[국내논문]Palmitic acid로 지방 축적을 유도한 HepG2 cell에 대한 삼황사심탕과 대황황련사심탕의 효과 연구 Effect of Samhwangsasim-tang and Daehwanghwangryunsasim-tang on Palmitate-induced Lipogenesis in HepG2 cells원문보기
Objectives: The goal of this study was to investigate the anti-lipogenic effects of Samhwangsasim-tang(SHT), Daehwanghwangryunsasim-tang(DHT) aqueous extract on HepG2 cells with palmitate. Materials and Methods: HepG2 cells treated with palmitate were used in this study as hepatic steatosis model. C...
Objectives: The goal of this study was to investigate the anti-lipogenic effects of Samhwangsasim-tang(SHT), Daehwanghwangryunsasim-tang(DHT) aqueous extract on HepG2 cells with palmitate. Materials and Methods: HepG2 cells treated with palmitate were used in this study as hepatic steatosis model. Cells were treated with different concentrations of SHT, DHT aqueous extract for 24 hours. Cell viability and cytotoxicity were analyzed by MTT assay. Expressions of Bcl-2, Bax, Survivin, P21, TGF-${\beta}1$, LXR-${\alpha}$, ChREBP, ACC1, SCD1 mRNA were determined by Real-time PCR. Apoptosis of cells was detected by ELISA and FACS. Expression level of caspase-3 was studied by Western blot. Lipid accumulation was indicated by Oil Red O staining. Results: SHT, DHT aqueous extract had no cytotoxicity, but decreased palmitate-induced lipid accumulation in HepG2 cells. SHT aqueous extract suppressed fatty acid synthesis by inhibiting LXR-${\alpha}$, ChREBP, SCD1 activation and increasing TGF-${\beta}1$ expression level. DHT aqueous extract also suppressed fatty acid synthesis by decreasing ChREBP expression and increasing TGF-${\beta}1$ expression. Apoptosis of lipid accumulated cells was increased by enhanced activities of P21, caspase-3 and inhibited expressions of Bcl-2, Survivin. Conclusions: These results suggest that SHT and DHT have an anti-lipogenic effects on lipid accumulation of hepatic cell. Also SHT and DHT have an efficacy to increase apoptosis of adipocyte without cytotoxicity. Therefore, SHT and DHT might have potential clinical applications for treatment of hepatic steatosis.
Objectives: The goal of this study was to investigate the anti-lipogenic effects of Samhwangsasim-tang(SHT), Daehwanghwangryunsasim-tang(DHT) aqueous extract on HepG2 cells with palmitate. Materials and Methods: HepG2 cells treated with palmitate were used in this study as hepatic steatosis model. Cells were treated with different concentrations of SHT, DHT aqueous extract for 24 hours. Cell viability and cytotoxicity were analyzed by MTT assay. Expressions of Bcl-2, Bax, Survivin, P21, TGF-${\beta}1$, LXR-${\alpha}$, ChREBP, ACC1, SCD1 mRNA were determined by Real-time PCR. Apoptosis of cells was detected by ELISA and FACS. Expression level of caspase-3 was studied by Western blot. Lipid accumulation was indicated by Oil Red O staining. Results: SHT, DHT aqueous extract had no cytotoxicity, but decreased palmitate-induced lipid accumulation in HepG2 cells. SHT aqueous extract suppressed fatty acid synthesis by inhibiting LXR-${\alpha}$, ChREBP, SCD1 activation and increasing TGF-${\beta}1$ expression level. DHT aqueous extract also suppressed fatty acid synthesis by decreasing ChREBP expression and increasing TGF-${\beta}1$ expression. Apoptosis of lipid accumulated cells was increased by enhanced activities of P21, caspase-3 and inhibited expressions of Bcl-2, Survivin. Conclusions: These results suggest that SHT and DHT have an anti-lipogenic effects on lipid accumulation of hepatic cell. Also SHT and DHT have an efficacy to increase apoptosis of adipocyte without cytotoxicity. Therefore, SHT and DHT might have potential clinical applications for treatment of hepatic steatosis.
저자는 삼황사심탕과 대황황련사심탕이 비만 및 대사질환에 미치는 영향을 바탕으로, 복합성분의 한약 추출물이 비알코올성 지방간 세포 모델에 작용하는 분자생물학적 기전을 살펴보고자 하였다. 효과 검증을 위해 MTT assay, Realtime-PCR, ELISA, FACS, Western Blotting, Oil Red O staining 등을 시행하였고, 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
본 연구에서는 이전의 연구들을 바탕으로 삼황사 심탕과 대황황련사심탕이 지방축적을 억제하는 효능이 있을 것으로 생각하고, 그 기전을 밝히기 위해 적합한 세포모델을 설정하여 실험을 진행하였다. 삼황사심탕은 ≪東醫寶鑑≫의 처방구성을 참고하였고, 대황황련사심탕은 ≪金匱要略≫의 처방구성을 바탕으로 실험을 진행하였다.
