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문제 정의
- 특히 cisplatin이 신장에 집중적으로 축적됨으로써 투여환자의 25−30%에서 신장독성이 유발된다. 따라서 본 실험에서는 발효홍삼을 이용한 cisplatin의 부작용인 신독성예방효능을 확인하고자 하였다. 시료에 따른 DPPH와 ABTS 라디칼소거능을 실험 결과 RG8F3에서 가장 우수한 소거능을 확인하였고 따라서 RG0SF0와 RG8F3 간의 비교실험이 가능할 것으로 사료되었다.
- 본 연구에서는 홍삼의 항산화 효과를 바탕으로 발효 홍삼을 섭취한 마우스 모델에 cisplatin을 투여하였을 때, 신손상이 억제되는 유의한 결과를 얻게 되었으므로 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 4일간 약물투여 하고 cisplatin 복강투여 24시간 후 개복하여 심장에서 혈액을 채취 한 후 관류하여 신장 조직을 적출하였다. 이후 분쇄한 신장 조직에서 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS, GSH를 측정한 결과 ROS의 값은 정상군(3186.
- 건삼과 발효홍삼군에 1일, 1회 각각 200 mg/kg씩 4일간 약물을 경구투여하였고 체중과 식이섭취량은 1일 1회 각각 측정하였다. 4일째, 약물투여 2시간 후 cisplatin을 식염수에 녹여 20 mg/kg의 농도로 복강 주사 하였다. Cisplatin 복강투여 24시간 후 개복하여 심장에서 혈액을 채취 한 후 관류하여 액체 질소에 동결시켰고, 신장 조직을 적출하여 생리식염수에 세척 후, 수분을 제거하자마자 액체 질소에 바로 동결 시켜 −80 °C deep freezer에 보관하였다.
- 신장조직의 세포질 단백질인 SOD-1, catalase, GPx, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, HO-1, β-actin 및 핵단백질인 Histone, NF-κB p65, Nrf-2의 발현을 측정하기 위해 10 µg의 단백질을 8−15 % SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 5 % skim milk를 함유한 TBS-T (0.5 % Tween 20 in TBS)에 담그고 1시간 동안 blocking 처리한 후 TBS-T로 5분마다 5회 세척하였다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1 차 항체에 사용되는 2차 항체(TBS-T로 1:5000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분간 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다.
- 그 후, 각 실험군마다 평균을 내어 하루 사료 섭취량을 산출하였다. Cisplatin 복강투여 24시간 후 개복하여 신장을 적출한 즉시 신장무게를 측정하였다.
- Cisplatin 복강투여 24시간 후 개복하여 심장에서 혈액을 채취 한 후 관류하여 액체 질소에 동결시켰고, 신장 조직을 적출하여 생리식염수에 세척 후, 수분을 제거하자마자 액체 질소에 바로 동결 시켜 −80 °C deep freezer에 보관하였다.
- Cisplatin의 부작용을 줄이기 위해서 먼저 활성 산소의 억제가 우선이기 때문에 본 실험에서는 시료들의 먼저 항산화 효과를 알아보고 가장 항산화 효과가 높은 시료를 선정하였다. 발효균주는 F1은 Leuconostoc mesenteroides는 젖산균으로서 김치 발효 초기에 생육되는 균이다.
- ROS를 측정하기 위하여 혈청과 신장조직에 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of 530nm와 excitation wavelength of 486 nm에서 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다. GSH를 측정하기 위하여 혈청과 신장조직에 0.1 M Sodium phosphate buffer (pH 8.0)와 OPA solution을 혼합한 후, 실온 15분 인큐베이션 후 형광 광도계를 이용하여 emission wavelength of 420 nm와 excitation wavelength of 350 nm에서 측정한 산출 값을 계산하였다.
- Kimble-filtering flask에 funnel을 장착하고 여과지(Whatman No. 2, GE healthcare, Arlington Heights, IL, USA) 를 사용하여 추출물을 여과한 뒤 여과액을 미리 항량된 용기에 넣어 45−50 °C의 수온에서 rotary vacuum evaporator (JP/N-1000X, EYELA)를 사용하여 감압농축 후 −30 °C에서 120분, −15 °C에서 120분, 0 °C에서 240분, 15 o°C에서 120분, 30 °C에서 120분의 조건으로 동결건조 하였다.
