[논문]LC-MS/MS를 이용한 닭 간과 신장 중 곰팡이 독소 6종 동시분석법 개발

김수희; 김광남; 김효비; 송재영; 박성원

doi:10.5536/kjps.2016.43.2.111

LC-MS/MS를 이용한 닭 간과 신장 중 곰팡이 독소 6종 동시분석법 개발
Method Development for Determination of Multi-Mycotoxins in Chicken Liver and Kidney Tissues by LC-MS/MS 원문보기

한국가금학회지 = Korean journal of poultry science, v.43 no.2, 2016년, pp.111 - 118

김수희 (농림축산검역본부 동물약품평가과) , 김광남 (농림축산검역본부 동물약품평가과) , 김효비 (농림축산검역본부 동물약품평가과) , 송재영 (농림축산검역본부 동물약품평가과) , 박성원 (농림축산검역본부 동물약품평가과)

초록
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본 연구에서는 곰팡이 독소에 대한 노출을 확인하기 위한 목적으로 닭의 간, 신장 조직에서 곰팡이 독소 분석법을 확립하였다. 곰팡이 독소의 경우 닭에서 독성이 강하며, 본 실험에서는 가축의 사료에서 주로 확인되는 곰팡이 독소 6종(아플라톡신 $B_1{\cdot}M_1$, 오크라톡신 A, 푸모니신 $B_1$, 데옥시니발레놀, 제랄레논)을 선별하여 추출, 정제조건을 확립하고 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 확립된 분석조건에서 검량선은 $R^2$값이 0.99 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. QUECHERS법을 응용하여 닭 간, 신장 시료에서 곰팡이 독소를 추출, 정제하여 분석하였을 때 곰팡이 독소 4종(아플라톡신 $B_1$, 오크라톡신 A, 데옥시니발레놀, 제랄레논)의 평균 회수율은 80.94~98.10%이고, 상대표준편차도 14% 미만으로 조사되어 높은 정확도와 정밀도를 확인할 수 있었다. 검량선에 근거하였을 때 곰팡이 독소 6종에 대하여 닭 간 시료의 경우 검출한계는 $7.6{\sim}145.79{\mu}g/kg$, 정량한계는 $23.04{\sim}441.78{\mu}g/kg$이었다. 닭 신장의 경우 검출한계는 $6.07{\sim}197.20{\mu}g/kg$, 정량한계는 $18.40{\sim}597.59{\mu}g/kg$으로 나타났다. 본 연구의 결과 LC-MS/MS를 이용하여 닭의 간, 신장에서 곰팡이 독소 6종 동시 분석법을 확립하였으며, 이는 생체시료에서 효율적인 곰팡이 독소 동시 분석법으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Mycotoxins are secondary metabolites produced by molds, such as Aspergillus, Fusarium and Penicillium, that have adverse effects on animals and humans. Aflatoxin, ochratoxin, zearalenone, fumonisin and deoxynivalenol are the mycotoxins of greatest agro-economic importance and cause acute disease called mycotoxicoses. Mycotoxicosis in poultry birds results in decreased meat/egg production, immunosuppressant, and hepatotoxicosis. Some of toxins or their metabolites may be retained in animal or human tissues and induce health problems. This study was designed to develop a sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the simultaneous detection and quantification of mycotoxins, such as aflatoxin $B_1$, aflatoxin $M_1$, ochratoxin A, zearalenone, fumonisin B and deoxynivalenol, in chicken liver and kidney tissues. The mycotoxins were extracted and purified using modified QUECHERS methods, separated by LC and detected by an electrospray ionisation interface (ESI) and tandem MS. Good precision and linearity were observed for most of six mycotoxins. The recovery test for each mycotoxin in liver and kidney tissues mostly indicated good average recovery rates between 80.94% and 98.10% and the coefficient of variation mostly under 13.78%, except for aflatoxin $M_1$ and fumonisin $B_1$. The limit of detection (LOD) for six mycotoxins was $7.6{\sim}145.79{\mu}g/kg$ in liver tissues and $6.07{\sim}197.20{\mu}g/kg$ in kidney tissues. The quantification limits (LOQ) for 6 mycotoxins were in the range $23.04{\sim}441.78{\mu}g/kg$ in liver tissues and $18.40{\sim}597.59{\mu}g/kg$ in kidney tissues, respectively. The developed multi-mycotoxin method in this study permits simultaneous, simple, and rapid determination of several co-existing mycotoxins in chicken liver and kidney tissues.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 곰팡이 독소에 대한 노출을 확인하기 위한 목적으로 닭의 간, 신장 조직에서 곰팡이 독소 6종 추출, 정제조건 및 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 확립하고자 하였다.
본 연구에서는 곰팡이 독소에 대한 노출을 확인하기 위한 목적으로 닭의 간, 신장 조직에서 곰팡이 독소 분석법을 확립하였다. 곰팡이 독소의 경우 닭에서 독성이 강하며, 본 실험에서는 가축의 사료에서 주로 확인되는 곰팡이 독소 6종 (아플라톡신 B₁․M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁, 데옥시니발레놀, 제랄레논)을 선별하여 추출, 정제조건을 확립하고 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다.