제안 방법
저자는 삼황사심탕과 대황황련사심탕이 비만 및 대사질환에 미치는 영향을 바탕으로, 복합성분의 한약 추출물이 비알코올성 지방간 세포 모델에 작용하는 분자생물학적 기전을 살펴보고자 하였다. 효과 검증을 위해 MTT assay, Realtime-PCR, ELISA, FACS, Western Blotting, Oil Red O staining 등을 시행하였고, 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
삼황사심탕은 ≪東醫寶鑑≫의 처방구성을 참고하였고, 대황황련사심탕은 ≪金匱要略≫의 처방구성을 바탕으로 실험을 진행하였다. HepG2 cell 에 Palmitic acid 를 처리하여 지방 축적을 유도하고, 약물이 어떤 기전으로 영향을 주는지 확인하기 위하여 삼황사심탕과 대황황련사심탕의 물추출물을 0. 150, 300 μg/ml 의 농도로 처리하여 24 시간 배양하고 관찰하였다. 세포모델에 대한 효과를 보기 위하여 MTT assay, Real-time PCR, ELISA, FACS, Western Blotting, Oil Red O staining 등을 시행하였다.
대상 데이터
삼황사심탕(이하 SHT) 4 첩(112 g)과 대황황련사심탕(이하 DHT) 5 첩(80 g)을 환류추출기에 넣고, 3 차 증류수 1000ml 를 더하여 2 시간 동안 가열 추출한 후 여과하였다. 추출액을 여과하여 감압농축한 후, 동결건조기로 건조하여 삼황사심탕 물 추출물 24 g(수율 21.4%)과 대황황련사심탕 물 추출물 21.28 g(수율 26.6%)을 얻었다.
인간 간암 세포주(Human hepatocellular carcinoma cell line) HepG2 cell 은 한국세포주은행으로부터 구매해 사용하였다. HepG2 cell 은 FBS 10%, penicillin 10 μU/mL, streptomycin 100 μg/mL 를 첨가한 DMEM 을 사용하여, 5% CO2, 37℃ 환경에서 배양하였다.
인간 간암 세포주(Human hepatocellular carcinoma cell line) HepG2 cell 은 한국세포주은행으로부터 구매해 사용하였다. HepG2 cell 은 FBS 10%, penicillin 10 μU/mL, streptomycin 100 μg/mL 를 첨가한 DMEM 을 사용하여, 5% CO2, 37℃ 환경에서 배양하였다.
데이터처리
실험을 통해 얻어진 결과는 Excel 과 Prism program 의 one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc test, Student's t-test 를 이용해 대조군과 실험군의 데이터 차이를 비교하였다. 통계적 유의성은 P 값(P<0.
성능/효과
이상의 결과에서, PA 와 한약재를 동시에 투여하면 apoptosis 관련 유전자 및 단백질의 발현이 PA 단독 처리에 비하여 유의성 있게 증가하는 것으로 나타나는데, MTT assay 를 통해서 관찰되는 세포활성이 control 군에 비하여 감소되지 않게 나타나는 것은 삼황사심탕과 대황황련사심탕이 정상세포는 활성화 시키면서도 지방이 축적된 세포에 대해서는 세포자멸을 유도하는 양면적인 효과를 발휘하는 것으로 추정할 수 있다.
이상 lipogenesis 와 관련된 real-time PCR 결과를 종합해보면, 삼황사심탕 추출물은 ACC1 을 제외한 다른 mRNA 발현을 농도의존적으로 억제하였고, 대황황련사심탕 추출물 역시 TGF-β1, ChREBP 의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 삼황사심탕과 대황황련사심탕이 지방 합성에 관여하는 인자들은 억제하고, 지방세포 분화를 막는 TGF-β1 은 늘리는 것으로 보아, 간세포의 지방변성을 막고 지방축적을 억제하는 효과가 있다고 사료된다.
이상 lipogenesis 와 관련된 real-time PCR 결과를 종합해보면, 삼황사심탕 추출물은 ACC1 을 제외한 다른 mRNA 발현을 농도의존적으로 억제하였고, 대황황련사심탕 추출물 역시 TGF-β1, ChREBP 의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 삼황사심탕과 대황황련사심탕이 지방 합성에 관여하는 인자들은 억제하고, 지방세포 분화를 막는 TGF-β1 은 늘리는 것으로 보아, 간세포의 지방변성을 막고 지방축적을 억제하는 효과가 있다고 사료된다.
