고 확인시험용 표준생약 (reference of medicinal plant materials, 익모초-LEJA2008)을 식약처로 부터 분양 받아 사용하였다.
- 정량에 사용되는 leonurine은 식약처에서 분양하는 leonurine 표준품 (leonurine-2009, MFDS, Cheongju, Korea)을 구매하여 사용하였다. 그리고 확인시험용 표준생약 (reference of medicinal plant materials, 익모초-LEJA2008)을 식약처로 부터 분양 받아 사용하였다. 그리고 확인시험에 사용된 표준시약인 stachydrine HCl과 표준프로파일링에 사용되는 표준시약 rutin과 myricetin (Sigma-Aldrich Co.
- 그리고 확인시험용 표준생약 (reference of medicinal plant materials, 익모초-LEJA2008)을 식약처로 부터 분양 받아 사용하였다. 그리고 확인시험에 사용된 표준시약인 stachydrine HCl과 표준프로파일링에 사용되는 표준시약 rutin과 myricetin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)은 certified reference material (CRM) 혹은 reference material (RM) 표준품을 사용하였다. 분석용 가스는 고순도 (99.
- Louis, MO, USA)은 certified reference material (CRM) 혹은 reference material (RM) 표준품을 사용하였다. 분석용 가스는 고순도 (99.999% 이상)를 사용하였다. 중금속 시험에 표준용액은 한국표준과학연구원 (KRISS) 표준물질을 사용하였다.
- 999% 이상)를 사용하였다. 중금속 시험에 표준용액은 한국표준과학연구원 (KRISS) 표준물질을 사용하였다.
- 중금속 시험은 대한민국약전 (KP)의 일반시험법 중 중금속 시험 방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 시료추출에 사용된 기기는 초단파분해장치 ETHOS EASY (Milestone Systems, Brondby, Denmark)를 사용하였으며, Pb, As, Cd 측정은 Nexion 300D ICP-MS (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)로, Hg은 수은분석기 DMA-80 (Milestone Systems, Brondby, Denmark)로 분석에 사용하였다.
- 익모초 가루를 2 - 6 g을 정확히 칭량하여 100℃에서 5시간 동안 건조하여 데시케이터에서 식힌 다음 항량이 될 때까지 건조시킨 후 그 감량을 측정하여 수분함량을 계산하였다. 시험에 사용장비는 Mechanical Convection VS-1202DS3 (Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)을 사용하였다.
- 1 N HCl) 25㎖을 조심하여 넣고 5분간 약한 열로 끓여 불용물을 정량용 여과지로 여과하여 잔류물을 열탕으로 잘 씻어 여과지와 함께 건조한 다음 회분함량과 같은 방법으로 3시간 강열하여 데시케이터에서 식힌 다음 그 질량을 정밀하게 칭량하여 산불용성회분 함량 (%)으로 하였다. 시험에 사용 장비는 WiseTherm digital muffle furnace F-05 (Daehan Scientific Co., Wonju, Korea)와 Mechanical Convection VS-1202DS3 (Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)을 사용하였다.
- HPLC 표준크로마토그램 작성을 위하여 식약처에서 고시한 ‘생약 (한약)제제의 성분프로파일 설정가이드라인’을 참조하여 시험하였다 (MFDS, 2010). 사용 장비는 HPLC (Waters Alliance 2795 system, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였으며, 시료추출은 초음파추출장치 (Bransonic 8510E-DTH/250W, 44㎑, Branson Co., Danbury, CT, USA)을 사용하였다. HPLC 분석조건은 Table 2에 나타내었다.
- 분석에 사용된 UV파장은 210㎚, 254㎚, 270㎚, 365㎚을 비교 검토하여 270㎚로 설정하였고, 검액 조제시 분석컬럼의 경우 4.6 × 250㎜ (5㎛)와 3.9 × 150㎜ (4㎛)를 비교 검토하여 4.6 × 250㎜ (5㎛)를 선정하여 분석조건을 설정하였다 표준용액으로는 식약처로부터 분양받은 leonurine 표준품과 myricetin, rutin을 1㎎을 취하여 70% MeOH을 10㎖에 녹여 표준용액으로 하였다.
- 검액의 제조는 익모초 전초의 가루 0.5 g을 정확히 달아 70% MeOH과 100% MeOH을 사용하여 추출하였으며, 두 추출액을 비교하여 70% MeOH을 추출용매로 선정하였다. 이와 같이 선정된 70% MeOH을 50㎖을 넣고 30, 60, 90 분을 비교 검토하여 60분으로 설정하였으며, 1회 초음파 추출하였다.