제안 방법

아플라톡신 B₁․M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁은 양이온 모드에서, 데옥시니발레놀, 제랄레논은 음이온 모드에서 더 좋은 감도를 나타내었다. MS/MS 분석 시 multiple reaction ionization(MRM) 모드로 최적화된 분석 조건에서 product ion 및 collision energy 값을 선정하였다. 각 곰팡이 독소에서 3개의 product ion을 선정하였고, 가장 높은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로 나머지 두 개의 이온을 정성이온(qualification ion)으로 선정하였다.
MS/MS 분석 시 multiple reaction ionization(MRM) 모드로 최적화된 분석 조건에서 product ion 및 collision energy 값을 선정하였다. 각 곰팡이 독소에서 3개의 product ion을 선정하였고, 가장 높은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로 나머지 두 개의 이온을 정성이온(qualification ion)으로 선정하였다. 분석 시 이용된 MS/MS 조건과 확립된 MRM parameter는 Table 1 및 Table 2에 각각 나타내었으며, 선정된 precursor ion과 product ion은 기존의 연구들과 대부분 일치하였다(Rasmussen et al.
검출한계와 정량한계는 검량선에 근거하여 산출하였다 (Table 4). 검량선에서 잔차의 표준편차를 검량선의 기울기로 나누어 3을 곱한 값을 검출한계, 10을 곱한 값을 정량한계로 구하였다. 닭 간 시료의 경우, 검출한계는 7.
곰팡이 독소의 LC-MS/MS에서의 분석 조건을 확립하기 위해 표준용액(100 ng/mL)을 주입하여 양이온 모드와 음이온 모드에서 분석하였다. 아플라톡신 B₁․M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁은 양이온 모드에서, 데옥시니발레놀, 제랄레논은 음이온 모드에서 더 좋은 감도를 나타내었다.
본 연구에서는 곰팡이 독소에 대한 노출을 확인하기 위한 목적으로 닭의 간, 신장 조직에서 곰팡이 독소 분석법을 확립하였다. 곰팡이 독소의 경우 닭에서 독성이 강하며, 본 실험에서는 가축의 사료에서 주로 확인되는 곰팡이 독소 6종 (아플라톡신 B₁․M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁, 데옥시니발레놀, 제랄레논)을 선별하여 추출, 정제조건을 확립하고 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 확립된 분석조건에서 검량선은 R²값이 0.
본 연구에서도 변형된 형태의 QUECHERS 법을 사용하였다. 닭의 간 및 신장 조직 2 g에 5% 개미산이 포함된 아세토니트릴을 첨가하여 진탕한 후 C₁₈/PSA대신 상용화된 EMR-dSPE와 EMR polish을 사용하여 정제하였다. 본 전처리 방법은 6종의 곰팡이 독소를 동일한 과정으로 정제하여 분석시간을 최소화하였으며, EMR-dSPE와 EMR polish를 사용하여 매트릭스의 간섭을 줄일 수 있었다.
모든 시료는 3번 반복하여 분석하였다. 확립된 분석법의 직선성, 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery), 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)에 대해 유효성을 검증하였다.
정밀도는 시료를 반복하여 분석 하였을 때의 분석값의 상대표준편차로 확인하였으며, 정확도는 일정 농도로 회수율 실험을 반복하여 평가하였다. 임의로 닭의 간과 신장 조직에 곰팡이 독소를 추가하여 분석 하였을 때의 LC-MS/MS 크로마토그램을 Fig. 2와 Fig. 3에 각각 제시하였다.
정확도를 평가하기 위해 닭의 신장과 간 조직 시료에 검출한계의 10배 수준의 농도로 회수율 실험을 3회 이상 반복 하여 수행하였다(Table 3). 실험 결과, 닭의 간과 신장 조직에서 곰팡이 독소 4종(아플라톡신 B₁, 오크라톡신 A, 데옥시니발레놀, 제랄레논)의 평균 회수율은 80.
확립된 분석법을 검증하기 위해 정밀도(precision)와 정확도(accuracy)를 평가하였다. 정밀도는 시료를 반복하여 분석 하였을 때의 분석값의 상대표준편차로 확인하였으며, 정확도는 일정 농도로 회수율 실험을 반복하여 평가하였다.
혼합 표준용액을 1∼7,000 ng/mL 수준으로 무처리 시료 시험용액으로 희석하여 검량선을 작성하였고, 상대표준편차를 기울기로 나누어 3을 곱한 값을 검출한계, 10으로 곱한 값을 정량한계로 나타내었다. 회수율 측정은 공시료에 최종농도가 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg이 되도록 첨가한 후 분석하여 회수율을 구하였다. 3회 반복하여 회수율을 분석하여 얻은 결과의 상대표준편차로 분석의 재현성을 확인하였다.