- 4)를 이용하여 분쇄하였다. ROS를 측정하기 위하여 혈청과 신장조직에 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of 530nm와 excitation wavelength of 486 nm에서 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다. GSH를 측정하기 위하여 혈청과 신장조직에 0.
- 실험군은 총 4개의 군으로 정상군과 cisplatin 투여군으로 나뉘는데, cisplatin 투여군은 약물투여를 하지 않은 대조군, 건삼투여군(RG0F0)과, 발효홍삼투여군(RG8F3) 으로 나누었으며 각각 9마리씩 배정하였다. 건삼과 발효홍삼군에 1일, 1회 각각 200 mg/kg씩 4일간 약물을 경구투여하였고 체중과 식이섭취량은 1일 1회 각각 측정하였다. 4일째, 약물투여 2시간 후 cisplatin을 식염수에 녹여 20 mg/kg의 농도로 복강 주사 하였다.
- 건삼과 홍삼의 발효 일수에 따른 pH 변화를 측정하여 발효 정도를 판단하였다. 본 측정 결과는 발효를 진행 할수록 pH가 낮아지기 때문에 pH의 정도는 발효 정도를 나타낸다.
- 식이섭취량은 제공된 사료에서 하룻동안 섭취하고 남은 사료 량을 제하여 사료의 섭취량을 측정한다. 그 후, 각 실험군마다 평균을 내어 하루 사료 섭취량을 산출하였다. Cisplatin 복강투여 24시간 후 개복하여 신장을 적출한 즉시 신장무게를 측정하였다.
- 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1 차 항체에 사용되는 2차 항체(TBS-T로 1:5000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분간 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다. 그리고 ECL 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea) 에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)프로그램을 사용하여 정량하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2 °C, 습도 50±5 %, 명암주기(light: dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
- 시료에 따른 DPPH와 ABTS 라디칼소거능을 실험 결과 RG8F3에서 가장 우수한 소거능을 확인하였고 따라서 RG0SF0와 RG8F3 간의 비교실험이 가능할 것으로 사료되었다. 동물실험은 정상군, 대조군, RG0SF0 투여군 및RG8F3 투여군 4그룹으로 나누었다. 약물투여군은 200 mg/kg/day의 농도로 4일간 투여한 후,cisplatin은 20 mg/kg으로 대조군 및 약물투여군에복강주사하였다.
- 매일 같은 시간 발효 일수에 따른 pH 변화를 측정하여 발효 정도를 판단하였다(Table 4).
- 신손상 예방 효능을 알아보기 위해 실시한 동물실험에 필요한 시료는 고형발효를 하였다. 사각 투명 밀폐용기에 각각 라벨을 붙이고, 시료를 샘플 하나당 2개씩 각각 50 g씩(총 100 g) 칭량하여 넣었다. 250 mL의 멸균 증류수를 첨가하여 현탁한다음(20 % w/v), 시료가 포함된 용기마다 미리 혼합된 복합 효소액 2 mL를 첨가하고 하룻밤 반응시켰다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2 °C, 습도 50±5 %, 명암주기(light: dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료(조단백질 22.1 %이상, 조지방 8.0 % 이하, 조섬유 5.0 % 이하, 조회분 8.0 % 이하, 칼슘 0.6 % 이상, 인 0.4 % 이상, 항생제 무첨가, Samyang corporation, Seoul, Korea)와 물을 충분히 공급하였다.
- 접종 시 균주의 농도는 생육에 따라 가감하여 107−108 cells/mL 정도로 하였다. 샘플에 따라 간헐적으로 흔들어 주었고, 매일 같은 시간에 발효상태(pH)를 확인하고 발효의 지속여부를 결정 하였다. 신손상 예방 효능을 알아보기 위해 실시한 동물실험에 필요한 시료는 고형발효를 하였다.
