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문제 정의
- 본 연구는 약용식물로의 활용 가치가 높은 노니의 이용 효율을 극대화시키기 위하여 연중 균일한 품질의 생리활성물질 생산이 가능한 부정근 형태의 재료를 이용하여 생리활성물질에 대해 추출용매, 추출방법, 추출단계 등을 조절하여 체계적인 추출 조건을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 2개월 정도 자란 식물체는 25±1℃가 유지되는 배양실에서 20 µmol·m−2·s−1 (16시간 명, 8시간 암) 조건으로 배양하였다.
- 종자는 2% 하이포염소산소듐(sodium hypoChlorite) 용액을 이용하여 20분 동안 표면 살균한 후 살균수로 3회 세척하여 오염원을 제거하였다. 그 후 종피에 clip으로 상처를 준 다음 슈크로즈(sucrose) 30 g/L가 첨가된 MS 배지에 치상하여 식물체를 유도하였다. 2개월 정도 자란 식물체는 25±1℃가 유지되는 배양실에서 20 µmol·m−2·s−1 (16시간 명, 8시간 암) 조건으로 배양하였다.
- 노니 부정근 유효성분의 효율적인 추출조건을 규명하고자 용매 종류, 물과 메탄올의 비율(물, 20, 40, 60, 80, 100%), 추출시간 및 추출방법을 달리하여 실험을 진행하였다. 안트라퀴논, 페놀성 화합물 및 플라보노이드의 용매별 추출한 결과 1시간 동안 초음파 추출 시 60-80% 메탄올에서 효과적이었으며, 환류냉각 추출기로 2시간 추출 시 80% 메탄올에서 효과적이었다.
- 안트라퀴논, 페놀성 화합물 및 플라보노이드의 용매별 추출한 결과 1시간 동안 초음파 추출 시 60-80% 메탄올에서 효과적이었으며, 환류냉각 추출기로 2시간 추출 시 80% 메탄올에서 효과적이었다. 노니 부정근의 유효성분에 대한 추출방법 및 시간에 따른 추출효율을 비교하기 위하여 교반추출, 환류냉각추출, 초음파추출, 균질기추출, 초고압추출, 침지추출을 실시하였다. 페놀성 화합물은 초음파추출에서 가장 높은 함량을 보였으며 안트라퀴논과 플라보노이드함량은 환류냉각추출에서 가장 높게 나타났다.
- 노니 부정근의 적정 추출시간 및 추출방법에 대한 추출효율을 모색하고자 추출장치별로 추출시간을 달리하여 추출하였다. 사용된 추출장치는 초음파 추출기, 진탕 추출기(BS-31, Jeio-tech, Dae-jeon, Korea), 환류냉각 추출기, 균질기(homogenizer) (T25, IKA, Wilmington, NC, USA), 초고압 추출기(TFS-10, Dimapureteck, Inchon, Korea), 배양기(VS-8480SRN, Vision scientific, Daejeon, Korea)를 이용하였다.
- 노니 종자로부터 유도된 2개월 된 기내 식물체의 어린잎을 1.0 cm×1.0 cm씩 취하여 IBA 1 mg/L, sucrose 30 g/L가 첨가된 1 MS 배지에 치상하여 20 µmol·m−2 ·s−1 (16시간 명, 8시간 암) 조건에서 부정근을 유도하였다.
- 환류냉각추출 추출기를 이용한 추출은 80% 메탄올을 추출용매로 사용하여 2, 4, 6, 8시간 동안 추출하였다. 또한, 균질기를 이용한 추출은 0.5, 1, 2, 4시간 동안 10,000 rpm에서 추출하였다. 초고압 추출기를 이용한 추출은 6, 12, 24, 48시간 동안 1,000 bar, 25℃에서 추출하였다.
- 0 cm씩 취하여 IBA 1 mg/L, sucrose 30 g/L가 첨가된 1 MS 배지에 치상하여 20 µmol·m−2 ·s−1 (16시간 명, 8시간 암) 조건에서 부정근을 유도하였다. 유도된 부정근은 내용적이 5 L인풍선형 생물반응기에 IBA 5 mg/L, sucrose 10 g/L 가 첨가된 0.25 MS 배지로 옮겨 5주 간격으로 유지-증식시켰다. 배지는 1 N 수산화소듐(NaOH)를 이용하여 pH 5.
