[국내논문]LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 가락진두발 에탄올 추출물의 항염증 효과 Anti-Inflammatory Effect of Chondrus nipponicus Yendo Ethanol Extract on Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses in RAW 264.7 Cells원문보기
본 연구에서는 lipopolysaccharide(LPS)로 자극한 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 가락진두발 에탄올 추출물(CNYEE)의 항염증 효과를 알아보기 위하여 nitric oxide(NO)와 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 확인하였다. 그 결과 CNYEE 모든 농도에서 LPS만을 처리한 대조군과 비교하였을 때 유의성 있게 NO와 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 저해하였으며, 특히 $100{\mu}g/mL$ 농도에서는 IL-6의 분비량을 70% 이상 억제하였고, TNF-${\alpha}$ 및 IL-$1{\beta}$의 분비량은 50% 이상의 억제 효과를 나타내었다. CNYEE에 의한 염증매개물질의 분비 감소가 전사인자인 nuclear factor-${\kappa}B$(NF-${\kappa}B$)의 핵 내 전이 pathway를 저해함으로써 나타난 결과인지 확인하기 위하여 iNOS, COX-2 및 NF-${\kappa}B$ p65의 단백질 발현량을 관찰한 결과, 비교적 낮은 농도인 $50{\mu}g/mL$에서 40% 이상의 저해능을 보인 것으로 보아 NO와 cytokine의 분비 억제 결과가 NF-${\kappa}B$ pathway를 저해함으로써 나타난 것임을 유추할 수 있었다. 또한 LPS에 의해 증가한 mitogen-activated protein kinases의 인산화를 확인한 결과, CNYEE 처리에 의해 농도 의존적으로 유의성 있게 저해되었다. 이러한 결과를 종합해볼 때 가락진두발 에탄올 추출물은 염증매개물질의 분비를 효과적으로 저해함으로써 추후 천연물로서 염증 치료제의 개발이 가능할 것으로 생각한다.
본 연구에서는 lipopolysaccharide(LPS)로 자극한 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 가락진두발 에탄올 추출물(CNYEE)의 항염증 효과를 알아보기 위하여 nitric oxide(NO)와 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 확인하였다. 그 결과 CNYEE 모든 농도에서 LPS만을 처리한 대조군과 비교하였을 때 유의성 있게 NO와 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 저해하였으며, 특히 $100{\mu}g/mL$ 농도에서는 IL-6의 분비량을 70% 이상 억제하였고, TNF-${\alpha}$ 및 IL-$1{\beta}$의 분비량은 50% 이상의 억제 효과를 나타내었다. CNYEE에 의한 염증매개물질의 분비 감소가 전사인자인 nuclear factor-${\kappa}B$(NF-${\kappa}B$)의 핵 내 전이 pathway를 저해함으로써 나타난 결과인지 확인하기 위하여 iNOS, COX-2 및 NF-${\kappa}B$ p65의 단백질 발현량을 관찰한 결과, 비교적 낮은 농도인 $50{\mu}g/mL$에서 40% 이상의 저해능을 보인 것으로 보아 NO와 cytokine의 분비 억제 결과가 NF-${\kappa}B$ pathway를 저해함으로써 나타난 것임을 유추할 수 있었다. 또한 LPS에 의해 증가한 mitogen-activated protein kinases의 인산화를 확인한 결과, CNYEE 처리에 의해 농도 의존적으로 유의성 있게 저해되었다. 이러한 결과를 종합해볼 때 가락진두발 에탄올 추출물은 염증매개물질의 분비를 효과적으로 저해함으로써 추후 천연물로서 염증 치료제의 개발이 가능할 것으로 생각한다.
The anti-inflammatory activity of ethanol extract from Chondrus nipponicus Yendo (CNYEE) was investigated by measuring production of a lipopolysaccharide-induced inflammatory response mediator. CNYEE had no cytotoxic effects on proliferation of macrophages compared to the control. CNYEE significantl...