데이터처리
- Statistical ananlysis were conducted by Student's t-test (n = 3).
- Student's t-test에 의해 유효성을 검증하였으며 각 시료와 비교하여 p<0.05 이상인 것을 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
- 05 이상인 것을 유의성이 있는 것으로 인정하였다. 사용된 통계프로그램은 SPSS ver. 12.0 (statistical package for social science ver 12, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 계산하였다.
이론/모형
- 중금속 시험은 대한민국약전 (KP)의 일반시험법 중 중금속 시험 방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 시료추출에 사용된 기기는 초단파분해장치 ETHOS EASY (Milestone Systems, Brondby, Denmark)를 사용하였으며, Pb, As, Cd 측정은 Nexion 300D ICP-MS (PerkinElmer Inc.
- 검액 제조는 익모초시료와 익모초표준생약 3 g을 달아 각각 methanol (MeOH)을 30㎖를 넣고 1시간 초음파추출한 다음 여과한 액을 검액 및 익모초표준생약표준액으로 하였다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험하였다. 검액 및 익모초표준생약표준액 10㎕씩을 박층크로마토그래프용실리카겔을 써서 만든 박층판에 점적하였다.
- 건조감량시험은 대한민국약전 (KP) 일반시험법 중 생약시험 방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 익모초 가루를 2 - 6 g을 정확히 칭량하여 100℃에서 5시간 동안 건조하여 데시케이터에서 식힌 다음 항량이 될 때까지 건조시킨 후 그 감량을 측정하여 수분함량을 계산하였다.
- 회분 및 산불용성회분시험은 대한민국약전 (KP) 일반시험법 중 생약시험방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 익모초가루시료를 도가니에 넣고 회화로에 옮겨 600 ± 25℃에서 5 -6시간 가열하여 백색 및 회백색의 회분이 얻어질 때까지 가열하였다.
- 엑스함량시험은 대한민국약전 (KP) 일반시험법 중 생약시험 묽은 에탄올엑스 시험방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 익모초 가루시료 약 2 - 3 g을 칭량하여 플라스크에 넣고 묽은 에탄올 (50% ethanol) 70㎖을 넣어 때때로 흔들어 섞어 5시간 침출하였다.
- 익모초의 leonurine (C14H21N3O5) 정량은 대한민국약전 (KP)에 수록된 방법에 의하여 실험을 실시하였다 (MFDS, 2014). 먼저 익모초 가루 약 1 g을 70% MeOH을 50㎖를 넣고 1시간 초음파추출한 다음 0.
- 익모초의 지표성분인 stachydrine HCl (C7H14ClNO2)의 반점을 과 TLC패턴을 비교하기 위하여 대한민국약전 (KP) 일반시험법 중 박층크로마토그래피 방법에 따라 시험하였다 (MFDS, 2014). 검액 제조는 익모초시료와 익모초표준생약 3 g을 달아 각각 methanol (MeOH)을 30㎖를 넣고 1시간 초음파추출한 다음 여과한 액을 검액 및 익모초표준생약표준액으로 하였다.
성능/효과
- 중금속시험은 품질이 안전한 생약재 확보를 위하여 실시하였으며, 또한, 광범위하게 오염되어 있을지 모르는 토양오염으로부터 재배환경이 얼마나 안전한가를 알아보기 위하여 시험을 실시하였다. 이번 연구에서 측정된 재배품의 중금속은 Pb는 0.35 - 3.64 ppm로 기준치 5 ppm 이하로 검출되었으며, Hg는 0.001 ppm이 검출되었으나 대한민국약전의 중금속 기준에 적합한 것으로 측정되었다. 그리고 As, Cd은 모든 시료에서 검출되지 않았다.
- 익모초 재배품 15개 시료의 TLC 전개 결과 익모초표준생약과 같은 반점을 확인 할 수 있었고, stachydrine HCl을 Rf값이 0.15인 부근에서 확인하였다.
- 이번 연구결과 국내산 익모초는 5.93 -10.62% 이하로 평균 8.58 ± 1.8% 측정되었다.
- 국내 재배되어 가공되어진 익모초 15개에 대하여 익모초 시료의 leonurine의 함량은 0.04 - 0.17%으로 평균 0.11 ± 0.04%로 나타났으며 측정한 결과 익모초 1개의 시료를 제외한 나머지 시료들은 대한민국약전 (KP) 기준규격 보다 높게 측정되었다 (Table 4).
