뇌전증은 뇌신경세포의 과흥분으로 인한 발작증상을 동반하는 질환이며, 최근 대단위 환자유전체 정보기술의 발달로 인해 뇌전증 발병의 원인으로서 유전자적 요인이 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 지적장애 및 뇌전증 증상을 가지는 Miles-Carpenter syndrome (MCS)의 원인유전자에 대한 녹아웃동물을 활용하여 뇌전증 연구모델로 개발하고자 하였다. MCS 녹아웃 제브라피쉬는 억제성 GABA신경세포의 결손으로 인하여 비정상적으로 과다하게 움직이는 표현형을 나타내며, 이는 뇌전증 환자에서 보여지는 발작증상과 매우 유사한 것으로 판명되고 있다. 뇌전증 연구모델로 개발하기 위해, 기존에 알려진 뇌전증 치료제인 레티가빈을 MCS 녹아웃 제브라피쉬에 처리하여 약효를 평가하였으며 증상이 완화되는 것을 확인하였다. 이상의 결과들을 바탕으로 MCS 녹아웃동물이 향후 뇌전증 기전연구를 위한 동물모델로서의 융합적인 활용이 기대된다.
뇌전증은 뇌신경세포의 과흥분으로 인한 발작증상을 동반하는 질환이며, 최근 대단위 환자유전체 정보기술의 발달로 인해 뇌전증 발병의 원인으로서 유전자적 요인이 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 지적장애 및 뇌전증 증상을 가지는 Miles-Carpenter syndrome (MCS)의 원인유전자에 대한 녹아웃동물을 활용하여 뇌전증 연구모델로 개발하고자 하였다. MCS 녹아웃 제브라피쉬는 억제성 GABA신경세포의 결손으로 인하여 비정상적으로 과다하게 움직이는 표현형을 나타내며, 이는 뇌전증 환자에서 보여지는 발작증상과 매우 유사한 것으로 판명되고 있다. 뇌전증 연구모델로 개발하기 위해, 기존에 알려진 뇌전증 치료제인 레티가빈을 MCS 녹아웃 제브라피쉬에 처리하여 약효를 평가하였으며 증상이 완화되는 것을 확인하였다. 이상의 결과들을 바탕으로 MCS 녹아웃동물이 향후 뇌전증 기전연구를 위한 동물모델로서의 융합적인 활용이 기대된다.
Epilepsy is a neurological disease characterized by recurrent seizures. Though the exact causes for epilepsy are unknown, genetic mutations, especially altered gene functions, have been implicated as key causative components of epilepsy. We recently identified a causing gene for the Miles-Carpenter ...
Epilepsy is a neurological disease characterized by recurrent seizures. Though the exact causes for epilepsy are unknown, genetic mutations, especially altered gene functions, have been implicated as key causative components of epilepsy. We recently identified a causing gene for the Miles-Carpenter syndrome (MCS). MCS patients have intellectual disability and epilepsy. MCS knockout (KO) zebrafish also show a seizure-like phenotype with hyperactivity of pectoral fin and jaw movement, resulting from loss of GABAergic interneurons. To evaluate MCS KO zebrafish as an epilepsy model, we tested the effects of retigabine, an anticonvulsant drug, on the movement of MCS KO zebrafish.
Epilepsy is a neurological disease characterized by recurrent seizures. Though the exact causes for epilepsy are unknown, genetic mutations, especially altered gene functions, have been implicated as key causative components of epilepsy. We recently identified a causing gene for the Miles-Carpenter syndrome (MCS). MCS patients have intellectual disability and epilepsy. MCS knockout (KO) zebrafish also show a seizure-like phenotype with hyperactivity of pectoral fin and jaw movement, resulting from loss of GABAergic interneurons. To evaluate MCS KO zebrafish as an epilepsy model, we tested the effects of retigabine, an anticonvulsant drug, on the movement of MCS KO zebrafish.
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문제 정의
뇌전증의 원인에 관한 연구에서 억제성 GABA신경세포의 불균형과 뇌전증의 관계가 밀접하다는 연구결과를 바탕으로 [15], 본 연구에서는 GABA신경세포 결손의 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 이용하여 뇌전증 모델동물로서의 활용 가능성을 검증하였다. 한편, 뇌전증은 자폐증을 함께 동반하는 경우도 많으며, 제브라피쉬를 이용한 자폐증 연구도 시작되고 있다.