- 샘플에 따라 간헐적으로 흔들어 주었었으며, 매일 같은 시간 발효상태(pH)를 확인하고 35 °C, 6일간 발효하였다.
- 총 4가지 균주로 백삼과 증숙된 홍삼을 발효시켰고, pH를 측정하여 발효 진행을 확인하였다. 성분검사를 위한 1차 발효는 액상발효를 하였고 동물실험에 필요한 시료는 2차로 고형발효를 하였다.
- 수삼을 세척한 후 인삼(RG0)은 건조기에서 건조 하였고, 홍삼은 증숙 시간을 2, 4, 6, 8시간으로 구분하여 증숙한 후 건조기에서 건조하였다(Fig. 1; Table 1). 건조는 밀폐 제습식 건조기 (ACE Machinery, Seoul, Korea)를 사용하여 수분함량 15 % 미만으로 건조하였고, 증숙은 무압식 스팀증숙기(ACE Machinery)를 사용하여 증숙온도 90에서 증숙하였다.
- 시료 선정을 위하여 홍삼을 액상 발효한 후 100배 희석하여 항산화 효능을 알아볼 수 있는 DPPH radical scavenging activity 와 ABTS radical scavenging activity, 그리고 각종 성분검사를 실시하였다.
- 샘플에 따라 간헐적으로 흔들어 주었고, 매일 같은 시간에 발효상태(pH)를 확인하고 발효의 지속여부를 결정 하였다. 신손상 예방 효능을 알아보기 위해 실시한 동물실험에 필요한 시료는 고형발효를 하였다. 사각 투명 밀폐용기에 각각 라벨을 붙이고, 시료를 샘플 하나당 2개씩 각각 50 g씩(총 100 g) 칭량하여 넣었다.
- 신장 조직을 적출한 다음 조직을 절단하고, 10 % 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 4 µm의 절편을 제작하였다.
- 신장 조직의 세포질단백질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, and 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, and protease inhibitor cocktail 을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (Bio Spec Product, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 10 % NP-40 용액을 첨가 하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질 단백질을 포함하고 있는 상층액을분리하였다.
- 실험 종료 후 신장 조직을 적출·분쇄 후 western blot을 실시하여 항산화 효소인 SOD-1, catalase, GPx, Nrf-2와 HO-1를 측정하였다.
- 실험군은 총 4개의 군으로 정상군과 cisplatin 투여군으로 나뉘는데, cisplatin 투여군은 약물투여를 하지 않은 대조군, 건삼투여군(RG0F0)과, 발효홍삼투여군(RG8F3) 으로 나누었으며 각각 9마리씩 배정하였다. 건삼과 발효홍삼군에 1일, 1회 각각 200 mg/kg씩 4일간 약물을 경구투여하였고 체중과 식이섭취량은 1일 1회 각각 측정하였다.
- 실험동물의 체중은 전자체중계(CAS, Gyeonggi, Korea)로 1일, 1회, 동일 시간 동일 조건에서 측정하였고, 실험종료일 체중에서 실험 개시 전 체중을 빼서 체중 증가량(body weight gain(g)) 을 산출하였다. 식이섭취량은 제공된 사료에서 하룻동안 섭취하고 남은 사료 량을 제하여 사료의 섭취량을 측정한다.
- 동물실험은 정상군, 대조군, RG0SF0 투여군 및RG8F3 투여군 4그룹으로 나누었다. 약물투여군은 200 mg/kg/day의 농도로 4일간 투여한 후,cisplatin은 20 mg/kg으로 대조군 및 약물투여군에복강주사하였다. RG8F3 투여한 결과 대조군과 비교하여 GSH의 수치는 증가하였고 ROS, BUN, creatinine 및 염증인자들의 감소를 보였다.
- 이후 Hematoxylin-eosin (H & E) 염색을 실시하고, 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.
- 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4 °C에서 overnight시킨 다음 TBS-T로 10분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1 차 항체에 사용되는 2차 항체(TBS-T로 1:5000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 30분간 반응시킨 후, TBS-T로 10분마다 5회 세척하였다.
