Objectives: To provide information on the safety of GST (Gami-Sasangja-tang), we carried out a single oral dose-increasing toxicity test of GST in beagle dogs.Materials and Methods: Six beagle dogs (three males and three females) were randomly assigned to two groups (experimental group: n=4, control...
Objectives: To provide information on the safety of GST (Gami-Sasangja-tang), we carried out a single oral dose-increasing toxicity test of GST in beagle dogs.Materials and Methods: Six beagle dogs (three males and three females) were randomly assigned to two groups (experimental group: n=4, control group: n=2). The experimental group (two males, two females) was given oral doses of GST in increasing order (1,250, 2,500, and 5,000 mg/kg) at three-day intervals. After administration, the participants’ mortality, clinical signs, and body weight changes were monitored for two weeks. After two weeks, all dogs were sacrificed for autopsy.Results: Temporary vomiting was observed according to increasing dosage (n=1, 250 mg/kg; n=4, 2,500 and 5,000 mg/kg). Transient diarrhea was observed on the second and third dosing day (n=1, 2,500 mg/kg; n=2, 5,000 mg/kg). Temporary salivation was noted on the third dosing day (n=3, 5,000 mg/kg). Compound-colored stool was observed in all dogs fed the GST on all dosing days and also on the following days. We found no mortality and no abnormalities in the clinical signs, body weight, and gross findings in any of the dogs tested.Conclusions: The maximum tolerated dose was over 5,000 mg/kg for both male and female dogs.
Objectives: To provide information on the safety of GST (Gami-Sasangja-tang), we carried out a single oral dose-increasing toxicity test of GST in beagle dogs.Materials and Methods: Six beagle dogs (three males and three females) were randomly assigned to two groups (experimental group: n=4, control group: n=2). The experimental group (two males, two females) was given oral doses of GST in increasing order (1,250, 2,500, and 5,000 mg/kg) at three-day intervals. After administration, the participants’ mortality, clinical signs, and body weight changes were monitored for two weeks. After two weeks, all dogs were sacrificed for autopsy.Results: Temporary vomiting was observed according to increasing dosage (n=1, 250 mg/kg; n=4, 2,500 and 5,000 mg/kg). Transient diarrhea was observed on the second and third dosing day (n=1, 2,500 mg/kg; n=2, 5,000 mg/kg). Temporary salivation was noted on the third dosing day (n=3, 5,000 mg/kg). Compound-colored stool was observed in all dogs fed the GST on all dosing days and also on the following days. We found no mortality and no abnormalities in the clinical signs, body weight, and gross findings in any of the dogs tested.Conclusions: The maximum tolerated dose was over 5,000 mg/kg for both male and female dogs.
검역, 순화기간이 종료된 후 체중을 기초로 하여 암수 각각 대조군은 1마리, 시험물질투여군은 2마리로 군분리를 시행하였다.
본 시험에서는 설치류를 이용한 반복독성실험12에서 독성변화가 관찰되지 않은 5,000 mg/kg를 최대용량으로 설정하여 1차에 1,250 mg/kg을 투여하였고, 2차 및 3차에 각각 2,500 및 5,000 mg/kg을 투여하여 단계별로 2배씩 증량함으로써 최대용량까지 투여하도록 하였다. 대조군에는 시험물질투여군과 동일한 액량의 대조물질을 투여하였다(Table 2).
매번 투여당일에는 투여 후 30분, 1, 2, 4 및 6시간째에 일반상태, 운동성 및 배설물 등에 대한 일반증상을 관찰하였다. 그 다음날부터는 1일 2회 관찰하고, 빈사나 사망동물의 유무를 확인하였으며, 최종투여 후 2주간 관찰하였다.
시험물질의 임상적용 예상경로가 경구이므로 경구투여를 선택하였고, 투여액량은 1250→2500→5,000 mg/kg으로 하고, 개체별 투여액량은 최근의 측정체중을 기준으로 산출하였다. 매일 오전에 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기(30 및 50 ml)를 이용하여 4일 간격으로 용량을 증가하여 총 3회 위내 강제투여하였다.
