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문제 정의
- 이 연구에서는 주거지역과 자연하천 등 육상 오염원과 인접한 개펄에서 양식되고 생식을 위주로 소비되고 있는 서해안 양식산 굴의 위생안전 확보와 항생제 내성 관리에 필요한 자료를 확보하고자 장염비브리오균 분포와 병인 인자 보유 여부 및 항생제 내성 특성에 대하여 검토하였다.
제안 방법
- 16S rDNA 상동성 비교 및 독소 유전자 확인을 위하여 분리 균주를 2% 식염이 함유된 Triple Soy Broth (TSB, Oxoid, U.K.) 10 mL에 접종하여 37℃에서 18-24시간 배양한 후 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA 를 추출하였다. 분리된 DNA는 사용할 때까지 -18℃에 보관하였다.
- 분리된 DNA로부터 16S rDNA 증폭에는 universal primer (Macrogen, Korea)을 사용하였으며 독소 유전자인 tdh 및 trh gene의 증폭에는 각각 VPD-1/VPD-2와 VPR-1/VPR-2 (Takara, Japan)를 사용하였다. PCRe 주형 DNA 5 μL, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2 μL, 10×PCR 용액 5 μL, primer (100 pmol/μL) 1 μL, Taq polymerase 1.25 U를 혼합한 후, 총부피를 50 μL로 조정하고 Thermal Cycle (Takara, Japan)로 94℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초의 조건에서 35회 반복하여 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 DE/QIAxcel advanced system (Qiagen, Germany)를 이용하여 amplicon 크기를 확인하였다(16S rDNA, 663 bp; tdh, 251 bp; trh, 250 bp).
- 희석액을 이용하여 100 배, 1,000배 등 단계별 추가 희석용액을 만들어 사용하였다. 각 희석단계 별로 alkaline peptone water (pH 8.5±0.2, 2% NaCl 함유)가 들어있는 3개의 시험관에 각각 접종하고 35±0.5℃에서 18-24시간 증균 배양하였다. 배양한 후 Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar (TCBS agar, Difco)에 획선 도말하여, 35℃에서 18-24시간 배양하였다.
- 항균제 디스크를 고착시킨 Muller Hinton Agar 평판은 35℃, 16-18시간 배양한 다음 균의 증식 저해대 (inhibition zone)의 크기를 caliper로 측정하여 Table 1에 제시된 기준(CLSI, 2015)에 따라 감수성을 판정하였다. 감수성 결과의 정도 관리를 위하여 Escherichia coli ATCC 25922를 대조균으로 사용하여 각 항균제 디스크에 대한 역가를 확인하였다.
- 동정시험에는 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside) 시험 및 API 20E system (BioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)을 이용하였으며, 16S rDNA 부분 염기서열을 분석하여 GeneBank에 등록되어 있는 장염비브리오균의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 비교하여 확정하였다. 동정결과 장염비브리오균으로 확정된 경우 해당 분리주가 유래한 희석단계별 증균 시험관을 장염비브리오균 양성 시험관으로 하여 그 수를 헤아려 최확수표에서 정량치를 얻고 희석배율을 곱하여 100 g 당 MPN으로 환산한 후 정량치로 하였다.
- 전형적인 청록색 집락을 도말하여 Triple Sugar Iron Agar (Difco)에 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 후, 전형적인 반응을 나타내는 균주를 대상으로 동정시험을 실시하였다. 동정시험에는 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside) 시험 및 API 20E system (BioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)을 이용하였으며, 16S rDNA 부분 염기서열을 분석하여 GeneBank에 등록되어 있는 장염비브리오균의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 비교하여 확정하였다. 동정결과 장염비브리오균으로 확정된 경우 해당 분리주가 유래한 희석단계별 증균 시험관을 장염비브리오균 양성 시험관으로 하여 그 수를 헤아려 최확수표에서 정량치를 얻고 희석배율을 곱하여 100 g 당 MPN으로 환산한 후 정량치로 하였다.
- 시험에 사용된 굴 시료수는 총 96개였다. 시료 채취 시 해수의 수온과 염분농도는 YSI 556 multiprobe system (Yellow Springs, YSI Life Science, OH, USA)을 사용하여 현장에서 측정하였다.