- 5, 1, 2, 4, 6, 8, 10시간 동안 추출하였다. 진탕 추출은 진탕기(shaker)를 이용하여 6, 12, 24, 48시간 동안실온에서 150 rpm으로 진탕 추출하였다. 환류냉각추출 추출기를 이용한 추출은 80% 메탄올을 추출용매로 사용하여 2, 4, 6, 8시간 동안 추출하였다.
- 5, 1, 2, 4시간 동안 10,000 rpm에서 추출하였다. 초고압 추출기를 이용한 추출은 6, 12, 24, 48시간 동안 1,000 bar, 25℃에서 추출하였다. 침지 추출은6, 12, 24, 48시간 동안 배양기를 이용하여 25℃에서 추출하였다.
- 사용된 추출장치는 초음파 추출기, 진탕 추출기(BS-31, Jeio-tech, Dae-jeon, Korea), 환류냉각 추출기, 균질기(homogenizer) (T25, IKA, Wilmington, NC, USA), 초고압 추출기(TFS-10, Dimapureteck, Inchon, Korea), 배양기(VS-8480SRN, Vision scientific, Daejeon, Korea)를 이용하였다. 초음파추출은 추출효율이 가장 높았던 60%메탄올의 추출 용매비로 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10시간 동안 추출하였다. 진탕 추출은 진탕기(shaker)를 이용하여 6, 12, 24, 48시간 동안실온에서 150 rpm으로 진탕 추출하였다.
- 총 안트라퀴논 측정은 Zenk 등(13)의 방법을 수정하여 분석하였다. 추출방법 별로 추출한 시료를 여과한 후 메탄올로 5배 희석하여 well plate에 200 µL씩 분주하였다.
- 5mL를 첨가하여 교반한 후 30분간 암실(20℃)에서 방치한 다음 microplate reader (Bio Tek)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀성 화합물의 표준물질로는 갈산(gallic acid)을 사용하였으며, 농도 별(0, 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 ppm)로 희석한 표준물질로부터 얻은 보정선을 이용하여 총 페놀성 화합물 함량을 갈산의 %농도로 나타내었다.
- 추출용매 비율에 따른 유효성분의 함량 변화를 확인하기 위하여 추출용매 중 추출효율이 가장 높았던 메탄올에 물의 혼합비율을 달리하여 추출 실험을 진행하였다. 혼합비율은 물, 20, 40, 60, 80, 100% (v/v) 메탄올로 하였고 추출용매에 따른 유효성분의 함량 비교를 위해 초음파 추출기, 환류냉각 추출기(C-WB, Chang shin science, Seoul, Korea)을 사용하였다.
- 건조된 노니 부정근 1g에 각 용매별로 100 mL를 넣고 초음파 추출기(5510, Bran-son, North Olmsted, OH, USA)를 이용하여 추출하였으며 주파수는 42 kHz이었다. 추출하는 동안 온도 증가를 방지하기 위해 용기 내 온도가 30℃이상 증가 시 증류수를 교환하여 온도를 조절하였다. 추출된 시료는 0.
- 초고압 추출기를 이용한 추출은 6, 12, 24, 48시간 동안 1,000 bar, 25℃에서 추출하였다. 침지 추출은6, 12, 24, 48시간 동안 배양기를 이용하여 25℃에서 추출하였다.
- 추출용매 비율에 따른 유효성분의 함량 변화를 확인하기 위하여 추출용매 중 추출효율이 가장 높았던 메탄올에 물의 혼합비율을 달리하여 추출 실험을 진행하였다. 혼합비율은 물, 20, 40, 60, 80, 100% (v/v) 메탄올로 하였고 추출용매에 따른 유효성분의 함량 비교를 위해 초음파 추출기, 환류냉각 추출기(C-WB, Chang shin science, Seoul, Korea)을 사용하였다. 초음파추출은 건조된 노니 부정근 1g에 각 용매별로 100 mL를 넣고 60분간 추출하였으며 환류냉각 추출은 80℃에서 2시간 동안 추출 후 0.