시험물질인 GST 추출물의 임상적용예상용량은 1,200 mg/human(60 kg 기준, 20 mg/kg)이다. 본 시험에서는 설치류를 이용한 반복독성실험12에서 독성변화가 관찰되지 않은 5,000 mg/kg를 최대용량으로 설정하여 1차에 1,250 mg/kg을 투여하였고, 2차 및 3차에 각각 2,500 및 5,000 mg/kg을 투여하여 단계별로 2배씩 증량함으로써 최대용량까지 투여하도록 하였다. 대조군에는 시험물질투여군과 동일한 액량의 대조물질을 투여하였다(Table 2).
시험물질의 임상적용 예상경로가 경구이므로 경구투여를 선택하였고, 투여액량은 1250→2500→5,000 mg/kg으로 하고, 개체별 투여액량은 최근의 측정체중을 기준으로 산출하였다. 매일 오전에 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기(30 및 50 ml)를 이용하여 4일 간격으로 용량을 증가하여 총 3회 위내 강제투여하였다.
또한 NC/Nga 생쥐를 이용한 아토피 동물모델에서 긁는 횟수(scratching frequency), 피부염 수치(dermatitis index), IgE, CCR3+, eotaxin, TARC, IL-31 및 T-helper cell type 2 cytokines을 억제하는 것으로 나타났다10. 이러한 결과를 바탕으로 GST를 아토피 피부염 치료제로서 개발하고자 하는 연구를 진행하고 있으며, 연구의 일환으로 안전성 평가를 위해 Sprague-Dawley rat를 이용한 단회 및 4주 용량결정 시험11, 13주 반복 경구투여 독성시험 및 4주 회복시험12, 유전독성 평가13를 시행하였다. 일반적으로 한약제제의 경우 안전성 입증을 위해 1종에서의 단회 및 반복독성을 요구하고 있으나 안전성의 추가 확보를 위해 본 연구를 통해 비설치류로서 beagle dog를 이용한 단회 경구투여 용량증가 독성시험을 시행하였다.
이에 GST의 아토피 피부염에 대한 효능을 평가하기 위한 임상연구의 예비연구로서 설치류를 이용한 단회 및 13주간 반복 경구투여 독성시험11,12과 유전독성시험13에서 안전성을 확인하였으며, 추가적인 안전성 평가를 위해 암수 beagle dog를 이용하여 단회 용량증가 경구투여 후 2주간의 관찰을 통해 독성반응을 관찰함으로써 그 안전성을 확인하였다.
이러한 결과를 바탕으로 GST를 아토피 피부염 치료제로서 개발하고자 하는 연구를 진행하고 있으며, 연구의 일환으로 안전성 평가를 위해 Sprague-Dawley rat를 이용한 단회 및 4주 용량결정 시험11, 13주 반복 경구투여 독성시험 및 4주 회복시험12, 유전독성 평가13를 시행하였다. 일반적으로 한약제제의 경우 안전성 입증을 위해 1종에서의 단회 및 반복독성을 요구하고 있으나 안전성의 추가 확보를 위해 본 연구를 통해 비설치류로서 beagle dog를 이용한 단회 경구투여 용량증가 독성시험을 시행하였다.
입수 후 15일간의 검역 · 순화기간 중 매일 1회 일반증상을 관찰하고, 주 1회 체중을 측정하였으며, 검역 · 순화기간 종료 시에 동물의 건강상태를 확인하였다
대상 데이터
5~6개월령의 암수를 사용하였고, 입수 시 모든 동물은 문신번호를 확인하고, 일반상태, 체중(HW-100KGV, A & D Co., Ltd., Korea) 및 체온을 측정하였다
본 실험에 사용한 GST 추출물은 (주)한국신약에서 갈색의 연조엑스 형태로 공급받았으며, 별도의 조제 없이 원액 그대로 사용하였다
음수의 분석은 충청북도 보건환경연구원 ‘먹는 물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙’의 전 항목에 대하여 실시하여 허용범위 내에 해당하는지를 확인하였다.
성능/효과
GST는 실험 시작부터 4일 간격으로 1,250, 2,500 및 5,000 mg/kg를 투여하였으며 암수 모두에서 사망동물은 발생하지 않았으나, 1차 1,250 mg/kg 투여 후 30분 이내에 수컷 1/2례에서 구토가 발생하였고 이후 2차 및 3차 투여에서 최대 2시간 이내에 구토, 설사, 유연의 증상이 산발적으로 관찰되었으며 모든 투여용량에서 투여 당일 및 투여 후 다음날에 시험물질색변(compound-colored stool)이 관찰되었다. 이와 같은 구토, 설사 및 유연 등 증상은 시험물질의 투여에 의한 변화로 판단되나, 1,250 mg/kg의 용량에서는 단 수컷의 1례에서만 구토증상이 관찰되었으며 2,500 mg/kg 및 5,000 mg/kg의 용량에서 나타난 다른 임상증상들도 모두 일시적으로 발생한 것으로 모두 공복에 과량 적용된 시험물질의 물리적 자극에 민감한 개체에서 나타난 소화기 증상으로 생각되어 전신적인 독작용에 의한 증상은 아니라고 판단되었다.