본 연구는 뇌전증의 분자기전에 관련한 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 활용하여, 뇌전증의 원인치료가 가능한 신약을 개발하기 위한 기반을 확립하고자 한다. 먼저, MCS 녹아웃 제브라피쉬에서 기존에 알려진 뇌전증 치료제의 약효를 평가함으로써, 뇌전증 모델동물로서의 활용 가능성을 생물학적으로 검증하고자 하였다.
본 연구는 뇌전증의 분자기전에 관련한 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 활용하여, 뇌전증의 원인치료가 가능한 신약을 개발하기 위한 기반을 확립하고자 한다. 먼저, MCS 녹아웃 제브라피쉬에서 기존에 알려진 뇌전증 치료제의 약효를 평가함으로써, 뇌전증 모델동물로서의 활용 가능성을 생물학적으로 검증하고자 하였다.
약물 처리에 따른 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 행동변화를 분석하고자 하였다. 먼저 자유 수영을 관찰하기 위해, 5일째의 wild-type (WT) 과 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 배아 배지안의 슬라이드 글라스에 위치시켰다.
제안 방법
MCS 녹아웃 제브라피쉬는 비정상적인 가슴지느러미의 움직임을 보이며, 특히 어류의 가슴지느러미는 인간의 팔과 진화적으로 상동기관이며 [10], 인간 뇌전증 환자가 경련을 일으킬 때 팔과 다리를 떠는 모습과 매우 유사하다. MCS 녹아웃 제브라피쉬의 표현형을 이용하여 뇌전증 질환 모델로서 활용이 가능함을 확인하기 위해 약효실험을 수행하였다.
많은 수의 제브라피쉬 행동을 신속하게 관찰할 수 있는 장비인 DanioVision (Noldus)과 이를 분석하는 소프트웨어인 Ethovision XT (Noldus)를 이용하여 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 행동을 분석하였다. WT과 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 96-well plate에 한 마리씩 분주한 뒤, 5분간 촬영하였다.
약물 처리에 따른 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 행동변화를 분석하고자 하였다. 먼저 자유 수영을 관찰하기 위해, 5일째의 wild-type (WT) 과 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 배아 배지안의 슬라이드 글라스에 위치시켰다. 제브라피쉬는 입체현미경 (LEICA, MZ16), 카메라 (LEICA DC300FX) 및 이미지 소프트웨어 (LEICA, IM50)를 이용하여 관찰하였다.
5 및 5μM의 농도로 30분 동안 처리하였다 [11]. 모든 처리는 대조군 약물과 함께 진행되었으며, 약물에 대한 음성대조군으로 0.5% DMSO를 처리하였다. 약물을 처리하기 전, MCS 녹아웃 제브라피쉬의 움직임을 정량적으로 나타내기 위하여 10초 동안 측정하였을 때, WT 제브라피쉬가 평균 2.
비정상적인 과잉 행동장애를 보이는 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 원인을 알아보기 위해 억제성 GABA신경세포의 분자마커인 vsx1를 이용해 발현정도를 확인해 보았다 [9]. 수정 후 48시간째, vsx1은 눈을 비롯하여 후뇌 (hindbrain)의 특정 신경세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있다.
약물로서는 칼륨채널 조절제 (potassium channel opener)로 작용하며, 2010년 미국 FDA (Food and Drug Administration)로 승인받은 레티가빈을 1, 2.5 및 5μM의 농도로 30분 동안 처리하였다 [11].
뇌전증 모델로서 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 활용성을 검증하기 위하여 현재 시판되고 있는 뇌전증 치료제인 레티가빈 (Sigma Aldrich)을 이용하였다. 약물을 처리하기 전에 MCS 녹아웃 제브라피쉬와 WT 제브라피쉬를 96-well plate에 한 마리씩 분주한 뒤, 10초 동안 가슴지느러미와 턱의 움직임을 측정하였다. 여러 농도의 레티가빈을 약 30분 동안 노출시킨 후, 다시 10초간 가슴지느러미와 턱의 움직임을 측정하였다.
약물을 처리하기 전에 MCS 녹아웃 제브라피쉬와 WT 제브라피쉬를 96-well plate에 한 마리씩 분주한 뒤, 10초 동안 가슴지느러미와 턱의 움직임을 측정하였다. 여러 농도의 레티가빈을 약 30분 동안 노출시킨 후, 다시 10초간 가슴지느러미와 턱의 움직임을 측정하였다.
