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문제 정의
- 최근 수증기 증류법을 활용한 산국화 유래 에센셜오일이 각질형성세포의 증식을 촉진함으로서 피부재생활성을 나타낼 뿐만 아니라[13], 수용성 floral water 성분이 혈관평활근세포의 증식과 이주 억제를 통해 항동맥경화 활성을 나타냄을 선행연구를 통해 확인하였다[14]. 그러나, 산국화 수증기 증류 성분 중 수용성 hydrosol의 피부생리활성에 관한 연구는 확인되지 않았으며, 본 연구를 통해 인체 유래 각질형성 세포의 증식과 이주 등에 미치는 산국화 hydrosol의 효능을 확인함으로서 피부조직 재형성 및 상처치유 등의 소재로서 응용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 수증기 증류법을 통해 추출한 산국화 hydrosol은 유기용매 추출법에 비해 경제적이며, 추출 소요시간 및 공정이 짧아 유효성분의 변질 및 잔류 용매에 대한 독성이 낮을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 수증기 증류법을 이용하여, 분리된 산국화 hydrosol의 피부 각질형성세포의 증식과 이주에 미치는 영향을 확인하였다.
제안 방법
- Collagen spot이 건조되면 시험물질을 농도별로 처리하여 72 h 동안 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Diff-Quik을 이용하여 collagen spot을 고정 및 염색시킨 후 Scion Image software로 collagen spot의 outgrowth을 측정하였다.
- 05% Tween 20이 포함된 PBS)로 washing 후 2차 antibody를 blocking buffer에 희석하여 실온에서 반응시켰다. PBS-T로 washing하고 ECL 용액(Welgene Inc, Daegu, Korea)에 반응시켜 단백질의 발현정도를 분석하였다.
대상 데이터
- Anti-Akt, anti-phospho Akt, anti-Erk1/2, anti-phospho Erk1/2, anti-mouse HRP conjugate, anti-rabbit HRP conjugate는 Cell signaling (Beverly, MA, USA), anti-β-actin는 Sigma에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Ez-CyTox kit은 DAEIL LAB Service (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, Diff-Quick은 Baxter Healthcare Corporation (McGraw Park, IL, USA)에서 구입하였다. Anti-Akt, anti-phospho Akt, anti-Erk1/2, anti-phospho Erk1/2, anti-mouse HRP conjugate, anti-rabbit HRP conjugate는 Cell signaling (Beverly, MA, USA), anti-β-actin는 Sigma에서 구입하였다.
- 산국화(20 kg)를 세척한 후, 수증기 증류장치를 이용하여 100 ℃에서 2 h 동안 hydrosol (10 L)을 추출하였다. Hydrosol은 동결건조기 (Ilshin Lab, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 동결건조시켜 분말로 제조하였으며, DMSO에 녹여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 recombinant human epidermal growth factor (rhEGF)는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin (P/S), phosphate buffered saline (PBS)은 Hyclone (Logan, UT, USA) 또는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 구입하였다. Type I collagen은 BD Bioscience (Franklin Lakes, NJ, USA)에서 구입하였으며, bovine serum albumin (BSA), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Ez-CyTox kit은 DAEIL LAB Service (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, Diff-Quick은 Baxter Healthcare Corporation (McGraw Park, IL, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 recombinant human epidermal growth factor (rhEGF)는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin (P/S), phosphate buffered saline (PBS)은 Hyclone (Logan, UT, USA) 또는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 사람 피부 유래 정상 각질형성세포(human skin keratinocyte cell line; HaCaTs)은 대구 경북 한방산업진흥원에서 분양받아 사용하였다. HaCaTs은 DMEM 배지에 10% FBS와 1% P/S를 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 산국화는 호서대학교 아산캠퍼스 한방화장품과학과 실습지에서 재배하여 채취하였으며, 국립수목원 양종철 연구원에 의해 동정되었다. 산국화(voucher no.
데이터처리
- 실험결과는 mean ± S.E.M으로 표기하였으며, Graphpad Prism software (version 5.00 for Windows, San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용한 student’s t-test 방법을 통해 유의성 여부를 분석하였고, 그 결과 p ＜ 0.05일 경우에 한하여 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 3차원적인 세포의 증식과 이주능을 평가하기 위해 collagen sprout assay[16]를 활용하였으며, 산국화 hydrosol은 collagen HaCaT spot의 outgrowth를 농도 의존적으로(0.01 ∼ 10 µg/mL) 유도하였다(Figure 4).
