선학초(仙鶴草)추출물의 대식세포에서의 LPS-유도 염증반응에 대한 효능 연구 Effects of Agrimoniae Herba 30% ethanol extract on LPS-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophage cells원문보기
Objectives : The aerial parts of Agrimonia pilosa Ledeb (Agrimoniae Herba; AH) has been traditionally used as a Korean medicine to treatment of abdominal pain, sore throat, headaches, bloody discharge, parasitic infections and eczema. In this study, we investigated the effect of AH ethanol extract o...
Objectives : The aerial parts of Agrimonia pilosa Ledeb (Agrimoniae Herba; AH) has been traditionally used as a Korean medicine to treatment of abdominal pain, sore throat, headaches, bloody discharge, parasitic infections and eczema. In this study, we investigated the effect of AH ethanol extract on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in RAW264.7 macrophage cells.Methods : AH was extracted by 30% ethanol (AH-E). Raw264.7 cells were treated with AH-E extract at different concentrations for 30 min and then stimulated with LPS (1㎍/㎖) or without for indicated times. Cell viability was measured by MTT assay, and nitric oxide (NO) production was measured by Griess assay. The expression of inflammatory mediators, iNOS and COX-2 and inflammatory cytokines, TNF-α, IL-1β, and IL-6 was detected by RT-PCR, and the phosphorylation of ERK1/2, p38 and JNK MAP kinases (MAPKs) was analyzed by Western blot. Also, the expression of NF-κB in nuclear and cytosol was detected by Western blot.Results : AH-E extract significantly decreased LPS-induced NO production in RAW264.7 cells. AH-E extract inhibited the mRNA expression of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, and IL-6 in LPS-stimulated cells with a dose-dependent manner. In addition, the phosphorylation of ERK, p38 and JNK MAPKs was also inhibited by AH-E extract. AP-E extract inhibited the nuclear translocation of NF-κB in LPS-stimulated cells.Conclusions : Our results suggest that AH-E extract has an anti-inflammatory activity in macrophages-mediated inflammation.
Objectives : The aerial parts of Agrimonia pilosa Ledeb (Agrimoniae Herba; AH) has been traditionally used as a Korean medicine to treatment of abdominal pain, sore throat, headaches, bloody discharge, parasitic infections and eczema. In this study, we investigated the effect of AH ethanol extract on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in RAW264.7 macrophage cells.Methods : AH was extracted by 30% ethanol (AH-E). Raw264.7 cells were treated with AH-E extract at different concentrations for 30 min and then stimulated with LPS (1㎍/㎖) or without for indicated times. Cell viability was measured by MTT assay, and nitric oxide (NO) production was measured by Griess assay. The expression of inflammatory mediators, iNOS and COX-2 and inflammatory cytokines, TNF-α, IL-1β, and IL-6 was detected by RT-PCR, and the phosphorylation of ERK1/2, p38 and JNK MAP kinases (MAPKs) was analyzed by Western blot. Also, the expression of NF-κB in nuclear and cytosol was detected by Western blot.Results : AH-E extract significantly decreased LPS-induced NO production in RAW264.7 cells. AH-E extract inhibited the mRNA expression of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, and IL-6 in LPS-stimulated cells with a dose-dependent manner. In addition, the phosphorylation of ERK, p38 and JNK MAPKs was also inhibited by AH-E extract. AP-E extract inhibited the nuclear translocation of NF-κB in LPS-stimulated cells.Conclusions : Our results suggest that AH-E extract has an anti-inflammatory activity in macrophages-mediated inflammation.
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문제 정의
본 연구에서는 RAW264.7 대식세포에서 선학초 30% 에탄올 추출물의 염증억제효과를 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
본 연구에서는 선학초의 항아토피 효능 중 염증반응에 대한 효과를 확인하기 위해 마우스 대식세포에서의 LPS-유도 염증 반응에 대한 억제 효과와 기전을 조사하였다.