후속연구
따라서 삼황사심탕과 대황황련사심탕은 지방축적이 일어난 세포의 세포자멸을 유도하고, 간세포의 지방 축적과 관련된 신호 전달 과정을 막아 간지방 증의 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 하지만 두 약물 모두 간보호 효과에서 미흡한 결과가 보여, 기타 간손상이나 염증으로 진행된 질환에 대해서는 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다.
따라서 삼황사심탕과 대황황련사심탕은 지방축적이 일어난 세포의 세포자멸을 유도하고, 간세포의 지방 축적과 관련된 신호 전달 과정을 막아 간지방 증의 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 하지만 두 약물 모두 간보호 효과에서 미흡한 결과가 보여, 기타 간손상이나 염증으로 진행된 질환에 대해서는 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다. 또한 기존의 동물실험에서 밝혀진 중성지방 억제 효능을 확실히 검증하기 위하여, 본 약물의 total cholesterol, triglyceride 억제 기전을 좀 더 심도 있게 연구하는 과정이 필요할 것이다.
하지만 두 약물 모두 간보호 효과에서 미흡한 결과가 보여, 기타 간손상이나 염증으로 진행된 질환에 대해서는 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 보인다. 또한 기존의 동물실험에서 밝혀진 중성지방 억제 효능을 확실히 검증하기 위하여, 본 약물의 total cholesterol, triglyceride 억제 기전을 좀 더 심도 있게 연구하는 과정이 필요할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
지방간이란 무엇인가?
지방간이란 지방이 간조직에 과다 축적되어, 간 무게의 5% 이상을 차지한 경우를 말한다1). 특히 대사성 질환의 유병율이 점차 증가함에 따라, 만성 간 질환에서 비알코올성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 비중이 커지고 있다2).
NAFLD이 유발하는 문제점은?
특히 대사성 질환의 유병율이 점차 증가함에 따라, 만성 간 질환에서 비알코올성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 비중이 커지고 있다2). NAFLD는 알코올성 간질환과 유사한 조직학적 손상을 보이는 질환으로, 단순한 간지방증 (hepatosteatosis)부터3) 비알코올성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 거친 간섬유화, 간경변에 이르기까지 다양한 간손상을 유발한다4).
복합성분의 한약 추출물의 효과 검증을 위해 시행한 것은 무엇인가?
저자는 삼황사심탕과 대황황련사심탕이 비만 및 대사질환에 미치는 영향을 바탕으로, 복합성분의 한약 추출물이 비알코올성 지방간 세포 모델에 작용하는 분자생물학적 기전을 살펴보고자 하였다. 효과 검증을 위해 MTT assay, Realtime-PCR, ELISA, FACS, Western Blotting, Oil Red O staining 등을 시행하였고, 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
참고문헌 (33)
Bellentani S, Bedogni G, Miglioli L, Tiribelli C. The epidemiology of fatty liver. European journal of gastroenterology & hepatology, 2004;16(11):1087-1093.
Marchesini G, Brizi M, Morselli-Labate AM, Bianchi G, Bugianesi E, McCullough AJ, et al. Association of nonalcoholic fatty liver disease with insulin resistance. The American journal of medicine. 1999;107(5):450-455.
Chalasani N, Younossi Z, Lavine JE. Diehl A M, Brunt EM, Cusi K, et al. The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease: Practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases, American College of Gastroenterology, and the American Gastroenterological Association. Hepatology. 2012;55(6):2005-2023.
Ministry of Food and Drug Safety. Influence of dietary intake on non-alcoholic fatty liver disease in Koean. Cheongwon, Korea: Ministry of Food and Drug Safety. 2012
Jang E, Shin MH, Kim KS, Kim Y, Na YC, Woo HJ. Anti-lipoapoptotic effect of Artemisia capillaris extract on free fatty acids-induced HepG2 cells. BMC complementary and alternative medicine. 2014;14(1):253.
Park SH. Nonalcoholic fatty liver disease: treatment. Korean Journal of Medicine. 2010;79(5):481-489.
Han CW, Lee JH. Effects of KHchunggan-tang on the nonalcoholic fatty liver disease in palmitate-induced cellular model. J Korean Oriental Med. 2011;32(1):109-110.
Kim SY, Kwon JN, Lee I, Hong JW, Choi JY, Park SH, et al. Research on Anti-lipogenic Effect and Underlying Mechanism of Laminaria japonica on Experimental Cellular Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease. The Journal of Korean Oriental Internal Medicine. 2014;35(2):175-183.
Choi MY, Woo HJ, Kim YC, Lee JH. Effects of Gamisaenggan-tang on High Fat Diet-induced Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Korean J. Orient. Int. Med. 2009;30(2):365-374.