- 증숙과 발효를 끝낸 시료들 중에서 성분검사와 항산화 실험을 통해 최종 동물실험에 사용할 시료를 결정하였다. 성분검사를 살펴보면 수삼의 증숙 시간에 따라 총 사포닌 양이 많아지는 것을 알 수 있었다.
- F3는 Saccharomyces cerevisiae으로서 맥주 효모균이고 F4는 Lactobacillus paracasei로서 유산균 변이주이다. 총 4가지 균주로 백삼과 증숙된 홍삼을 발효시켰고, pH를 측정하여 발효 진행을 확인하였다. 성분검사를 위한 1차 발효는 액상발효를 하였고 동물실험에 필요한 시료는 2차로 고형발효를 하였다.
- 핵단백질을 얻기 위해 10 % NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 µL의 buffer C (50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF and 10 % glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10분마다 vortex를 3번 하였다.
- 홍삼 및 액상발효홍삼 1 mL에 함유된 성분을 분석하여 함량을 표로 나타내었다. N/D은 검출은 되지만 정량값이 의미가 없는 것을 의미한다.
- MEI 823, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus paracasei를 사용하여 발효하였다 (Table 2). 홍삼과 발효홍삼간의 항산화 지표와 유효 성분을 비교하기 위해 액상발효를 하였다. 홍삼을 각각 5g씩 칭량하여 넣고, 45 mL의 멸균 증류수를 첨가하여 현탁하였다(10 % w/v).
- 홍삼과 발효홍삼간의 항산화 지표와 유효 성분을 비교하기 위해 액상발효를 하였다. 홍삼을 각각 5g씩 칭량하여 넣고, 45 mL의 멸균 증류수를 첨가하여 현탁하였다(10 % w/v). 시료가 포함된 용기마다 미리 혼합된 복합 효소액 0.
대상 데이터
- 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline6-sulfonic acid (ABTS)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였다.
- 모든 실험은 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 (DHU2015-050)을 얻어 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다. ICR mice계의 6주령 수컷을 오리엔트(Seongnam, Gyeonggi, Korea)에서 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2 °C, 습도 50±5 %, 명암주기(light: dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
- 발효 균주는 F1: Leuconostoc mesenteroides, F2: Lactobacillus sp. MEI 823, F3: Saccharomyces cerevisiae, F4: Lactobacillus paracasei를 사용하였다. 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline6-sulfonic acid (ABTS)는 Sigma Aldrich (St.
- 홍삼의 발효에 사용된 균주는 구하기 쉬우며 안전성이 보장된 대표적인 균주인 Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus sp. MEI 823, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus paracasei를 사용하여 발효하였다 (Table 2). 홍삼과 발효홍삼간의 항산화 지표와 유효 성분을 비교하기 위해 액상발효를 하였다.
- Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), superoxide dismutase 1 (SOD-1), catalase, glutathione peroxidase (GPx), nuclear factorkappa B (NF-κB p65), nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), heme oxygenase-1 (HO-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), Histone, β-actin과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, protease inhibitor mixture, dimethyl sulfoxide, ethylenediaminetetraacetic acid는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다.
- Japan)에서 구입하였다. cis-Diammineplatinum (II) dichloride는 Sigma-Aldrich에서, blood urea nitrogen (BUN)과 creatinine assay kit는 아산제약주식회사 (Hwaseong, Korea)에서 구입하였다. 또한, 2,7-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA) 에서 enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 로부터 구입하여 사용하였다.
- cis-Diammineplatinum (II) dichloride는 Sigma-Aldrich에서, blood urea nitrogen (BUN)과 creatinine assay kit는 아산제약주식회사 (Hwaseong, Korea)에서 구입하였다. 또한, 2,7-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA) 에서 enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입 하였다.
- 본 연구에서 사용된 홍삼은 경기도 여주에서 재배된 6년근 수삼을 2013년 10월, 직접 수매하여 사용하였다.
- 성분검사를 살펴보면 수삼의 증숙 시간에 따라 총 사포닌 양이 많아지는 것을 알 수 있었다. 이를 종합하여 RG0F0와 RG8F3을 동물실험에 사용하였다.