- 진탕 추출은 진탕기(shaker)를 이용하여 6, 12, 24, 48시간 동안실온에서 150 rpm으로 진탕 추출하였다. 환류냉각추출 추출기를 이용한 추출은 80% 메탄올을 추출용매로 사용하여 2, 4, 6, 8시간 동안 추출하였다. 또한, 균질기를 이용한 추출은 0.
대상 데이터
- 노니 부정근의 시료 추출 및 분석용으로 사용된 용매는 B&J사(Muskegon, MI, USA)의 HPLC급 시약을 사용하였고, 흡광도는 microplate reader (MQX200R, Bio Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 680 nm에서 측정하였다.
- 노니 부정근의 유효활성 물질의 용매별 추출효율을 확인하기 위하여 극성이 다른 여러 종류의 추출용매를 사용하였다. 사용된 추출용매는 물, 에탄올, 메탄올, 아세나이트릴, 아세톤, 메틸렌클로라이드로 HPLC급(B&J) 용매를 사용하였다.
- 사용된 추출용매는 물, 에탄올, 메탄올, 아세나이트릴, 아세톤, 메틸렌클로라이드로 HPLC급(B&J) 용매를 사용하였다.
- 노니 부정근의 적정 추출시간 및 추출방법에 대한 추출효율을 모색하고자 추출장치별로 추출시간을 달리하여 추출하였다. 사용된 추출장치는 초음파 추출기, 진탕 추출기(BS-31, Jeio-tech, Dae-jeon, Korea), 환류냉각 추출기, 균질기(homogenizer) (T25, IKA, Wilmington, NC, USA), 초고압 추출기(TFS-10, Dimapureteck, Inchon, Korea), 배양기(VS-8480SRN, Vision scientific, Daejeon, Korea)를 이용하였다. 초음파추출은 추출효율이 가장 높았던 60%메탄올의 추출 용매비로 0.
- 충북대학교 첨단원예기술개발연구센터 소재의 온실에서 재배한 5년생 노니 식물체로부터 성숙한 종자를 수확하여 기내 식물체 유도용 실험재료로 사용하였다. 종자는 2% 하이포염소산소듐(sodium hypoChlorite) 용액을 이용하여 20분 동안 표면 살균한 후 살균수로 3회 세척하여 오염원을 제거하였다.
- 추출방법 별로 추출한 시료를 여과한 후 메탄올로 5배 희석하여 well plate에 200 µL씩 분주하였다. 표준물질은 알리자린(alizarin) (Chromadex, Irvine, CA, USA)을 각 단계별로 희석하여microplate reader를 이용하여 434 nm에서 측정하였다.
데이터처리
- 평균값은 Duncan’s multiple range test (p<0.05)와 t-test (p<0.05)를 실시하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 총 플라보노이드 함량은 비색(colorimetric) 방법(14)을 이용하여 측정하였다. 각 방법 별로 추출한 노니 부정근 추출물 0.
- 폴린-시오칼토 시약(Folin-CioCalteu reagent)이 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브데넘이 청색으로 발색하는 것을 원리로 한 폴린-시오칼토 방법(15)을 이용하였다. 2.
성능/효과
- 균질기를 이용한 추출에서도 짧은 시간에 추출효율이 좋았다. 균질기를 이용한 추출 시 온도를 조절하지 않고 추출하였으며 이는 환류냉각 추출기가 침지 추출보다 효율이 높게 나온 결과와 비교할 때 온도 상승이 추출효율증가에 영향을 끼친 것으로 판단하였다.
- 노니 부정근을 환류냉각장치를 이용하여 유효성분인 안트라퀴논, 총 페놀성 화합물, 플라보노이드를 용매 혼합 비율에 따라 추출한 결과 각각 6.92, 6.50, 6.55%로 80% 메탄올에서 가장 높은 추출효과를 보였다(Table 3). 물과 20% 메탄올은 초음파추출 결과와 같이 상대적으로 낮은 추출효과를 보였다.