본 연구자는 아토피피부염에서 나타나는 소양감, 피부손상, 염증 반응 중에서 선학초는 염증을 억제하는 효능이 있다는 것에 착안하여 아토피피부염에 대한 효능을 검증하기 위한 연구 중 하나로 본 연구에서와 같이 RAW264.7 대식세포에서의 LPS-유도 염증반응에 대한 억제 효과를 조사하였다.
제안 방법
분리된 RNA는 DEPC water에 녹인 후 Nano-Drop을 이용하여 정량하였다. 5㎍ RNA에 M-MLV reverse transcriptase를 넣고 25℃ 10분, 42℃ 60분, 72℃ 15분 조건으로 반응시켜 cDNA를 합성하였으며, cDNA에 Taqbased PCR enzyme과 primer(Table 1)를 넣어 94℃ 30초, 58~61℃ 30초, 72℃ 60초 조건을 30회 반복하는 PCR을 수행하였다. PCR 반응산물은 EtBr이 함유된 1% agarose gel에서 100V 조건으로 20분 간 전기영동한 후 BioDoc-It2 Imaging Systems을 이용하여 확인하였다.
NO 합성효소인 iNOS 발현에 대한 선학초 추출물(AH-E extract)의 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, iNOS의 유전자 발현은 LPS 자극에 의해 증가되었으며, 선학초추출물을 0.
5㎍ RNA에 M-MLV reverse transcriptase를 넣고 25℃ 10분, 42℃ 60분, 72℃ 15분 조건으로 반응시켜 cDNA를 합성하였으며, cDNA에 Taqbased PCR enzyme과 primer(Table 1)를 넣어 94℃ 30초, 58~61℃ 30초, 72℃ 60초 조건을 30회 반복하는 PCR을 수행하였다. PCR 반응산물은 EtBr이 함유된 1% agarose gel에서 100V 조건으로 20분 간 전기영동한 후 BioDoc-It2 Imaging Systems을 이용하여 확인하였다. 각 밴드는 Image J program을 이용하여 density를 측정하고 GAPDH 발현에 대한 비율로 계산하여 반복실험에 대한 결과를 Histogram으로 나타내었다.
RAW264.7 세포에서 선학초추출물의 독성 농도를 선정하기 위해 MTT-based proliferation assay를 수행하였다. 즉, RAW264.
iNOS와 마찬가지로 대표적 염증물질인 COX-2 발현에 대한 선학초추출물(AH-E extract)의 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, COX-2의 유전자 발현은 LPS 자극에 의해 증가되었으며, 선학초추출물을 0.
대표적 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 발현에 대한 선학초추출물(AH-E extract)의 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, TNF-α, IL-1β, IL-6의 유전자 발현은 모두 LPS 자극에 의해 증가되었고, 선학초 추출물을 0.
먼저 RAW264.7 세포(1×105/㎖)를 24-well culture plate에 분주하여 하룻밤 배양한 후 선학초추출물을 0.05, 0.1, 0.2㎎/㎖ 농도로 처리하여 30분 간 배양하였다. 여기에 LPS(1㎍/㎖)를 처리 혹은 처리하지 않고 24시간 배양한 후 세포배양액을 수거하였다.
1% NED 용액(in water) 50㎕를 각각 넣은 후 실온에서 10분 간 정치하였다. 반응액의 흡광도를 microplate reader기를 이용하여 540nm에서 측정하였으며, 0.1M sodium nitrite(in water) 표준용액의 흡광도 곡선(reference curve)을 기준으로 NO의 농도를 계산하였다.
선학초추출물은 선학초(Agrimoniae Herba; AH)의 전초 100g을 30% 에탄올로 95℃에서 2시간 추출하였으며 3겹거어즈 및 와트만 거름종이(Whatman No. 1)로 거른 후 회전식 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 이를 냉동시킨 후 동결 건조기로 건조하였으며 이때 수율은 18.
세포 내 유전자 발현 변화를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 즉, RAW264.
2㎎/㎖ 농도로 처리하여 30분 간 배양하였다. 여기에 LPS(1㎍/㎖)를 처리 혹은 처리하지 않고 5시간 배양한 후세포를 수거하고 Trizol reagent를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 DEPC water에 녹인 후 Nano-Drop을 이용하여 정량하였다.