- 컬럼은 XbridgeTM RP18, 5 µm 250 mm × 4.6 mm를 사용하였고, 용매조건은 acetonitrile과 water의 gradient 조건하에서 수해되었고, UV detector는 PDA (203 nm)를 사용하였다.
- 홍삼 발효를 위해 미생물의 배양에 사용된 시약은 모두 Difco (Difco Laboratory, Detroit, MI, USA) 제품을 사용하였으며, 전 처리에 사용된 효소혼합액은 한국 화학 연구원 융합 화학 연구 팀에서 제공한 Cellulclast, HTec2, Amyloglucosidase 등의 1:1:1 혼합액을 사용하였다. 발효 균주는 F1: Leuconostoc mesenteroides, F2: Lactobacillus sp.
데이터처리
- 실험결과는 평균과 표준편차(mean ± SD)로 표기하였으며, SPSS 22.0 for Windows program을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 다음 least-significant differences test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였다.
이론/모형
- 심장에서 채혈한 혈액을 4,000 rpm, 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 얻었다. 신장 기능을 측정하는 BUN 및 creatinine assay kit는 제작사(Asan Pharm. Co., Hwaseong, Korea)의 프로토콜에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 6시간 증숙 한 후, 1번 균주로 발효한 홍삼이 33.03±0.84 %로 그 다음으로 높은 활성을 보였다(Table 5).
- ABTS 라디칼 소거능은 발효를 한 시료보다 발효하지 않은 시료들이 높은 효과를 보였다. RG0F0는 25.
- Creatinine은 대조군(1.93±0.01 mg/dL)은 정상군(1.85±0.01 mg/dL (p <0.001))에 비해 수치가 증가하였고, RG0F0 투여군(1.85±0.01 mg/dL (p <0.001))과 RG8F3 투여군(1.85±0.01 mg/dL (p <0.001))에서는 대조군에 비해 유의성 있게 적은 증가를 보였다(Fig. 3).
- RG0F0 투여군(3392.2±124.1 fluorescence/min/mg protein)에서는 대조군에 비해 적은 증가 경향을 나타내었고, RG8F3 투여군(3180.2±121.8 fluorescence/min/mg protein (p <0.01))에서는대조군에 비해 유의성 있게 적은 증가를 보였다.
- RG0F0는 25.74±0.28 %의 소거능을 보였고, RG6F0는 27.30±1.12 %로 가장 높은 효과를 보였으며, RG8F0가 27.21±0.59 %로서 이와 유사한 효과를 보였다.
- RG0F0는 총 사포닌 함량이 1.867을 보인 반면, RG0F4의 경우, 9.969의 함량을 보였고, RG0F3이 9.72로 두 번째로 높은 함량을 보였다.
- 약물투여군은 200 mg/kg/day의 농도로 4일간 투여한 후,cisplatin은 20 mg/kg으로 대조군 및 약물투여군에복강주사하였다. RG8F3 투여한 결과 대조군과 비교하여 GSH의 수치는 증가하였고 ROS, BUN, creatinine 및 염증인자들의 감소를 보였다. 조직학적 결과에서도 신손상으로 인한 변형이 거의 없었다.
- 조직학적 결과에서도 신손상으로 인한 변형이 거의 없었다. 결론적으로 발효홍삼은 cisplatin으로 유발되는 신 손상 예방에 유의한 효과를 보이는 것으로 사료된다.
- 그 결과 SOD-1, catalase와 Nrf-2의 발현은 대조군에 비해 RG0F0와 RG8F3 투여군에서 증가하는 경향을 보였고, 대조군에 비해 RG0F0와 RG8F3 투여군에서는 HO-1 (p <0.05) 과 GPx (p <0.01)의 발현 역시 유의성 있게 증가하였다(Figs. 4; 5).
- 백삼과 발효 홍삼간의 항산화 실험 결과를 살펴보면, DPPH radical 소거능은 증숙과 발효를 거치지 않은 건삼보다 증숙 후 발효를 시킨 발효홍삼이 균주에 상관없이 대체적으로 항산화 효과가 더욱 뛰어난 것을알 수 있었다. 그러나 ABTS radical 소거능에서는 발효는 하지 않고 증숙만 거친 홍삼이 가장 소거능이 높았다.