Lee JY, Yoon BK. Effects of Samhwangsasim-tang on obesity-related metabolic diseaseinmice. Dept. of Korean Medicine. 2014;22(1):93-104.
Yoon HJ, Park YS. Effects of Scutellariabaicalensis water extract on lipid metabolism and antioxidant defense system in rats fed high fat diet. Journal of The Korean Society of Food Science and Nutrition. 2010.
Ro HS, Ko WK, Kim OJ, Park KK, Cho YW, Park HS. Antihyperlipidemic Activity of Scutellarisbaicalensis Georg., Coptidis japonica Makino and RheikoreanumNakai on Experimental Hyperlipidemia in Rats. Journal of Pharmaceutical Investigation. 1996;26(3):215-219.
Choi SE, Jung IR, Lee YJ, Lee SJ, Lee JH, Kim Y, et al. Stimulation of lipogenesis as well as fatty acid oxidation protects against palmitate-induced INS-1 ${\beta}$ -cell death. Endocrinology. 2011;152(3):816-827.
Ramirez-Zacarias JL, Castro-Munozledo F, Kuri-Harcuch W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with Oil Red O. Histochemistry. 1992;97(6):493-497.
Samuel VT, Liu ZX, Qu X, Elder BD, Bilz S, Befroy D, et al. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Biological Chemistry. 2004;279(31):32345-32353.
Park SH, Jeon WK, Kim SH, Kim HJ, Park DI, Cho YK. Prevalence and risk factors of nonalcoholic fatty liver disease among Korean adults. Journal of gastroenterology and hepatology. 2006;21(1):138-143.
Marra F, Gastaldelli A, Baroni GS, Tell G, Tiribelli C. Molecular basis and mechanisms of progression of non-alcoholic steatohepatitis. Trends in molecular medicine. 2008;14(2):72-81.
Wahren J, Sato Y, Ostman J, Hagenfeldt L, Felig P. Turnover and splanchnic metabolism of free fatty acids and ketones in insulin-dependent diabetics at rest and in response to exercise. Journal of Clinical Investigation. 1984;73(5):1367.
Chen G, Liang G, Ou J, Goldstein JL, Brown MS. Central role for liver X receptor in insulin-mediated activation of Srebp-1c transcription and stimulation of fatty acid synthesis in liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004;101(31):11245-11250.
Chung MH, Han SJ. Effect of composite preparation of crude drugs on experimentally induced hyperlipemia in rats-Sam WhangSasim Tang and Whang Ryun Haedok Tang. Korean Journal of Pharmacognosy (Korea Republic). 1996;7(2):46-54
Oh MG, Song YS. Influence of RhizomaRhei water extract on the obese mouse model. J Oriental Rehab Med. 1997;7(2):46-54.
Oltval ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programed cell death.cell. 1993;74(4):609-619.
Tamm I, Wang Y, Sausville ED, Scudiero DA, Vigna N, Oltersdorf T, et al. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs.Cancer research. 1998;58(23):5315-5320.
Levkau B, Koyama H, Raines EW, Clurman B E, Herren B, Orth K, et al. Cleavage of p21 Cip1/Waf1 and p27 Kip1 mediates apoptosis in endothelial cells through activation of Cdk2: role of a caspase cascade. Molecular cell. 1998;1(4):553-563.
Porter AG, Janicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell death and differentiation. 1996;6(2):99-104.
Petruschke TH, Rohrig K, Hauner H. Transforming growth factor beta (TGF-beta) inhibits the differentiation of human adipocyte precursor cells in primary culture. International journal of obesity and related metabolic disorders: journal of the International Association for the Study of Obesity. 1994;18(8):532-536.
Nam IK, Yoo J. Downregulation of SGK1 Expression is Critical for TGF- ${\beta}$ -induced Apoptosis in Mouse Hepatocytes Cells. Journal of life science. 2012;22(11):1500-1506.
Cha JY, Repa JJ. The liver X receptor (LXR) and hepatic lipogenesis The carbohydrate-response element-binding protein is a target gene of LXR. Journal of Biological Chemistry. 2007;282(1):743-751.
Berlanga A, Guiu-Jurado E, Porras JA, Auguet T. Molecular pathways in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and experimental gastroenterology. 2014;7:221.
Repa JJ, Liang G, Ou J, Bashmakov Y, Lobaccaro JMA, Shimomura I. Regulation of mouse sterol regulatory element-binding protein-1c gene (SREBP-1c) by oxysterol receptors, LXR ${\alpha}$ and LXR ${\beta}$ . Genes & development. 2000;14(22):2819-2830.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.