- 001 ∼ 10 µg/mL) for 3 h. Migration was quantified using a Boyden chamber assay. Cell migration in the quiescent state was expressed as 100% (n = 8).
- 산국화 hydrosol의 각질형성세포 증식 및 이주 유도 활성과 관련된 signaling pathway를 확인하기 위하여, 각 단계별 antibody를 활용한 Western blot을 통해 확인 하였다. 산국화 hydrosol은 HaCaT 내 Erk 1/2와 Akt의 인산화를 농도 의존적으로(0.
- 시험물질의 세포 이주 유도능을 평가하기 위해서 48-well microchemotaxis Boyden chambers (Neuro-Probe, Gaithersburg, Maryland, USA)를 이용하였다. Bottom chamber에 산국화 hydrosol을 농도별로 주입하고, 0.
- 시험물질의 세포 증식능은 XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) assay를 통해 확인하였다. HaCaTs을 96-well plate (2 × 103 cells/well)에 분주한 다음, 12 h간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 0.1 µg/mL에서 음성대조군(control)에 비해 120.31 ± 0.74%, 1 µg/mL 농도에서 143.71 ± 3.37%의 증식유도 활성을 나타내어, 각질형성세포의 growth factor로 알려 진 rhEGF (50 ng/mL)를 처리한 양성대조군(130.12 ± 4.35%)과 유사한 세포 증식 유도 활성을 나타내었다.
- 96%의 인산화를 유도함이 관찰되었다(Figure 3A, C). Erk 1/2와 Akt pathway는 피부 각질형성세포의 증식과 이주를 조절하는 대표적인 신호전달체계로 알려져 있으며[9,13,16], 본 연구를 통해 산국화 hydrosol은 HaCaT의 Erk 1/2와 Akt의 인산화를 조절하여 세포의 증식과 이주 활성에 관여하는 것으로 확인되었다.
- 01%)과 유사한 활성을 나타내었다. 본 연구에서 양성대조군으로 사용된 rhEGF 등의 피부 각질형성세포 성장인자(growth factors)는 단백질 구성되어, 단백질 분해효소 및 열 등으로부터 불안정하지만, 산국화 hydrosol은 천연물로부터 분리된 polyphenolic 성분으로 구성되어 있어 상대적인 안정성이 높을 것으로 사료된다[14]. 또한 hydrosol은 수증기 증류법을 활용하여 분리함으로서 유기용매를 활용한 추출물에 비해 유효성분의 변질 및 잔류 용매에 의한 독성이 낮을 것으로 생각된다.
- 산국화 hydrosol은 인체유래 각질형성세포인 HaCaTs 의 증식과 이주를 농도의존적으로 유도하였으며, 이러한 활성은 Erk 1/2와 Akt signaling pathway를 통해 매개됨이 관찰되었다. 본 연구 결과를 통해 산국화 hydrosol은 각질형성세포의 증식과 이주 유도함으로서 피부 재생과 상처치유 활성을 내포하고 있음을 확인하였고, 향후 화장품, 식품 및 의약품 분야에서 피부재생 및 상처치유 개선 소재로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 72%의 이주 유도 활성을 나타내었다. 각질형성세포의 증식과 이주 활성의 증가는 피부조직 재형성 과정 중 type I, IV collagen 등의 피부 구성 단백질 합성을 촉진하며, 피부 탄력 및 장벽 강화 등을 유도하는 것으로 알려졌으며[6,7], 향후 산국화 hydrosol 및 구성성분의 피부 구성 단백질 합성에 대한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 산국화 hydrosol은 인체유래 각질형성세포인 HaCaTs 의 증식과 이주를 농도의존적으로 유도하였으며, 이러한 활성은 Erk 1/2와 Akt signaling pathway를 통해 매개됨이 관찰되었다. 본 연구 결과를 통해 산국화 hydrosol은 각질형성세포의 증식과 이주 유도함으로서 피부 재생과 상처치유 활성을 내포하고 있음을 확인하였고, 향후 화장품, 식품 및 의약품 분야에서 피부재생 및 상처치유 개선 소재로 개발될 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 hydrosol은 수증기 증류법을 활용하여 분리함으로서 유기용매를 활용한 추출물에 비해 유효성분의 변질 및 잔류 용매에 의한 독성이 낮을 것으로 생각된다. 향후, 선행연구를 통해 확인된 산국화 hydrosol의 분석결과를 바탕으로[14] 산국화 hydrosol의 구성 단일성분의 피부재생 및 상처치유 활성 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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