대상 데이터

LC는 Nexera X2(Shimadzu, Kyoto, JAPAN), MS는 LCMS-8040(Shimadzu)를 이용하였고, 컬럼은 XTerra MS C18 5 μL, 2.1 × 150 mm(Waters Corporation, MO, USA)를 사용하였다.
곰팡이 독소 표준품 아플라톡신 B₁, 아플라톡신 M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁, 데옥시니발레놀, 제랄레논과 개미산은 Sigma-Aldrich(saint Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다. 아세토니트릴은 Merck(HPLC grade, Darmstadt, Germany) 에서 구입하였다.
, 데옥시니발레놀, 제랄레논과 개미산은 Sigma-Aldrich(saint Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다. 아세토니트릴은 Merck(HPLC grade, Darmstadt, Germany) 에서 구입하였다. 정제를 위한 EMR dSPE(5982-1010)와 EMR polish(5982-0101)는 Agilent Technologies(CA, USA)에서 구입하였다.
이동상으로는 10 mM 아세트산암모늄 수용액과 2% 아세트산 포함 메탄올을 사용하였고, 이동상 속도는 0.4 mL/min로 시료는 5 μL를 주입하였다.
아세토니트릴은 Merck(HPLC grade, Darmstadt, Germany) 에서 구입하였다. 정제를 위한 EMR dSPE(5982-1010)와 EMR polish(5982-0101)는 Agilent Technologies(CA, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

1 mg/kg, 1 mg/kg이 되도록 첨가한 후 분석하여 회수율을 구하였다. 3회 반복하여 회수율을 분석하여 얻은 결과의 상대표준편차로 분석의 재현성을 확인하였다.
확립된 분석법을 검증하기 위해 정밀도(precision)와 정확도(accuracy)를 평가하였다. 정밀도는 시료를 반복하여 분석 하였을 때의 분석값의 상대표준편차로 확인하였으며, 정확도는 일정 농도로 회수율 실험을 반복하여 평가하였다. 임의로 닭의 간과 신장 조직에 곰팡이 독소를 추가하여 분석 하였을 때의 LC-MS/MS 크로마토그램을 Fig.
모든 시료는 3번 반복하여 분석하였다. 확립된 분석법의 직선성, 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery), 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)에 대해 유효성을 검증하였다. 혼합 표준용액을 1∼7,000 ng/mL 수준으로 무처리 시료 시험용액으로 희석하여 검량선을 작성하였고, 상대표준편차를 기울기로 나누어 3을 곱한 값을 검출한계, 10으로 곱한 값을 정량한계로 나타내었다.