에서 보는 바와 같이 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 후뇌에서 억제성 GABA신경세포의 유전자 마커인 vsx1의 발현이 감소되었으며, 이로 인한 비정상적인 운동조절에 따라 과잉 운동장애가 유발되는 것으로 유츄되고 있다. 입과 턱의 비정상적인 운동장애에 대한 레티가빈의 약효를 측정하였다. 약물을 처리하기 전, 대조군은 10초간 평균 1회 움직이는 반면 MCS 녹아웃 제브라피쉬는 11회 정도의 빠른 움직임을 보였다.
제브라피쉬 개체의 유영 및 이동거리의 관찰 및 분석이 가능한 장치인 DanioVision을 이용하여 WT과 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 행동을 비교하였다.
먼저 자유 수영을 관찰하기 위해, 5일째의 wild-type (WT) 과 MCS 녹아웃 제브라피쉬를 배아 배지안의 슬라이드 글라스에 위치시켰다. 제브라피쉬는 입체현미경 (LEICA, MZ16), 카메라 (LEICA DC300FX) 및 이미지 소프트웨어 (LEICA, IM50)를 이용하여 관찰하였다. 자유 수영의 녹화와 모니터 디스플레이는 Camtasia Studio software (TechSmith, Vesion 7.
제브라피쉬에서 억제성 GABA 신경세포 마커인 vsx1의 발현양상을 확인해보기 위해 pGEM T-easy vector (Promega)에 삽입되어 있는 vsx1 플라스미드 벡터를 Sac II 제한효소로 절단하고, SP6 RNA polymerase (Fermentas)와 Digoxygenin-labelled UTP mixture (Roche)를 사용하여 Digoxygenin-labelled anti-sense mRNA probe를 제작하였다. 이를 이용한 whole-mount in situ hybridization 기법은 기존에 알려진 방법을 통해 수행하였다 [8].
5℃의 생육 온도를 유지한 어항에서 사육하였으며, 먹이는 brine shrimp를 부화시켜 사용하였다. 제브라피쉬의 산란과 수정은 빛에 의해 유도되므로 낮 14시간, 밤 10시간의 명암주기로 조절하였다. 전날 오후에 암·수 한 쌍을 전용 mating cage에 넣어준 후 다음날 오전에 수정란을 채집하였으며, 수집된 수정란은 28.
그 후, 레티가빈을 5uM 농도로 약 30분 동안 노출시킨 후, 다시 5분간 촬영하였다. 촬영된 영상을 이용하여 WT과 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 움직임을 추적하여 행동양상을 분석하였다.
대상 데이터
1] Pictures of patients with Miles-Carpenter syndrome (MCS). A, 32-year old male with intellectual disability and epilepsy. B, 31-year old male cousin with facial asymmetry, left extropia, and ptosis [5].
뇌전증 모델로서 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 활용성을 검증하기 위하여 현재 시판되고 있는 뇌전증 치료제인 레티가빈 (Sigma Aldrich)을 이용하였다. 약물을 처리하기 전에 MCS 녹아웃 제브라피쉬와 WT 제브라피쉬를 96-well plate에 한 마리씩 분주한 뒤, 10초 동안 가슴지느러미와 턱의 움직임을 측정하였다.
5℃의 배양기에서 발생시켰다 [7]. 수정 후 5일째부터 해부현미경을 통해 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 표현형이 관찰되므로 이를 선별하여 실험에 이용하였다. 제브라피쉬를 이용한 실험은 충남대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다 (승인번호 CNU-00620).
이론/모형
제브라피쉬에서 억제성 GABA 신경세포 마커인 vsx1의 발현양상을 확인해보기 위해 pGEM T-easy vector (Promega)에 삽입되어 있는 vsx1 플라스미드 벡터를 Sac II 제한효소로 절단하고, SP6 RNA polymerase (Fermentas)와 Digoxygenin-labelled UTP mixture (Roche)를 사용하여 Digoxygenin-labelled anti-sense mRNA probe를 제작하였다. 이를 이용한 whole-mount in situ hybridization 기법은 기존에 알려진 방법을 통해 수행하였다 [8].
제브라피쉬는 입체현미경 (LEICA, MZ16), 카메라 (LEICA DC300FX) 및 이미지 소프트웨어 (LEICA, IM50)를 이용하여 관찰하였다. 자유 수영의 녹화와 모니터 디스플레이는 Camtasia Studio software (TechSmith, Vesion 7.0) 를 이용하였다. 가슴지느러미 및 턱 운동의 관찰을 위해 제브라피쉬는 3% 메틸셀룰로오스에 고정을 하였다.