- 노니 부정근의 생리활성물질 추출에 적합한 추출용매를 선정하고자 초음파 추출기를 이용하여 용매별 추출효율을 확인한 결과 메탄올에서 안트라퀴논 함량이 4.19%로 가장 높았다(Table 1).다른 용매의 경우 에탄올(2.
- Hemwimol 등(19)의 연구 결과에 따르면 노니 뿌리의 안트라퀴논을 용매 비율별로 초음파 및 침지추출을 통해 함량을 분석한 결과 50% 에탄올에서 가장 추출효과가 좋았으며 20%와 100%에탄올로 추출할 경우 상대적으로 낮은 회수율을 보여 본 연구결과와 비슷한 결과를 보였다. 따라서 노니 부정근에서 안트라퀴논, 페놀, 플라보노이드를 초음파 추출기로 추출할 경우 60-80%메탄올이 가장 적절한 용매비율로 판단하였다.
- 하지만 안트라퀴논과 플라보노이드는 초음파추출과 동일하게 80% 메탄올에서 가장 높게 나타났다. 따라서 목적하는 유효성분의 추출효율을 극대화하기 위해서는 추출장치와 용매비율 선정을 우선적으로 고려해야 함을 알 수 있었다.
- 48%로 가장 높은 추출 효율을 보였으며 안트라퀴논과 같이 20% 메탄올과 물에서는 상대적으로 낮은 추출 효율을 보였다. 또한, 플라보노이드에서도 80% 메탄올로 추출할 때 추출효율이 6.37%로 가장 높게 나타났다.
- 9%까지 증가하여 100% 에탄올보다 회수율이 월등하게 높았다고 보고하였다. 본 실험 결과에서는 초음파추출 시 실온에서 추출하였으며 2시간 추출한 경우와 6시간 교반 추출 할 때 함량이 비슷했지만, 교반 추출의 경우 오히려 시간이 경과 할수록 함량이 감소되는 경향을 보여 안트라퀴논을 교반 추출 할 경우는 추출시간이 짧을수록 좋은 것으로 판단하였다. 본 연구에서 속슬렛에 의한 추출법의 시험은 수행하지 않았지만 본 실험결과에서는 환류냉각추출기를 이용하였을 때 가장 높은 추출효율을 보였다.
- 본 실험결과에서는 메탄올을 용매로 하여 초음파 추출할 때 노니 부정근 내 안트라퀴논, 총 페놀성 화합물, 플라보노이드의 추출함량이 가장 높게 나타나 메탄올을 효율적인 추출용매로 판단하였다.
- 또한, 총 페놀성 화합물의 추출효율이 시간이 증가함에 따라 함량이 크게 증가하지 않는다고 보고하였다. 본 실험결과에서도 추출시간이 경과함에 따라 추출효율의 증가폭이 크지 않으므로 식물체내에서 페놀성 화합물을 추출할 경우 추출초기에 대부분 추출되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 환류냉각 추출기와 진탕추출기를 이용하여 추출한 결과 시간이 증가할수록 오히려 함량이 감소하는 경향을 보여 과도한 추출시간은 페놀 추출 시 적당하지 않았다.
- 본 실험 결과에서는 초음파추출 시 실온에서 추출하였으며 2시간 추출한 경우와 6시간 교반 추출 할 때 함량이 비슷했지만, 교반 추출의 경우 오히려 시간이 경과 할수록 함량이 감소되는 경향을 보여 안트라퀴논을 교반 추출 할 경우는 추출시간이 짧을수록 좋은 것으로 판단하였다. 본 연구에서 속슬렛에 의한 추출법의 시험은 수행하지 않았지만 본 실험결과에서는 환류냉각추출기를 이용하였을 때 가장 높은 추출효율을 보였다. 플라보노이드는 환류냉각 추출기로 4시간 추출하였을 경우 5.