- 적출한 신장 조직을 H&E 염색 하였다. 대조군은 사구체와 세뇨관들에 심한 변성이 나타났지만 백삼과 발효홍삼 투여군에서 대조군과 비교하였을 때 병리조직학적 변화가 현저히 감소하였다. 특히 RG8F3 투여군에서는 정상군과 유사한 모습을 보였다 (Fig.
- 동물실험 결과, 체중과 식이섭취량 및 신장무게는 정상군과 비교하였을 때 체중증가에만 유의성 있는 결과를 보였고 식이 섭취량 및 신장무게는 유의적인 차이를 보이지는 않은 것으로 보아 약물투여는 동물의 상태에 크게 영향을 주지 않는 것으로 보였다. 신장 기능의 표준 생화학적 표지물질인 혈청 내 BUN 과 creatinine의 양을 분석하여 기능변화를 확인해본 결과, 정상 군에 비해 대조군의 BUN과 creatinine 수치는 증가하였으나 백삼과 발효홍삼 투여 시 대조군에 비해 유의성 있게 적은 증가 경향을 보였다.
- 또한 대조군의 신장조직에서 COX-2, iNOS, TNF-α와 IL-6의 발현을 확인한 결과, 대조군과 비교하였을 때 RG0F0와 RG8F3 투여군에서 COX-2, iNOS와 TNF-α가 유의성 있게 정상군에 가까운 발현을 보였다.
- 본 측정 결과는 발효를 진행 할수록 pH가 낮아지기 때문에 pH의 정도는 발효 정도를 나타낸다. 발효하지 않은 건삼 및 홍삼을 보면 건삼은 5.5이고 RG2부터 RG8로 갈수록 pH가 낮은 것을 알 수 있었고 발효 기간이 길어질수록 pH가 낮아지는 경향을 보였다(Table 4).
- 이는 건삼에서는 고온에 의해 홍삼이 되면서 생성되는 진세노사이드 성분이 많아지지만, 발효를 거치게 되면 기존의 성분들이 미생물에 의해 분해가 되면서 compound K, ginsenoside Rh2 등의 대사물로 바뀌기 때문에 기존 성분은 감소되는 것으로 보인다(Bae 등, 2004). 백삼과 발효 홍삼간의 항산화 실험 결과를 살펴보면, DPPH radical 소거능은 증숙과 발효를 거치지 않은 건삼보다 증숙 후 발효를 시킨 발효홍삼이 균주에 상관없이 대체적으로 항산화 효과가 더욱 뛰어난 것을알 수 있었다. 그러나 ABTS radical 소거능에서는 발효는 하지 않고 증숙만 거친 홍삼이 가장 소거능이 높았다.
- 분리된 혈청을 이용하여 BUN, creatinine을 측정한 결과 대조군(26.12±1.59 mg/dL)은 정상군(22.30±0.61 mg/dL (p <0.01))에 비해 수치가 증가하였고, RG0F0 투여군(21.51±1.56 mg/dL (p <0.001))과 RG8F3 투여군(22.24±1.56 mg/dL (p <0.01))에서는 대조군에 비해 유의성 있게 적은 증가를 보였다.
- 성분검사 결과 백삼에 비해서는 증숙 과정을 거친 홍삼이 성분이 대체적으로 높게 나왔고, 또한 증숙 시간이 길수록 높아지는 경향을 보였다. 그러나 발효한 건삼과 발효한 홍삼은 발효하지 않은 홍삼에 비하여 성분 함량이 떨어지는 것을 확인할수 있었다.
- 수삼을 건조만 한 건삼, 수삼을 2, 4, 6, 8시간 증숙한 홍삼, 그리고 건삼과 4가지 홍삼을 4가지 균주로 발효한 시료의 성분 분석과 in vitro 항산화 실험을 한 결과, RG0F0와 RG8F3 간의 효능 평가가 가능할 것으로 사료되어 최종 시료로 선정하였다.