5)로 5회 세척한 후 HRP-conjugated secondary antibody 용액과 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 TBST buffer 로 5회 세척한 후 X-ray film에 감광시켜 밴드 유무를 확인하였다. 각 밴드는 Image J program을 이용하여 density를 측정하고 β-actin 발현에 대한 비율로 계산하여 반복 실험에 대한 결과를 Histogram으로 나타내었다.
7 세포에서 선학초추출물의 독성 농도를 선정하기 위해 MTT-based proliferation assay를 수행하였다. 즉, RAW264.7 세포(1×105/㎖)를 24-well culture plate에 분주하여 하룻밤 배양한 후 선학초추출물을 0.05, 0.1, 0.2, 0.5㎎/㎖ 농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 여기기에 10㎕ MTT(5㎎/㎖) 용액을 넣고 37℃ CO2 incubator에서 2시간 이상 반응시킨 후 상층액을 모두 제거하고 100㎕ DMSO를 첨가하여 교반기 위에서 15분 간 용해시켰다.
즉, RAW264.7 세포(1×105/㎖)를 6-well culture plate에 분주하여 하룻밤 배양한 후 선학초추출물을 0.05, 0.1, 0.2㎎/㎖ 농도로 처리하여 30분 간 배양하였다. 여기에 LPS(1㎍/㎖)를 처리 혹은 처리하지 않고 5시간 배양한 후세포를 수거하고 Trizol reagent를 이용하여 total RNA를 분리하였다.
여기에 LPS(1㎍/㎖)를 처리 혹은 처리하지 않고 15분(MAPK), 2시간(NF-κB) 배양한 후 세포를 수거하고 RIPA buffer를 이용하여 세포질을 분리하였다. 한편 NF-κB의 핵에서의 발현 확인을 위해서 NE-PER nuclear and cytosol isolation kit를 이용하여 핵과 세포질을 각각 분리하였다. 세포질 내 단백질의 양을 Bradford protein assay 용액으로 측정한 후 30㎍ 단백질을 SDS-PAGE하고, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다.
활성화된 대식세포에서 염증물질의 합성과 분비를 조절하는 염증 신호전달 분자들의 활성화에 대한 선학초 추출물(AH-E extract)의 억제 효과를 확인하기 위해 ERK1/2, p38, JNK MAPKs와 NF-κB에 대한 Western blot을 수행하였다. 그 결과, ERK1/2, p38, JNK MAPK 분자들은 모두 LPS 자극에 의해 인산화가 증가되었고, 선학초추출물 0.
대상 데이터
RAW264.7 세포는 ATCC사(Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 10% FBS와 1% penicillin- streptomycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 기본 배지로 하여 배양하였다.
본 실험에 사용된 선학초(Agrimoniae Herba; AH)는 광명당 제약(울산, 한국)으로부터 표준약재를 구입하여 추출물 제조에 사용하였다.
실험에 사용된 기기로 회전식 감압농축기(rotary evaporator)와 동결 건조기는 선일아이라사(경기도, 한국), Asys microplate reader는 Biochrom사(Cambridge, UK), BioDoc-It2 Imaging Systems은 UVP사(Upland, CA, USA), Nano-Drop은 Thermo Fisher Scientific사 제품을 사용하였다.
실험에 사용된 시약으로 lipopolysaccharide(LPS), MTT-based cell proliferation kit, Sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride(NED)는 Sigma-Aldrich사(St Louice, CA, USA), TRIzol reagent, NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents는 Thermo Fisher Scientific사(Grand Island, NY, USA), RIPA buffer, Quick Start™ Bradford Protein Assay 용액은 Bio-Rad Laboratories사(Philadelphia, PA, USA), M-MLV reverse transcriptase는 Promega사(Madison, WI, USA), Taq-based PCR enzyme은 Toyobo사(Osaka, Japan), ERK1/2, p38, JNK, NF-κB에 대한 단클론항체(mAb)는 Cell Signaling사 (Denvers, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 기기로 회전식 감압농축기(rotary evaporator)와 동결 건조기는 선일아이라사(경기도, 한국), Asys microplate reader는 Biochrom사(Cambridge, UK), BioDoc-It2 Imaging Systems은 UVP사(Upland, CA, USA), Nano-Drop은 Thermo Fisher Scientific사 제품을 사용하였다.