이론/모형

닭 간, 신장 조직의 추출 및 정제는 QUECHERS법을 기본으로 수정된 방법을 적용하였다. 균질화된 닭 간 또는 신장 조직 2 g을 정밀히 달아 5% 개미산이 포함된 아세토니트릴 10 mL를 첨가한 후 10분간 진탕 후 5,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리한다.
QUECHERS 법은 Anastassiades(2003)이 AOAC(Association of Official Agricultural Chemist)에 발표한 것으로 고체상 시약(염화나트륨, 황산마그네슘) 또는 고상흡착제를 시료에 직접 넣어 추출, 정제하는 분석방법이다. 본 연구에서도 변형된 형태의 QUECHERS 법을 사용하였다. 닭의 간 및 신장 조직 2 g에 5% 개미산이 포함된 아세토니트릴을 첨가하여 진탕한 후 C₁₈/PSA대신 상용화된 EMR-dSPE와 EMR polish을 사용하여 정제하였다.
4 mL/min로 시료는 5 μL를 주입하였다. 질량분석기의 경우 ESI 모드를 사용하였으며, 분석기기 조건은 Table 1과 같다.

성능/효과

6종의 곰팡이 독소는 확립된 분석 조건을 이용하여 약 1∼7,000 ng/mL 범위의 농도에서 R2값은 0.99 이상의 우수한 직선성을 나타내었다.
QUECHERS법을 응용하여 닭 간, 신장 시료에서 곰팡이 독소를 추출, 정제하여 분석하였을 때 곰팡이 독소 4종(아플라 톡신 B1, 오크라톡신 A, 데옥시니발레놀, 제랄레논)의 평균 회수율은 80.94∼98.10%이고, 상대표준편차도 14% 미만으로 조사되어 높은 정확도와 정밀도를 확인할 수 있었다.
닭의 간 및 신장 조직 2 g에 5% 개미산이 포함된 아세토니트릴을 첨가하여 진탕한 후 C₁₈/PSA대신 상용화된 EMR-dSPE와 EMR polish을 사용하여 정제하였다. 본 전처리 방법은 6종의 곰팡이 독소를 동일한 과정으로 정제하여 분석시간을 최소화하였으며, EMR-dSPE와 EMR polish를 사용하여 매트릭스의 간섭을 줄일 수 있었다. 닭의 간 및 신장조직의 추출 및 정제 과정을 Fig.
실험 결과, 닭의 간과 신장 조직에서 곰팡이 독소 4종(아플라톡신 B1, 오크라톡신 A, 데옥시니발레놀, 제랄레논)의 평균 회수율은 80.94∼98.10%이고, 상대표준편차도 14% 미만으로 조사되어 높은 정확도와 정밀 도를 확인할 수 있었다.
곰팡이 독소의 LC-MS/MS에서의 분석 조건을 확립하기 위해 표준용액(100 ng/mL)을 주입하여 양이온 모드와 음이온 모드에서 분석하였다. 아플라톡신 B₁․M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁은 양이온 모드에서, 데옥시니발레놀, 제랄레논은 음이온 모드에서 더 좋은 감도를 나타내었다. MS/MS 분석 시 multiple reaction ionization(MRM) 모드로 최적화된 분석 조건에서 product ion 및 collision energy 값을 선정하였다.
푸모니신 B1은 닭 간과 신장 조직 모두에서 검출한계가 각각 145.79 μg/kg, 197.20 μg/kg으로 높게 나타났으며, 데옥시니발레놀은 간조직에서 검출한계가 105.50 μg/kg으로, 아플 라톡신 B1, 오크라톡신 A, 제랄레논은 정량한계가 13 μg/kg 이하로 확인되었다.
50 μg/kg으로, 아플 라톡신 B₁, 오크라톡신 A, 제랄레논은 정량한계가 13 μg/kg 이하로 확인되었다. 현재 우리나라에서는 식품공전상 육류에서의 곰팡이 독소 기준은 설정되어 있지 않지만, 식품에서 곰팡이 독소를 기준으로 하였을 때 본 연구에서 확립된 곰팡이 독소 6종 동시 분석법은 모두 각각의 독소 기준치 이하까지 분석 가능함을 알 수 있다.
곰팡이 독소의 경우 닭에서 독성이 강하며, 본 실험에서는 가축의 사료에서 주로 확인되는 곰팡이 독소 6종 (아플라톡신 B₁․M₁, 오크라톡신 A, 푸모니신 B₁, 데옥시니발레놀, 제랄레논)을 선별하여 추출, 정제조건을 확립하고 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 확립된 분석조건에서 검량선은 R²값이 0.99 이상으로 우수한 직선성을 나타내었다. QUECHERS법을 응용하여 닭 간, 신장 시료에서 곰팡이 독소를 추출, 정제하여 분석하였을 때 곰팡이 독소 4종(아플라 톡신 B₁, 오크라톡신 A, 데옥시니발레놀, 제랄레논)의 평균 회수율은 80.