- 이 연구에서는 미국 CDC가 비브리오 감염증 치료에 사용을 권고한 cefotaxime, gentamicin, sulfamethoxazole-trime-thoprim 등 16종의 항균제(Table 1)를 이용하여 분리된 장염비브리오균의 항균제에 대한 감수성을 조사하였다(Daniels et al., 2000; Shaw et al., 2014). 분리균주의 94.
- , 2012). 이 연구에서는 서해안 산 양식 굴(Crassostrea gigas) (n=96)을 대상으로 alkaline peptone water에 증균하여 선택배지를 사용하여 분리한 후 표현형과 유전형 분석을 통하여 동정하고 최확수법으로 정량하여조사를 실시하였다. 장염비브리오균으로 추정되는 총 390개의균주가 분리되었으며 115개 균주가 최종적으로 확정되었다.
- 배양한 후 Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar (TCBS agar, Difco)에 획선 도말하여, 35℃에서 18-24시간 배양하였다. 전형적인 청록색 집락을 도말하여 Triple Sugar Iron Agar (Difco)에 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 후, 전형적인 반응을 나타내는 균주를 대상으로 동정시험을 실시하였다. 동정시험에는 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside) 시험 및 API 20E system (BioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)을 이용하였으며, 16S rDNA 부분 염기서열을 분석하여 GeneBank에 등록되어 있는 장염비브리오균의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 비교하여 확정하였다.
- 25 U를 혼합한 후, 총부피를 50 μL로 조정하고 Thermal Cycle (Takara, Japan)로 94℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초의 조건에서 35회 반복하여 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 DE/QIAxcel advanced system (Qiagen, Germany)를 이용하여 amplicon 크기를 확인하였다(16S rDNA, 663 bp; tdh, 251 bp; trh, 250 bp).
- 그리고 80 mL의 PBS에 균질액 20 g을 첨가하여 10배 희석액을 만들어 시료로 하였다. 희석액을 이용하여 100 배, 1,000배 등 단계별 추가 희석용액을 만들어 사용하였다. 각 희석단계 별로 alkaline peptone water (pH 8.
대상 데이터
- 분리된 DNA는 사용할 때까지 -18℃에 보관하였다. 분리된 DNA로부터 16S rDNA 증폭에는 universal primer (Macrogen, Korea)을 사용하였으며 독소 유전자인 tdh 및 trh gene의 증폭에는 각각 VPD-1/VPD-2와 VPR-1/VPR-2 (Takara, Japan)를 사용하였다. PCRe 주형 DNA 5 μL, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2 μL, 10×PCR 용액 5 μL, primer (100 pmol/μL) 1 μL, Taq polymerase 1.
- 희석된 균 배양액을 미리 1% 농도가 되도록 식염을 첨가한 두께 4 mm의 Muller Hinton Agar (Merck, Germany) 평판에 도말한 후 실온에 5분간 방치하여균액을 흡수시키고 항균제 디스크(φ 8 mm)를 균 접종 후 15 분 이내에 고착시켰다. 시험 항균제는 ampicillin을 비롯한 15 종 10계열을 사용하였다(Table 1). 항균제 디스크를 고착시킨 Muller Hinton Agar 평판은 35℃, 16-18시간 배양한 다음 균의 증식 저해대 (inhibition zone)의 크기를 caliper로 측정하여 Table 1에 제시된 기준(CLSI, 2015)에 따라 감수성을 판정하였다.
- 패류 시료는 멸균된 용기에 채취한 후 10℃ 이하로 유지하면서 실험실로 운반하여 사용하였다. 시험에 사용된 굴 시료수는 총 96개였다. 시료 채취 시 해수의 수온과 염분농도는 YSI 556 multiprobe system (Yellow Springs, YSI Life Science, OH, USA)을 사용하여 현장에서 측정하였다.
- 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus) 분리를 위하여 2014년 1월부터 2015년 12월까지 서해안 패류 생산해역에 설정된 4개 지점(인천시 옹진군 덕적면 및 자월면 연안)에서 양식굴(Crassostrea gigas)을 매월 채취하여 시료로 하였다. 패류 시료는 멸균된 용기에 채취한 후 10℃ 이하로 유지하면서 실험실로 운반하여 사용하였다.