데이터처리
이를 다시 TBST buffer 로 5회 세척한 후 X-ray film에 감광시켜 밴드 유무를 확인하였다. 각 밴드는 Image J program을 이용하여 density를 측정하고 β-actin 발현에 대한 비율로 계산하여 반복 실험에 대한 결과를 Histogram으로 나타내었다.
모든 실험결과는 최소 3회 반복실험에 대한 평균과 표준 편차 (mean±SD)로 나타내었으며, 통계학적 유의성은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)에서 one-way ANOVA와 Tukey's test를 이용하여 검정하였고, p값이 0.05 이하인 경우를 유의성 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
5㎎/㎖ for 30 min, and then stimulated with or without LPS (1㎍/㎖) for 24 hr. Cell viability was measured by MTT assay. Data represents mean±SD of three independent experiments.
RAW264.7 세포에서 선학초추출물(AH-E extract)의 독성 정도를 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 선학초추출물 0.
세포 내 단백질 발현 변화를 확인하기 위해 Western blot을 수행하였다. 즉, RAW264.
세포배양액 내 NO 농도를 측정하기 위해 Griess assay를 수행하였다. 먼저 RAW264.
활성화된 대식세포로부터 분비되는 대표적 염증물질인 Nitric oxide(NO)에 대한 선학초추출물(AH-E extract)의 억제 효과를 확인하기 위해 세포배양액 내 NO 농도를 Griess assay 방법으로 측정하였다. 그 결과, NO의 농도는 LPS 자극에 의해 현저히 증가되었으며, 선학초추출물을 0.
5. 선학초추출물(0.1, 0.2㎎/㎖)은 RAW264.7 세포에서 LPS-유도 NF-κB의 핵에서의 발현 증가를 억제하였다. 따라서 선학초 30% 에탄올추출물은 대식세포 활성화에 따른 염증반응 억제 효과가 있는 것으로 확인되었으며, 아토피 피부염에서의 피부조직 염증 억제에 효과가 있을 것으로 사료되었다.
RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, COX-2의 유전자 발현은 LPS 자극에 의해 증가되었으며, 선학초추출물을 0.05, 0.1, 0.2㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 처리 농도에 의존적으로 감소하였다(Fig. 4). 한편 선학초추출물 단독 처리 군에서는 COX-2의 유전자 발현이 낮은 것으로 나타났다.
그 결과, ERK1/2, p38, JNK MAPK 분자들은 모두 LPS 자극에 의해 인산화가 증가되었고, 선학초추출물 0.1㎎/㎖ 과 0.2㎎/㎖ 농도에서 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6A). 한편 선학초추출물을 단독처리 군에서는 정상군과 마찬가지로 ERK1/2, p38, JNK MAPK 분자들의 인산화에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
방법으로 측정하였다. 그 결과, NO의 농도는 LPS 자극에 의해 현저히 증가되었으며, 선학초추출물을 0.05, 0.1, 0.2㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 LPS 처리군에 비해 유의적으로 또한 처리농도에 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 2). 한편 선학초추출물을 단독으로 처리한 군에서는 정상군과 마찬가지로 NO의 농도 증가가 나타나지 않았다.
위해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, TNF-α, IL-1β, IL-6의 유전자 발현은 모두 LPS 자극에 의해 증가되었고, 선학초 추출물을 0.05, 0.1, 0.2 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 농도 의존적인 감소를 나타내었다(Fig. 5). 한편 선학초 추출물을 단독처리 군에서는 정상군과 마찬가지로 TNF-α, IL-1 β, IL-6 유전자 발현에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
그 결과, iNOS의 유전자 발현은 LPS 자극에 의해 증가되었으며, 선학초추출물을 0.05, 0.1, 0.2㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 처리농도에 의존적인 감소를 나타내었다(Fig. 3). 한편 선학초추출물을 단독처리 군에서는 정상군과 유사하게 증가하지 않는 것으로 나타났다.
