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문제 정의
- 18,19) 그러나 아직까지 발효를 이용하여 황칠나무 추출물의 활성을 증진시키는 연구는 진행된 바가 없었다. 따라서 본 연구에서는 황칠나무 잎 추출물의 열수 추출물과 그 열수 추출물을 유산균의 일종인 Lactobacillus plantarum을 이용하여 발효시킨 추출물을 대상으로 피부 미백 관련 활성을 비교함으로써 발효를 활용한 생약의 활용도 증진 가능성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 최근 그 유용성으로 인해 연구가 증가되고 있는 생약재 추출물의 발효와 관련하여 황칠나무 잎 열수 추출물에서 유산균의 일종인 Lactobacillus plantarum을 이용한 발효가 미치는 효과 중 미백 관련 활성을 확인하였다. 연구의 결과에서 L.
가설 설정
- 3)Values are mean±SD (n=3) without relative activity.
- 3)Values are mean±SD(n=3) without relative activity.
제안 방법
- DPPH radical 소거능 − 황칠나무 잎 열수 추출물과 발효 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능 측정 결과를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료의 농도(SC50)를 산출하여 Table II에 나타내었다.
- DPPH radical 소거능 측정 − 각 추출물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다.
- Melanin 생성 억제 활성 측정 − B16F10 세포를 48-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료와 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)를 처리하여 72시간 동안 배양한 후 생성된 melanin양을 405 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- 추출물의 조제 − 건조된 황칠나무 잎 1 kg을 blender를 사용하여 분쇄한 후 증류수 20 L를 추출용매로 하여 100℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시한 후 여과를 실시하였다. 발효과정에 사용할 3/4의 추출액을 남기고 동결건조 과정을 거쳐 28 g의 추출물을 최종적으로 확보하였다.
- 배지를 제거한 후, 각 well에 100 µl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 추출물의 조제 − 건조된 황칠나무 잎 1 kg을 blender를 사용하여 분쇄한 후 증류수 20 L를 추출용매로 하여 100℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시한 후 여과를 실시하였다.
- 21) 각 시료를 methanol에 농도별로 용해시킨 시료액 20 µl와 200 μM로 용해시킨 DPPH 용액 180 µl를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader(BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도(concentration of sample for scavenging 50% of radical, SC50)를 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid를 사용하였다.
대상 데이터
- 실험 재료 − 본 실험에 사용한 황칠나무 잎은 2014년 6월 전남 장흥 지역에서 채취한 것으로 이물질을 제거하고 음건을 실시한 후 실험에 사용하였으며, 동신대학교 표병식 교수가 검증한 후 표품은 동신대학교 생물자원산업화지원센터에 보관하였다.
- 추출물의 발효 − Lactobacillus plantarum(KCTC 3104)은 한국생명공학연구원 생물자원센터(BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였으며, MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 전배양액을 황칠나무 잎 열수 추출액에 1%가 되도록 혼합하여 37℃에서 24시간, 48시간, 72시간 조건으로 발효시켰다.
데이터처리
- Different superscript letters in the same concentration show significant differences at p<0.05 by one-way ANOVA.
- Different superscript letters show significant differences at p<0.05 by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행한 후 사후분석으로 Duncan's multiple range test를 실시하여 p<0.05 수준에서 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
- 통계분석 − 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차(mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0(SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- MTT Assay에 의한 세포독성 측정 − 각 추출물의 세포에 대한 독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다.
- Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법으로 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다.
- 총 Polyphenol 함량 측정 − Folin-Denis법을 이용하여 추출물의 polyphenol 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 50%의 DPPH radical을 소거할 때 필요한 시료의 농도인 SC50에서 48시간 발효와 72시간 발효 조건의 추출물이 각각 37.92 μg/mL, 34.76 μg/mL를 나타냄으로써 positive control로 사용된 ascorbic acid의 2.17 μg/mL를 기준으로 환산한 비교활성(relative activity; positive control의 활성을 100%로 설정)에서 각각 5.72%와 6.24% 수준으로 확인되었다.
- 50%의 tyrosinase를 저해할 때 필요한 농도인 IC50에서 48시간 발효와 72시간 발효 조건의 추출물이 각각 5.86 μg/mL, 6.17 μg/mL를 나타냄으로써 positive control로 사용된 arbutin의 2.72 μg/mL를 기준으로 환산한 비교활성(relative activity)에서 각각 46.42%와 44.08% 수준의 활성임을 확인할 수 있었다.
- 500 μg/mL로 발효 추출물을 처리한 경우에 54.29~80.62%의 세포생존율을 나타냄으로써 세포 증식을 다소 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 측정한 황칠나무 잎 열수 추출물과 발효 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 Table III에 나타내었다. DPPH radical 소거능과 마찬가지로 열수 추출물에 비해 발효를 실시한 추출물에서 tyrosinase 저해 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 50%의 tyrosinase를 저해할 때 필요한 농도인 IC50에서 48시간 발효와 72시간 발효 조건의 추출물이 각각 5.