이론/모형
- 분리 동정된 장염비브리오균의 항균제 감수성 평가에는 Acar and Goldstein (1991)의 디스크 확산법을 이용하였다. 각 균주를 Muller Hinton Broth (Merck, Germany)에 접종한 후 35℃ 에서 18-24시간 전 배양한 다음 균 배양액의 농도를 McFarland No.
- 분리균주의 항균제에 대한 동시 내성 정도를 비교하기 위하여분리균주에 대한 MAR index를 다음 계산식에 따라 산출하였다(Krumperman, 1983).
- 장염비브리오균은 Bacteriological Analytical Manual의 방법에 따라 3 tube MPN법으로 정량분석을 실시하였다(Elliot et al., 2005). 패각을 제거한 후 패육과 패액 200 g에 phosphate buffered saline (PBS: 140 mM NaCl, 5 mM anhydrous Na2H-PO4, and 1.
- 시험 항균제는 ampicillin을 비롯한 15 종 10계열을 사용하였다(Table 1). 항균제 디스크를 고착시킨 Muller Hinton Agar 평판은 35℃, 16-18시간 배양한 다음 균의 증식 저해대 (inhibition zone)의 크기를 caliper로 측정하여 Table 1에 제시된 기준(CLSI, 2015)에 따라 감수성을 판정하였다. 감수성 결과의 정도 관리를 위하여 Escherichia coli ATCC 25922를 대조균으로 사용하여 각 항균제 디스크에 대한 역가를 확인하였다.
성능/효과
- , 2014). 분리균주의 94.8%가 ampicillin 에 내성을 나타내었으며, cephalothin (53.9%), streptomycin(60.0)과 rifampin (47.8)에 높은 내성율을 보였다(Table 3). 그리고 cefotaxime, cefotetan, sulfamethoxazole-trimethoprim과 tetracyclin에는 감수성 또는 중간 내성을 나타내었다.
- 이 연구에서는 서해안 산 양식 굴(Crassostrea gigas) (n=96)을 대상으로 alkaline peptone water에 증균하여 선택배지를 사용하여 분리한 후 표현형과 유전형 분석을 통하여 동정하고 최확수법으로 정량하여조사를 실시하였다. 장염비브리오균으로 추정되는 총 390개의균주가 분리되었으며 115개 균주가 최종적으로 확정되었다. 장염비브리오균으로 확정된 모든 분리주의 16S rDNA 부분 염기서열은 GeneBAnk에 등록된 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633의 16S rDNA 염기서열과 99% 이상의 상동성을 보였다(Makino et al.
- 한편, 분리된 장염비브리오균 115균주 중 독소 유전자(tdh/ trh gene) 보유율을 조사한 결과, 내열성 용혈독소 유전자인 tdh gene을 보유한 균주는 없었고 유사 용혈독소 유전자인 trh gene 을 보유한 분리균은 11균주(9.6%)로 나타났다(Table 2). 유럽과 아시아 지역에서 이루어진 조사에 의하면 tdh 및 trh gene 보유 장염비브리오균의 비율이 약 0-6% 정도라고 보고되고 있다(DePaola et al.
후속연구
- , 2015). 그러나 우리나라는 수산물을 생식하는 식습관을 가지고 있어 하절기를 중심으로 장염비브리오균에 의한 식중독이 지속적으로 발생하고 있기 때문에, 지역별 수산물 품종별 총 장염비브리오균 및 독소 유전자 보유 균주출현율에 대한 지속적인 모니터링과 위해분석이 필요할 것으로 사료된다(KFDA, 2016).
- , 2009). 서식지가 연안에 위치하고 있으며 여과섭식의 생리적 특성을 가진 패류의 경우는 각종 식중독 원인균의 전달 매개체로서 나아가 해양세균과 육상세균 간 내성인자 전달 매개체로서도 위험군에속하는 수산물이기 때문에 생산단계와 수확 후 단계에서 적절한 위생 관리가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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