The anti-inflammatory activity of ethanol extract from Chondrus nipponicus Yendo (CNYEE) was investigated by measuring production of a lipopolysaccharide-induced inflammatory response mediator. CNYEE had no cytotoxic effects on proliferation of macrophages compared to the control. CNYEE significantly inhibited (over 50%) NO production at $50{\mu}g/mL$, with inhibitory effects on expression levels of cytokines such as interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), and IL-$1{\beta}$. In particular, IL-6 inhibitory activity of CNYEE was higher than 70% at $100{\mu}g/mL$. CNYEE also reduced protein expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), and nuclear factor (NF)-${\kappa}B$ in a dose-dependent manner. CNYEE also significantly reduced phosphorylation of p38, extracellular signal-regulated kinase, and c-Jun N-terminal kinase. Therefore, these results suggest that CNYEE may have anti-inflammatory effects by modulating the NF-${\kappa}B$ and mitogen-activated protein kinases signaling pathways and may be used as an anti-inflammatory therapeutic material.
The anti-inflammatory activity of ethanol extract from Chondrus nipponicus Yendo (CNYEE) was investigated by measuring production of a lipopolysaccharide-induced inflammatory response mediator. CNYEE had no cytotoxic effects on proliferation of macrophages compared to the control. CNYEE significantly inhibited (over 50%) NO production at $50{\mu}g/mL$, with inhibitory effects on expression levels of cytokines such as interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), and IL-$1{\beta}$. In particular, IL-6 inhibitory activity of CNYEE was higher than 70% at $100{\mu}g/mL$. CNYEE also reduced protein expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), and nuclear factor (NF)-${\kappa}B$ in a dose-dependent manner. CNYEE also significantly reduced phosphorylation of p38, extracellular signal-regulated kinase, and c-Jun N-terminal kinase. Therefore, these results suggest that CNYEE may have anti-inflammatory effects by modulating the NF-${\kappa}B$ and mitogen-activated protein kinases signaling pathways and may be used as an anti-inflammatory therapeutic material.
그중 가락진두발(Chondrusnipponicus Yendo)은 홍조류 돌가사리과 해조류로 다른 홍조류의 생리활성에 관한 연구(11-13)에 비해 가락진두발에 관한 생리활성 연구는 거의 전무한 실정이다. 본 연구에서는 가락진두발 에탄올 추출물이 LPS로 자극한 대식세포에서 NF-κB와 MAPKs pathway의 전사 활성 저해를 통해 나타내는 항염증 효과를 확인하고 천연 염증 치료제로써 이용 가능성을 알아보았다.
제안 방법
, Tokyo, Japan)로 농축하여 37℃에서 건조한 후 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 건조된 농축물은 10% dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하여 녹인 후 phosphate buffered saline(PBS)을 이용하여 농도별로 희석하여 본 실험에 사용하였다.
NO는 반응성이 강한 이원자 자유라디칼로 인체 내 생리적이나 병적인 반응에서 중요한 물질로서 L-arginine을 기질로 하여 NOS에 의해 L-citrulline으로 합성되며 적절한 수준에서는 혈소판 억제, 면역조절, 신경전달, 혈관확장 등의 역할을 하지만 NO가 과량으로 생성되면 염증반응을 촉진하고 면역질환을 포함한 관절염, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적반응을 일으킨다(20,21). 본 연구에서는 가락 진두발 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증반응을 유발한 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성량을 Griess 시약을 이용해 측정하였다. 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도(0.
대상 데이터
Murine의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB 40071, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Gibco,Grand Island, NY, USA)에 10% inactivated fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 가락진두발은 연화리에서 채취한 것으로 담수로 깨끗하게 수세한 후 동결 건조하여 분말화하고 진공 포장상태로 -20℃에서 저장하며 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 결과에 대한 유의차 검정은 SAS software(ver. 9.3, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)에서 평균값을 분산분석 한 후, Duncan's multiple range test에 따라 P<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
본 연구에서는 앞서 나타난 NO와 cytokines의 억제 효과가 어떠한 pathway에서 작용하여 나타난 결과인지 알아보고자 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현의 억제 효과를 관찰하였다. RAW 264.7 세포에 CNYEE를0.1~100 μg/mL 농도로 처리하고 western blot을 통해 LPS에 의한 iNOS, COX-2 및 NF-κB p65 단백질 발현 증가에 대한 억제 효과를 확인하였다(Fig. 4). 그 결과 LPS 자극으로 급격히 증가한 iNOS, COX-2 및 NF-κB p65의 발현량이 CNYEE 처리에 의해 농도 의존적으로 저해됨을 확인하였다.