성능/효과
Figure. 2.에서 보는 바와 같이 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 후뇌에서 억제성 GABA신경세포의 유전자 마커인 vsx1의 발현이 감소되었으며, 이로 인한 비정상적인 운동조절에 따라 과잉 운동장애가 유발되는 것으로 유츄되고 있다. 입과 턱의 비정상적인 운동장애에 대한 레티가빈의 약효를 측정하였다.
5μM 농도의 레티가빈으로 처리한 MCS 녹아웃 제브라피쉬에서는 턱의 움직임이 평균 2회 정도로 회복되는 것을 관찰하였다 [Fig. 4].
5% DMSO를 처리하였다. 약물을 처리하기 전, MCS 녹아웃 제브라피쉬의 움직임을 정량적으로 나타내기 위하여 10초 동안 측정하였을 때, WT 제브라피쉬가 평균 2.92회 움직이는 반면 MCS 녹아웃 제브라피쉬는 23.29회의 비정상적으로 빠른 움직임을 보였다 [Fig. 3]. 한편, 레티가빈 1μM 또는 2.
후속연구
이러한 제브라피쉬 동물 모델은 향후 불안, 중독 등 뇌신경 정신질환 및 신경행동학 분야의 다양한 융합연구에도 활용이 가능할 것이다[16,17,18,19,20,21,22]. 본 연구를 통해, 뇌전증 치료제인 레티가빈에 의해 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 비정상적인 과잉 운동장애가 호전될 수 있음을 확인하였으며, 향후 MCS 녹아웃 제브라피쉬가 뇌전증 모델동물로 사용될 수 있으며, 새로운 치료제 스크리닝 기술로도 활용되어질 수 있음이 제시되었다.
한편, 뇌전증은 자폐증을 함께 동반하는 경우도 많으며, 제브라피쉬를 이용한 자폐증 연구도 시작되고 있다. 이러한 제브라피쉬 동물 모델은 향후 불안, 중독 등 뇌신경 정신질환 및 신경행동학 분야의 다양한 융합연구에도 활용이 가능할 것이다[16,17,18,19,20,21,22]. 본 연구를 통해, 뇌전증 치료제인 레티가빈에 의해 MCS 녹아웃 제브라피쉬의 비정상적인 과잉 운동장애가 호전될 수 있음을 확인하였으며, 향후 MCS 녹아웃 제브라피쉬가 뇌전증 모델동물로 사용될 수 있으며, 새로운 치료제 스크리닝 기술로도 활용되어질 수 있음이 제시되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
뇌전증이란 무엇인가?
뇌전증 혹은 간질 (epilepsy)은 만성적인 뇌신경 장애로, 2회 이상 되풀이되는 간질성 발작 (epileptic seizure)을 일으키는 증상으로 정의하고 있으며, 전 연령에 걸쳐서 1,000명중 5~10명의 비율로 나타나고 있다 [1]. 발작은 뇌신경세포의 비정상적인 전기적 신호 활동으로 인하여 신경계에 이상 흥분상태가 발생하는 증상을 의미하며, 그 원인은 크게 유전적 요인과 후천적 요인으로 구분할 수 있다.
뇌전증 발병의 원인과 관련된 유전자는 어떤 역할을 하고 있는가?
하지만, 최근 대단위 환자유전체 정보기술의 발달로 인해 뇌전증 발병의 원인으로서 유전자적 요인이 조금씩 밝혀지고 있다. 지금까지 알려진 뇌전증 발병에 관련된 유전자는 뇌신경계의 이온채널 (ion channel), GABA (gamma-aminobutylric acid), GPCR (G proteincoupled receptor)에 직·간접적으로 영향을 주는 역할을 하고 있다 [2].
현재까지 뇌전증 치료제로 무엇이 사용되고 있는가?
현재까지 뇌전증 치료제는 항경련제, 마취제, 근육이완제 등이 사용되고 있으나, 원인치료가 아닌 대체요법인 경우가 대부분이다. 환자의 약 60%가 한 가지 치료제를 복용하고, 약 5~10%의 환자는 두 가지 이상의 약물을 병용하여 발작 증세를 완화시킨다.
참고문헌 (22)
M. Pandolfo, "Genetics of Epilepsy", Seminars in Neurology, Vol. 30, No. 5, pp. 506-518, 2011.
S. F. Berkovic, J. C. Mulley, I. E. Scheffer, and S. Petrou, "Human Epilepsies: Interaction of Genetic and Acquired Factors", Trends in Neurosciences, Vol. 29, No. 7, pp. 391-397. 2006.