- 국내에서 수집된 재배 익모초 시료 15개의 묽은 에탄올엑스함량을 측정한 결과 16.70 -23.11%로 평균 19.49 ± 2.14%로 15개 시료간 고른 묽은 에탄올액스 함량을 확인할 수 있었으며, 대한민국약전 (KP) 기준을 모두 만족하였다.
- 측정결과 0.99 - 1.76%로 모든 시료에서 평균 1.38 ± 0.24%로 대한민국약전 (KP) 기준을 초과하지 않았다.
- 기준을 초과한 4개를 제외한 나머지 시료는 평균 9.62 ± 0.82%로 측정되어 대한민국약전 (KP) 기준에 적합 한 것으로 나타났다.
- 따라서 명확한 stachydrine HCl의 반점을 확인하고자 기존 추출방법을 변경하여 시험을 실시하였다. 기존 추출된 검액을 다시 증발건고 시킨 후 메탄올 1㎖로 녹여 박층크로마토그램을 실시하였을 때 기존방법에 비하여 명확한 stachydrine HCl의 반점을 확인 할 수 있었다 (Fig. 1).
- 측정결과 중부지역에서 생산된 4개의 시료가 대한민국약전 (KP) 회분 기준을 약간 넘는 것으로 측정되었다. 그러나 중국 약전 (ChP) 규격에는 모두 적합한 것으로 측정되었다.
- 위 결과로 보아 국산 익모초의 가공품질의 있어 일본과 중국의 품질기준과 비교하였을 때 대등한 수준으로 가공되고 있는 것으로 사료된다. 엑스함량의 경우 대한민국약전 (KP)에는 8.
- 유지시간과 면적, 상대유지시간 및 상대면적의 평균, 표준편차와 상대표준편차를 계산하여 적합한 반복성을 보이는지 확인 한 결과 RT과 RRT 그리고 RA와 RPA값 모두 RSD < 6%로 높은 반복성을 가진 것을 확인하였다.
- 유지시간과 면적, 상대유지시간 및 상대면적의 평균, 표준편차와 상대표준편차를 계산하여 적합한 반복성을 보이는지 확인 한 결과 RT과 RRT 그리고 RA와 RPA값 모두 RSD < 6%로 높은 반복성을 가진 것을 확인하였다. 그리고 익모초 재배품 15개 시료의 chromatogram상의 유사성과 차이를 알아보기 위하여 각 15개 시료의 chromatogram을 중첩하여 chromatogram의 pattern의 차이를 확인한 결과 모든 익모초시료의 chromatogram이 유사한 것으로 확인 되었다.
후속연구
- 그리고 As, Cd은 모든 시료에서 검출되지 않았다. 하지만 Pb과 Hg의 경우 전 시료에서 기준 이하로 검출되고 있어 추후로도 지속적인 모니터링 연구가 필요할 것으로 사료된다 (Table 3).
- 점적량을 증가시키는 방법도 고려하였으나 실험자의 개인적인 차이에 따라 실험결과가 다르게 나타날 수 있어 재현성있는 시험결과를 만들 수 있는 시험방법을 제안하기 위하여 추출시료를 증발건고하는 방법을 선택하였다. 따라서 기존 대한민국약전에서 제시한 익모초의 확인시험 방법보다 개선된 방법에 따라 시험하게 되면 재현성 있는 명확한 stachydrine HCl의 반점을 확인할 수 있을 것으로 사료된다.
- 14%로 15개 시료간 고른 묽은 에탄올액스 함량을 확인할 수 있었으며, 대한민국약전 (KP) 기준을 모두 만족하였다. 이 결과로 미루어보아 수입산 익모초와 비교하여 높은 품질경쟁력이 있을 것으로 사료된다 (Table 4).
- 따라서 이는 지역적인 차이에서 오는 것보다는 재배방법 대한 차이에서 발생하는 것으로 사료된다. 따라서, 품질이 균일한 익모초에 대한 재배 방법에 대한 연구가 있어야 할 것으로 사료된다.
- , 2001). 따라서 익모초의 stachydrine의 함량도 품질을 평가할 수 있는 중요한 지표가 될 것으로 사료되며, 앞으로 stachydrine의 함량기준에 대한 심도있는 연구가 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
- 위의 연구결과에서 얻은 leonurine, rutin과 myricetin의 성분들을 이용하여 국내에서 생산되는 익모초를 측정하므로서 생약재 및 생약제제 개발 등에 있어 이화학적동등성확인 혹은 품질관리방법에 현업에 많은 도움이 될 것이라고 사료된다.
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