후속연구

현재까지, 식물, 동물 등 다양한 시료에서 곰팡이 독소를 분석하는 여러 방법이 보고되어 사용되고 있다. LC-MS/MS 를 이용하여 닭의 간, 신장에서 곰팡이 독소 6종의 선택성, 직선성 및 회수율로 측정한 정확성 및 반복 재현성 분석 결과, 본 연구에서 확립된 실험방법은 생체시료에서 효율적인 곰팡이 독소 동시 분석법으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
59 μg/kg으로 나타났다. 본 연구의 결과 LC-MS/MS를 이용하여 닭의 간, 신장에서 곰팡이 독소 6종 동시 분석법을 확립하였으며, 이는 생체시료에서 효율적인 곰팡이 독소 동시 분석법으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	오염된 가축 사료에서 곰팡이 독소 노출시 독소는 동물의 어떤 부위에 잔류하는가?	동물에서 곰팡이 독소 노출 또는 중독 여부를 확인하기 위해 간, 신장 등 장기 조직에 잔류된 독소를 분석하는 방법이 보고되고 있다. 오염된 가축 사료에서 주로 확인되는 6종의 곰팡이 독소도 간, 신장에 잔류되는 것이 알려져 있다. 오크라톡신은 높은 안정성 때문에 사료에 의해 노출된 동물의 순환계, 간, 근육, 지방 등 조직에 축적되어 먹이사슬에 의해 인체에까지 노출되며, 푸모니신의 경우 가축에서 노출 시 근육 조직, 유, 알에서는 곰팡이 독소가 정체되지 않았지만, 간과 신장에서 소량 정체된다는 것이 알려져 있다(Schlatter et al.
	곰팡이 독소는 무엇에 의해 생성되나?	곰팡이 독소는 곡식의 재배, 저장, 유통 과정 중에 생성되는 곰팡이(mold)의 이차대사산물로서 Aspergillus, Fusarium, Penicillium 등에 의해 생성된다(Solfrizzo et al., 2011; Whitlow et al.
	사람은 어떻게 곰팡이 독소에 노출될 수 있는가?	, 2005). 사람의 경우, 곰팡이 독소에 오염된 식품에 의해 직접적으로 노출되거나, 곰팡이 독소에 오염된 곡식이나 사료에 의해 곰팡이 독소에 노출된 식육을 섭취하는 과정에서 노출될 수 있다. 오염된 가축 사료에서 주로 확인 되는 곰팡이 독소는 아플라톡신 B1․M1, 오크라톡신 A, 푸 모니신 B1, 데옥시니발레놀, 제랄레논 등이며, 유럽위원회 (European Commision)에서는 가축사료에서 곰팡이 독소 5종(아플라톡신 B1, 데옥시니발레놀, 제랄레논, 푸모니신 B1+ B2, 오크라톡신 A)에 대한 최대 허용치를 설정하여 관리하고 있다(Solfrizzo et al.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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