J. Y. Lee, W. S. Choi, S. H. Eun, B. L. Eun, Y. S. Hong, and J. W. Lee, "Use of Herbal Medicine in Epileptic Children", Korean Journal of Pediatrics, Vol. 51, No. 4, pp. 451-419. 2008.
J. H. Miles and N. J. Carpenter, "Unique X-Linked Mental Retardation Syndrome with Fingertip Arches and Contractures Linked to Xq21. 31", American Journal of Medical Genetics, Vol. 38, No. 2-3, pp. 215-223. 1991.
M. May, K. S. Hwang, J. Miles, C. Williams, T. Niranjan, S. G. Kahler, P. Chiurazzi, K. Steindl, P. J. Van Der Spek, S. Swagemakers, J. Mueller, S. Stefl, E. Alexov, J. I. Ryu, J. H. Choi, H. T. Kim, P. Tarpey, G. Neri, L, Holloway, C. Skinner, R. E. Stevensson, R. I. Dorsky, T. Wang, C. E. Schwartz, and C. H. Kim, "ZC4H2, an XLID Gene, is Required for the Generation of a Specific Subset of CNS Interneurons", Human Molecular Genetics, Vol. 24, No. 17, pp. 4848-4861. 2015.
Y. Kimura, C. Satou, and S. Higashijima, "V2a and V2b Neurons are Generated by the Final Divisions of Pair-Producing Progenitors in the Zebrafish Spinal Cord", Development, Vol. 135, No. 18, pp. 3001-3005. 2008.
P. A. Forcelli, C. Sopera, A. Lekhkara, K. Galea, and A. Kondratyeva, "Anticonvulsant Effect of Retigabine during Postnatal Development in Rats", Epilepsy Research, Vol. 101, pp. 135-140. 2012.
Ma, L. H., Gilland, E., Bass, A. H. & Baker, R. "Ancestry of motor innervation to pectoral fin and forelimb", Nature Communiction, Vo. 1, No. 49, pp. 1-8. 2010..
Ma, L. H., Grove, C.L., Robert Baker, "Development of oculomotor circuitry independent of hox3 genes", Nature Communication, Vol. 5, No. 4221, pp. 1-12. 2013.
J. N, "Pathway-driven discovery of epilepsy genes", Nature Neurosciences, Vol. 18, No. 3, pp. 344-350. 2015.
M. Cunningham, J. H. Cho, A. Leung, G. Savvidis, S. Ahn, M. Moon, P. K. J. Lee, J. J. Han, N. Azimi, K. S. Kim, V. Y. Bolshakov, and S. Chung, "hPSC-Derived Maturing GABAergic Interneurons Ameliorate Seizure and Abnormal Behavior in Eplieptic Mice", Cell Stem Cell, Vol. 15, pp. 559-573. 2014.
Young-Lim Lee, "Limitations of neurobiological approach convergent to neuropsychiatry: DCD and two visual systems theory", Journal of digital Convergence, Vol. 13, No. 6, pp. 225-234, 2015.
Jong-Uk Kim, Sang-Cheol Park, Dae-Yong Jeon, "An Empirical Investigation on Factors Influencing SNS Addiction", Journal of digital Convergence, Vol. 13, No. 12, pp. 179-185, 2015.
Sang-Min Jun, "The Complex Effects of the Purposes of Using Mobile Phones on Mobile Phone Dependency and Depressive Symptoms among Elementary School Students", Journal of digital Convergence, Vol. 13, No. 10, pp. 471-482, 2015.
Kyung-A Jung, Bong-Whan Kim, "The Differences of the Ego-Resilience and Disagreement in Parents' Rearing Attitude according to the Levels of the Smartphone Addiction of Adolescents", Journal of digital Convergence, Vol. 13, No. 2, pp. 299-308, 2015.
Gui-Jung Kim, Jung-Soo Han, "A Review of Research Trends on Brain Computer Interface(BCI) Games using Brain Wave", Journal of digital Convergence, Vol. 13, No. 6, pp. 177-184, 2015.
Min-Kyeong Kim, "Relationship of Multicultural Adolescents' Stress, Depression, Family Resilience and Internet Game Addiction", Journal of the Korea Convergence Society, Vol. 6, No. 7, pp. 205-210, 2016.
Kyoung-Mi Yang, "The Effect of Self-Esteem and Depression on Smartphone Addiction among University Students", Journal of the Korea Convergence Society, Vol. 6, No. 7, pp. 113-123, 2016.
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