7 세포에서 선학초추출물(AH-E extract)의 독성 정도를 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 선학초추출물 0.05, 0.1, 0.2㎎/㎖ 처리 농도에서는 세포만 배양한 경우와 유사한 생존도를 나타내었으며, 0.5㎎/㎖ 처리 농도에서는 독성이 있는 것으로 나타났다(Fig. 1). 따라서 이후 실험에서는 독성이 나타나지 않은 0.
7 세포에서 LPS-유도 NF-κB의 핵에서의 발현 증가를 억제하였다. 따라서 선학초 30% 에탄올추출물은 대식세포 활성화에 따른 염증반응 억제 효과가 있는 것으로 확인되었으며, 아토피 피부염에서의 피부조직 염증 억제에 효과가 있을 것으로 사료되었다.
한편 선학초추출물을 단독처리 군에서는 정상군과 마찬가지로 ERK1/2, p38, JNK MAPK 분자들의 인산화에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 또한 핵과 세포질에서의 NF-κB 발현 변화를 조사한 결과, LPS 자극 후 NF-κB의 핵으로의 이동에 의한 발현 증가가 관찰되었으며, 선학초추출물 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 6B).
MAPK들은 대식세포에서 염증반응을 유발하도록 세포 밖 신호를 핵 내로 전달하게 하는 대표적인 염증신호전달분자로, LPS와 같은 자극원으로부터 인산화되어 염증전사인자인 NF-κB의 핵 내로의 이동을 촉진시킴으로써 대식세포 내 염증반응 개시를 유도하게 되고, 이러한 염증기전 가동에 의해 NO, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증물질들이 합성, 분비됨으로써 염증이 발달하게 된다36, 37). 본 연구에서 선학초의 30% 에탄올 추출물은 LPS 자극으로부터 활성화된 대식세포에서 MAPK 분자들의 인산화 억제와 NF-κB pathway 차단을 통해 NO 분비 및 iNOS, COX-2의 발현 억제 및 TNF-α, IL-1β, IL-6 등 염증성 사이토카인들의 전사단계 조절을 통해 염증반응을 제어할 수 있는 것으로 나타났다.
. 본 연구에서 선학초의 30% 에탄올 추출물은 RAW264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 NO의 분비를 농도 의존적으로 감소시킴으로써 염증반응을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
따라서 iNOS와 COX-2 의 발현이나 NO, PGE2의 정량 평가는 약물의 항염증 효능을 평가하는데 유용한 지표로 사용되고 있다. 본 연구에서 선학초의 30% 에탄올추출물은 LPS 자극으로부터 발현이 증가되는 iNOS와 COX-2의 전사단계 조절을 통해 염증물질의 생성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다.
5). 한편 선학초 추출물을 단독처리 군에서는 정상군과 마찬가지로 TNF-α, IL-1 β, IL-6 유전자 발현에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
6A). 한편 선학초추출물을 단독처리 군에서는 정상군과 마찬가지로 ERK1/2, p38, JNK MAPK 분자들의 인산화에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 또한 핵과 세포질에서의 NF-κB 발현 변화를 조사한 결과, LPS 자극 후 NF-κB의 핵으로의 이동에 의한 발현 증가가 관찰되었으며, 선학초추출물 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다(Fig.
후속연구
본 연구와 유사하게 메탄올 추출물이 NO, PGE2, IL-1β, IL-6 분비와 iNOS, COX-2 발현을 억제한다는 보고가 있으나 ERK, JNK, p38 MAPK 의 인산화에 대해 효과가 없는 것으로 보고19)되어 차이를 나타내었다. 이는 추출물 유형 차이로 인해 활성에 차이가 나타난 것으로 해석할 수 있으나 이에 대해서는 추후 좀 더 연구되어야 할 것으로 사료된다.
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