- Melanin 생성 억제 활성 − 본 연구에서 실시한 측정 결과, 발효를 하지 않은 열수 추출물에 비해 발효를 실시한 추출물에서 melanin의 생성을 억제하는 효과가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. Fig. 2에 나타낸 바와 같이 tyrosinase 저해 활성과 유사하게 발효 시간은 48시간 발효 조건이 가장 효과적인 것으로 나타났으며, 양성대조군인 arbutin의 동일한 농도의 효과와 비교에서도 melanin 생성 억제 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다. 황칠나무 잎의 melanin 생성 억제 효과와 관련하여 50% ethanol 추출물을 대상으로 한 기존 연구에서 tyrosinase와 TRP-2의 발현 억제를 통하여 melanin 생성을 저해하는 효과가 있는 것으로 보고되었으며,18) 열수 추출물의 hexane 분획에서 분리한 1-tetradecanol이 미백 관련 효과가 있음을 확인하는 연구 등이 있었다.
- Melanin 생성 억제 활성 − 본 연구에서 실시한 측정 결과, 발효를 하지 않은 열수 추출물에 비해 발효를 실시한 추출물에서 melanin의 생성을 억제하는 효과가 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
- 08% 수준의 활성임을 확인할 수 있었다. 또한 24시간 발효 조건보다 48시간과 72시간 발효 조건의 추출물에서 활성이 현저하게 증가되었으며, 48시간과 72시간 발효 조건 간의 유의한 차이는 없는 것으로 나타남으로써 48시간의 발효 시간이 적정한 것으로 판단되었다.
- 24% 수준으로 확인되었다. 발효 시간에 따라 소거능이 증가되었지만 48시간과 72시간 발효 조건 간의 유의성은 없는 것으로 나타났다. 이와 같은 항산화 활성은 Table I의 polyphenol 함량과 관련하여 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이polyphenol 화합물의 함량과 연관성이 높은 것으로 판단된다.
- 09 mg/g으로 가장 높은 것이 확인되었다. 발효 시간에 따라서도 함량이 증가되는 것으로 나타났지만 72시간 발효 조건 추출물의 총 polyphenol 함량의 증가는 24시간 발효 조건과 48시간 발효 조건 사이 증가보다 현저하게 낮아져 통계적으로 유의한 증가는 아닌 것으로 확인되었다. 한편, 발효에 의해 polyphenol과 같은 활성 성분의 함량이 증가되는 것은 발효 미생물에 의해 생성되는 다양한 효소의 작용이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
- 황칠나무 잎 열수 추출물과 발효 추출물의 총polyphenol 함량을 측정한 결과를 Table I에 제시하였다. 발효를 실시하지 않은 황칠나무 열수 추출물에 비해 발효를 실시한 추출물에서 총 polypheol 함량이 증가되어 72시간 발효 조건 추출물에서 131.09 mg/g으로 가장 높은 것이 확인되었다. 발효 시간에 따라서도 함량이 증가되는 것으로 나타났지만 72시간 발효 조건 추출물의 총 polyphenol 함량의 증가는 24시간 발효 조건과 48시간 발효 조건 사이 증가보다 현저하게 낮아져 통계적으로 유의한 증가는 아닌 것으로 확인되었다.
- 본 연구에서는 최근 그 유용성으로 인해 연구가 증가되고 있는 생약재 추출물의 발효와 관련하여 황칠나무 잎 열수 추출물에서 유산균의 일종인 Lactobacillus plantarum을 이용한 발효가 미치는 효과 중 미백 관련 활성을 확인하였다. 연구의 결과에서 L. plantarum을 이용하여 황칠나무 잎 열수추출물을 발효시킴으로써 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성과 tyrosinase 저해 활성, 그리고 melanin 생성억제 등의 효과가 증진됨을 확인할 수 있었다. 이는 L.
- )를 산출하여 Table II에 나타내었다. 황칠나무 열수 추출물에 비해 발효를 실시한 추출물에서 DPPH radical 소거능이 증가되는 것을 확인하였다. 50%의 DPPH radical을 소거할 때 필요한 시료의 농도인 SC50에서 48시간 발효와 72시간 발효 조건의 추출물이 각각 37.
후속연구
- 황칠나무 잎의 melanin 생성 억제 효과와 관련하여 50% ethanol 추출물을 대상으로 한 기존 연구에서 tyrosinase와 TRP-2의 발현 억제를 통하여 melanin 생성을 저해하는 효과가 있는 것으로 보고되었으며,18) 열수 추출물의 hexane 분획에서 분리한 1-tetradecanol이 미백 관련 효과가 있음을 확인하는 연구 등이 있었다.19)이런 연구들의 결과와 본 연구에서의 발효에 의한 효과를 반영하여 추가적인 연구를 진행할 필요가 있을 것으로 판단된다.
- plantarum에 의한 발효 과정 중 생성되는 다양한 효소들의 작용에 의해 polyphenol과 같은 활성 성분이 증가된 것이 주요 원인으로 작용한 것으로 판단된다. 이와 같은 결과는 유산균을 이용한 생약재나 생약재 추출물의 발효가 피부 미백이나 항산화 활성 등을 증진시킬 수 방법으로 활용될 수 있음을 보여주는 것이라 판단되며, 활성의 증진에 영향을 주는 발효 인자나 성분에 대한 추가적인 연구를 진행한다면 보다 효과적인 발효공정 활용 방안의 도출이 가능할 것으로 사료된다.
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