설치류를 이용한 단회투여 독성시험에서는 치사량 확인을 위해 고용량을 투여하여 사망률과 반수치사량(Lethal Dose 50 percent: LD50)을 측정하지만, 비설치류를 이용한 단회투여 독성시험의 경우에는 단회투여 독성시험 이후에 시행될 반복투여 독성시험의 용량설정과 설치류에서 나타나지 않는 특이적 독성이 비설치류를 통하여 발현될 가능성을 확인하기 위해 수행되는 것이 일반적이므로 독성증상을 명확히 관찰하기에 적절한 용량단계를 설정한다20,22. 따라서 Sprague-Dawley rat의 13주 반복 경구투여 독성시험12에서 독성변화가 관찰되지 않은 5,000 mg/kg를 최대용량으로 하여 투여하였으며 이는 인체 기준 예상용량인 1,200 mg/human(60 kg 기준, 20 mg/kg)의 약 250배에 해당하였다.
이와 같은 구토, 설사 및 유연 등 증상은 시험물질의 투여에 의한 변화로 판단되나, 1,250 mg/kg의 용량에서는 단 수컷의 1례에서만 구토증상이 관찰되었으며 2,500 mg/kg 및 5,000 mg/kg의 용량에서 나타난 다른 임상증상들도 모두 일시적으로 발생한 것으로 모두 공복에 과량 적용된 시험물질의 물리적 자극에 민감한 개체에서 나타난 소화기 증상으로 생각되어 전신적인 독작용에 의한 증상은 아니라고 판단되었다. 또한 암수 모두에서 시험물질 투여로 인한 체중 변화가 나타나지 않았고, 부검에서도 대조군을 포함한 암수 모두에서 이상 소견은 관찰되지 않아 GST의 beagle dog에서의 최소치사량은 5,000 mg/kg를 상회할 것으로 판단되었다. 한편 본 실험은 비설치류를 이용한 단회투여 용량증가 독성시험만 이루어졌다는 한계를 갖고 있으며 GST의 구성 성분의 하나인 백부근은 장기간 복용할 경우 간에 독성을 유발할 수 있다는 연구 결과23와 독성반응으로 오심, 구토, 복통, 설사 등의 위장관에 대한 자극작용이 나타날 수 있다고 보고24가 있어 향후 임상시험 진입을 위한 전임상 독성시험근거를 마련하기 위해서는 반복투여 독성시험을 포함한 보완 실험이 필요할 것으로 사료된다.
본 시험 조건하에서 GST 추출물에 대한 암수 beagle dogs를 이용한 단회 경구투여 용량증가 시험을 실시한 결과, 암수 모두 2,500 mg/kg 이상 용량에서 시험물질에 의한 구토, 설사 또는 유연 증상이 관찰되었으나, 최대내성용량(maximum tolerated dose, MTD)은 암수 모두 5,000 mg/kg를 상회하는 것으로 판단되었다.
후속연구
또한 암수 모두에서 시험물질 투여로 인한 체중 변화가 나타나지 않았고, 부검에서도 대조군을 포함한 암수 모두에서 이상 소견은 관찰되지 않아 GST의 beagle dog에서의 최소치사량은 5,000 mg/kg를 상회할 것으로 판단되었다. 한편 본 실험은 비설치류를 이용한 단회투여 용량증가 독성시험만 이루어졌다는 한계를 갖고 있으며 GST의 구성 성분의 하나인 백부근은 장기간 복용할 경우 간에 독성을 유발할 수 있다는 연구 결과23와 독성반응으로 오심, 구토, 복통, 설사 등의 위장관에 대한 자극작용이 나타날 수 있다고 보고24가 있어 향후 임상시험 진입을 위한 전임상 독성시험근거를 마련하기 위해서는 반복투여 독성시험을 포함한 보완 실험이 필요할 것으로 사료된다.
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