배양액 내의 nitrite 농도를 측정하기 위해 Griess 반응(15)을 이용하였다. RAW 264.
성능/효과
본 연구 결과는 홍조류인 참도박 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 NO 생성량의 감소를 보인 결과(13) 및 잘피 에탄올 추출물의 NO 저해능을 확인한 연구 결과(22)와 유사함을 확인하였다. 따라서CNYEE는 LPS로 유도된 대식세포에서 증가한 NO의 생성억제 효과가 있는 것으로 확인되었다.
이는 참모자반 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 pro-inflammatory cytokine의 분비량을 저해한 결과(29)와 유사하다. 따라서 이러한 결과를 종합해볼 때 CNYEE는pro-inflammatory cytokine인 IL-6, TNF-α, IL-1β 분비 억제를 통해 우수한 항염증 효과를 나타냄을 확인하였다.
특히 CNYEE를 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때 pp38의 발현량을 73% 이상 억제하는 효과를 나타내었고, p-ERK와 p-JNK의 단백질 발현량 또한 LPS를 단독 처리구에 비해 각각 41% 및 39% 이상의 억제 효과를 보였다. 이상의 결과를 종합해볼 때 CNYEE는 대식세포에서 NF-κB 및MAPKs의 활성을 억제함으로써 iNOS, COX-2 및 염증성 cytokine의 발현을 억제하여 염증반응에 있어 뛰어난 항염증 효과가 있는 것을 알 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응이란?
염증반응은 생체에 이물질이 감염 또는 침입하였거나 물리 화학적 손상을 입었을 때 이를 방어하기 위한 현상이다. 염증반응을 유발하는 다양한 요인 중에는 세균에 의한 것이 가장 많으며 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonin, bradykinin, prostaglandins(PG), hydroxyeicosatetraenoic acid, leukotriene과 같은 혈관 생성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 붉어지면서 붓고 열이나 통증이 나타나고 염증반응이 일어나게 된다.
lipopolysaccharide의 기능과 염증 연구에서의 용도는?
염증인자는 염증자극에 반응하여 세포 내 신호전달 경로와 전사인자가 활성화되며 발현되게 되는데 lipopolysaccharide(LPS)와 같은 일차적인 자극 때문에 발생한다(2). LPS는 gram-negative bacteria의 세포벽 외층의 절편혼합물로서 인체 내에서 내독소로 작용하여 국소 및 전신의 염증반응을 유발하며, 대식세포의 TLR 4(toll-like receptor 4)와 결합하고 MyD88을통하여 IRAK의 인산화 및 TRAF6가 활성화되어 IκB kinase cascade에 의해 다양한 cytokine을 생성시키므로 염증 연구에서 다용되는 모델이다(3). Nuclear factor-κB(NF-κB)는 다양한 cytokine, chemokine, growth factor의 합성을 조절하는 전사인자로 p50과 p65로 구성되어 인산화됨에 따라 핵 내로 이동해 inducible nitric oxide synthase(iNOS),cyclooxygenase-2(COX-2) 및 염증관련 cytokine을 합성한다(4).
염증반응 시 국소적으로 유리되는 혈관 생성 물질은?
염증반응은 생체에 이물질이 감염 또는 침입하였거나 물리 화학적 손상을 입었을 때 이를 방어하기 위한 현상이다. 염증반응을 유발하는 다양한 요인 중에는 세균에 의한 것이 가장 많으며 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonin, bradykinin, prostaglandins(PG), hydroxyeicosatetraenoic acid, leukotriene과 같은 혈관 생성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 붉어지면서 붓고 열이나 통증이 나타나고 염증반응이 일어나게 된다. 하지만 과도하게 염증반응이 일어날 시에는 기능장애와 같은 조직 변질 순환장애와 조직 증식을 유발한다(1).
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