- 노니 부정근 유효성분의 효율적인 추출조건을 규명하고자 용매 종류, 물과 메탄올의 비율(물, 20, 40, 60, 80, 100%), 추출시간 및 추출방법을 달리하여 실험을 진행하였다. 안트라퀴논, 페놀성 화합물 및 플라보노이드의 용매별 추출한 결과 1시간 동안 초음파 추출 시 60-80% 메탄올에서 효과적이었으며, 환류냉각 추출기로 2시간 추출 시 80% 메탄올에서 효과적이었다. 노니 부정근의 유효성분에 대한 추출방법 및 시간에 따른 추출효율을 비교하기 위하여 교반추출, 환류냉각추출, 초음파추출, 균질기추출, 초고압추출, 침지추출을 실시하였다.
- 초음파 추출기를 이용하여 용매 비율 별로 안트라퀴논의 함량을 분석한 결과 80% 메탄올에서 안트라퀴논 함량이 6.45%로 가장 높은 결과를 보였으며 20% 메탄올과 물로 추출했을 때는 다른 용매비율에 비해 안트라퀴논의 추출 효율이 현저히 감소하였다(Table 2). 페놀의 경우 60% 메탄올 추출에서 10.
- 물과 20% 메탄올은 초음파추출 결과와 같이 상대적으로 낮은 추출효과를 보였다. 총 페놀성 화합물의 추출효율은 초음파추출 시 60% 메탄올에서 가장 높은데 반해 환류냉각 추출 시 80% 메탄올에서 가장 높은 추출효율을 보여 조금 다른 결과를 보였다. 하지만 안트라퀴논과 플라보노이드는 초음파추출과 동일하게 80% 메탄올에서 가장 높게 나타났다.
- 추출방법 및 시간 별로 시료를 초음파 추출하여 안트라퀴논을 분석한 결과 시간이 경과함에 따라 함량이 감소하였다(Table 4).안트라퀴논의 경우 환류냉각추출로 6시간 추출하였을 때 6.
- 페놀성 화합물 및 플라보노이드도 메탄올로 추출하였을 때 가장 높은 추출 효과를 보여 각각 4.37, 4.42%의 함량을 보였으며 에탄올>아세토니트릴>메틸렌클로라이드>아세톤의 용매 순으로 높은 추출효율을 나타내었다.
- 노니 부정근의 유효성분에 대한 추출방법 및 시간에 따른 추출효율을 비교하기 위하여 교반추출, 환류냉각추출, 초음파추출, 균질기추출, 초고압추출, 침지추출을 실시하였다. 페놀성 화합물은 초음파추출에서 가장 높은 함량을 보였으며 안트라퀴논과 플라보노이드함량은 환류냉각추출에서 가장 높게 나타났다.
- 94%로 가장 높은 함량을 보였으며 초음파추출과 같은 경향으로 시간이 지남에 따라 함량이 감소하였다. 하지만 총 페놀성 화합물의 경우 추출시간이 늘어날수록 함량이 증가하는 경향을 보였으며 초음파를 이용하여 10시간 추출하였을 때 총 페놀성 화합물이 7.30%로 가장 좋은 추출효율을 보였다. 한편, 초고압추출기를 이용하여 48시간 추출하였을 때 추출효율이 7.
- 본 실험결과에서도 추출시간이 경과함에 따라 추출효율의 증가폭이 크지 않으므로 식물체내에서 페놀성 화합물을 추출할 경우 추출초기에 대부분 추출되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 환류냉각 추출기와 진탕추출기를 이용하여 추출한 결과 시간이 증가할수록 오히려 함량이 감소하는 경향을 보여 과도한 추출시간은 페놀 추출 시 적당하지 않았다.
후속연구
- 특히 노니 뿌리는 다른 부위에 비해 안트라퀴논(anthraquinone)의 함유량이 높아 다양한 생리활성 작용을 기대할 수 있으므로 이에 대한 연구가 진행되고 있으나 주로 기외 식물체의 뿌리를 사용하므로 원료의 확보 및 균일성의 제약이 따른다. 하지만 조직배양을 통한 노니 부정근을 확보하고 노니 부정근의 성분분석 및 생리활성 작용을 평가한다면 연구에 대한 효율성이 증가될 수 있으며 제품화를 통한 산업화에도 유리할 것이다.
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