- 따라서 본 실험에서는 발효홍삼을 이용한 cisplatin의 부작용인 신독성예방효능을 확인하고자 하였다. 시료에 따른 DPPH와 ABTS 라디칼소거능을 실험 결과 RG8F3에서 가장 우수한 소거능을 확인하였고 따라서 RG0SF0와 RG8F3 간의 비교실험이 가능할 것으로 사료되었다. 동물실험은 정상군, 대조군, RG0SF0 투여군 및RG8F3 투여군 4그룹으로 나누었다.
- 동물실험 결과, 체중과 식이섭취량 및 신장무게는 정상군과 비교하였을 때 체중증가에만 유의성 있는 결과를 보였고 식이 섭취량 및 신장무게는 유의적인 차이를 보이지는 않은 것으로 보아 약물투여는 동물의 상태에 크게 영향을 주지 않는 것으로 보였다. 신장 기능의 표준 생화학적 표지물질인 혈청 내 BUN 과 creatinine의 양을 분석하여 기능변화를 확인해본 결과, 정상 군에 비해 대조군의 BUN과 creatinine 수치는 증가하였으나 백삼과 발효홍삼 투여 시 대조군에 비해 유의성 있게 적은 증가 경향을 보였다.
- 염증의 매개인자인 NF-κB p65를 측정한 결과, 대조군은 정상군에 비해 증가(p <0.05) 하였고 RG8F3 투여군에서는 정상군에 가까운 발현을 보였다(p <0.01) (Fig. 6).
- 위의 결과들을 종합해보면, 건삼과 발효홍삼은 모두 항산화 효과가 있었으며, 특히 RG8F3은 cisplatin으로 유도시킨 신장손상에 대해 ROS, SOD, 그리고 catalase를 감소시켰고 HO-1과 GSH를 증가시켰으며, NF-κB p65, COX-2, iNOS, TNF-α, 그리고 lL-6를 모두 감소시킴으로 인해 신장손상을 줄이는 효과를 나타낸다고 볼 수 있었다.
- 위의 결과들을 종합해보면, 건삼과 발효홍삼은 모두 항산화 효과가 있었으며, 특히 RG8F3은 cisplatin으로 유도시킨 신장손상에 대해 ROS, SOD, 그리고 catalase를 감소시켰고 HO-1과 GSH를 증가시켰으며, NF-κB p65, COX-2, iNOS, TNF-α, 그리고 lL-6를 모두 감소시킴으로 인해 신장손상을 줄이는 효과를 나타낸다고 볼 수 있었다. 이는 실제 조직학적인 결과에서도 신손상으로 인한 변형이 거의 없었고 정상에 가까울 정도로 신장손상이 억제되는 것으로 나타났으며 이로 인해 발효홍삼은 cisplatin으로 유발되는 신 손상 예방에 유의한 효과를 보이는 것으로 생각된다. 그러나 발효 홍삼의 어떤 성분이 어떤 작용으로 인해 효과를 내는 것인지는 아직 밝혀진 바 없으므로 더욱 자세한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 이후 분쇄한 신장 조직에서 산화적 스트레스 바이오 마커인 ROS, GSH를 측정한 결과 ROS의 값은 정상군(3186.9±106.2 fluorescence/min/mg protein (p <0.01))에 비해 대조군(3635.3±61.4 fluorescence/min/mg protein)에서 수치가 증가하였다.
- 투여 군들의 체중 증가만 유의성 있는 증가를 보였고 식이섭취량에는 변화를 보이지 않았다. 신장무게는 대조군에서 정상 군과 비교하였을 경우 약간 증가하는 경향을 보였다(Table 8).
후속연구
- 이는 실제 조직학적인 결과에서도 신손상으로 인한 변형이 거의 없었고 정상에 가까울 정도로 신장손상이 억제되는 것으로 나타났으며 이로 인해 발효홍삼은 cisplatin으로 유발되는 신 손상 예방에 유의한 효과를 보이는 것으로 생각된다. 그러나 발효 홍삼의 어떤 성분이 어떤 작용으로 인해 효과를 내는 것인지는 아직 밝혀진 바 없으므로 더욱 자세한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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