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문제 정의
- Aesculetin이 세포 외 기질을 분해하는데 가장 중요한 기질분해 단백질인 MMPs의 단백질 발현을 어떻게 조절하는지 조사하였다. Fig.
- 본 연구에서 연구된 asescu- letin는 이전의 암 관련 연구에서 사람의 대장암 세포의 성장을 억제하는 효과가 있는 것으로 보고되었다[17]. 그러므로 본연구에서는 HT1080세포에서 분비되는 MMP-9의 효소 활성 및 단백질 발현에 대한 aesculetin의 효능을 조사하였다. Aesculetine MMP-9의 활성 및 발현에 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 최근에 산초나무의 열매가 생리활성에 효과가 있는 물질로 밝혀지고 있으며 중요성이 점차 증가되고 있다[10, 16]. 따라서 본 연구에서는 산초나무의 주 성분 중 하나인 aesculetin을 사용하여 MMPs의 활성과 암세포의 침윤과 전이에 분비되는 단백질 분해 효소인 MMPs의 활성 및 발현 수준을 조사하여, 보다 효과적이고 안정한 암 치료제 개발로서의 가능성을 제시하고자 한다.
- 생체에서 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH radical 과 같은 활성산소종에 대한 aesculetin의 소거능력에 대하여 조사하였다. DPPH radical 소거법은 항산화 물질에 의해 DPPH radical의 흡광도 변화의 정도를 지표로 하여 산화 억제 정도를 예측할 수 있다.
제안 방법
- 배양된 세포에 aesculetin와 VEGF를 처리한 후 36℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24well culture plate안의 배지와 insert안의 배지를 깨끗이 제거한 뒤, 솜면봉을 이용해 insert 안의 남은 세포를 깨끗이 제거하였다. Insert 바닥을 투과한 세포들은 염색을 한 뒤, 10% acetic acid 용액에 용해시켜 96well plate에 옮겨 담아 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Aesculetin을 처리하고 PMA로 자극한 HT1080 세포에 용출 완충용액 (50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 μg/ml leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을첨가하여 4℃에서 30 min 동안 처리하였다. 10 μg의 세포 용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다.
- Gelatin이 분해된 bands는 청색배경에 투명한 bands 로 나타난다. Bands의 intensity는 MMPs의 활성에 비례하여 나타나는데 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)로 관찰한 후 촬영하였다.
- 수행하였다. DAPI로 HT1080 세포의 핵을 파란색으로 표지하고, FITC로 목적단백질인 MMP-9을 녹색으로 표지 하였다. Fig.
- 5% tween 20을 함유하는 PBS로 세포막의 투과성을 높였다. Donkey normal se- rum으로 전처리 한 뒤 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti- MMP-9)를 5% donkey normal serum과 0.1% tween 20을 함유하는 PBS에 녹여 24시간 처리하였다. 다음으로 0.
- Fig. 4에서는 HT1080 세포에 aesculetin을 처리 한 후 72시간 동안 배양 한 상등액에서 MMP-9의 효소 활성을 측정하였다. Fig.
- HT1080세포에서 암 전이 시에 분비되는 효소인 MMP-9 단백질 발현 부위를 조사하기 위해 항원-항체반응을 이용한 im- munofluorescence를 수행하였다. DAPI로 HT1080 세포의 핵을 파란색으로 표지하고, FITC로 목적단백질인 MMP-9을 녹색으로 표지 하였다.
- MMP-2 및 MMP-9 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 배양한 HT1080 세포에 aesculetin을 처리하고, MMP의 발현 및 활성을 자극시키는 것으로 알려진 PMA를 1 ng/ml 처리하여 실험을 수행하였다. 50 μg의 총 단백질을 함유하는 세포배양액을 1.
- 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-MMP-9, anti-TIMP-1, anti-beta- actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적 단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- Imai et al. [13] 실험방법을 변형하여 1, 1-diphenyl-2-pic- rylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 aesculetin의 소거 능력을 측정하였다. 시험농도의 aesculetin을 DPPH 용액을 가하여 10 sec 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20 min 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 10 μg의 세포 용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-MMP-9, anti-TIMP-1, anti-beta- actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적 단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 1% tween 20을 함유하는 PBS에 녹여 24시간 처리하였다. 다음으로 0.1% tween 20을 함유한 PBS로 남은 1차 항체를 2회 세척한 뒤, 형광 표지된 2차 항체(donkey anti-rabbit conjugated FITC)를 1차 항체와 똑같은 방법으로 1시간 처리하였다. 마지막으로 DAPI를함유한 형광 shield는 slide를 mounting한 뒤 confocal micro- scopy를 이용하여 목적 단백질을 관찰하였다.
- 대조군과 aesculetin처리군에는 혈관표피성장인자 (VEGF)를 처리하여 24시간 배양하였다. Fig.
- 3에서 보는 바와 같이 aesculetine 공시험군과 비교하여 농도가 증가함에 따라 세포독성이 증가하였으나 시험농도인 16 μM 이하의 농도에서 80% 이상의 세포가 생존하였으므로 그 효과는 미미한 것으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서는 16 μM 이하의 농도 범위에서 계속적인 실험을 수행하였다.
- 1% tween 20을 함유한 PBS로 남은 1차 항체를 2회 세척한 뒤, 형광 표지된 2차 항체(donkey anti-rabbit conjugated FITC)를 1차 항체와 똑같은 방법으로 1시간 처리하였다. 마지막으로 DAPI를함유한 형광 shield는 slide를 mounting한 뒤 confocal micro- scopy를 이용하여 목적 단백질을 관찰하였다.
- 세포외 기질인 gelatin과 fibronectin을 분해한다고 알려져있는 MMP-9은 암세포의 암 전이 시 침윤과 신생 혈관 생성에 필수적인 요소임으로, aesculetin의 MMP-9 효소 활성 조절에 미치는 영향을 조사하기 위하여 gelatin zymography를 수행하였다. Fig.
- 여기에 10% trichloroacetic acid (TCA)용액을 1 ml 가하여 13, 500× g에서 15 min 동안 원심분리 후 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml을 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 시료 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
- 암 전이 시에 일어나는 세포침윤에 대한 aesculetin의 억제 효과를 조사하기 위하여 cell invasion assay를 수행하였다. 대조군과 aesculetin처리군에는 혈관표피성장인자 (VEGF)를 처리하여 24시간 배양하였다.
대상 데이터
- HT1080 세포는 5% CO2 및 37℃에서 95% 이상의 습도가 유지되는 배양기에서 5% fetal bovine serum, 2 mM gluta- mine, 10, 000 U/ml penicillin/10, 000 μg/ml streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.
- (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. HT1080 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA) 로부터 구입하였다. 3-(4, 5-dimethyl-2-yl)-2, 5-diphenyltetra- zolium bromide (MTT) 시약, gelatin, agarose, phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) 및 기타 시약은 Sigma Chemical Co.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / am- photericin (각각 10, 000 U/ml, 10, 000 μg/ml 및 2, 500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technolo- gies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. HT1080 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA) 로부터 구입하였다.
데이터처리
- Data are given as means of values ± SD from three independent experiments. Level of sig- nificance was identified statistically (**, p<0.01; ***, p<0.001) using Student’s t test.
- from three independent experiments. Level of significance was identified statistically (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) using Student’s t test.
- Data are given as means of values ± SD from three independent experiments. Level of significance was identified statistically (***, p<0.001) using Student’s t test.
- from three independent experiments. Level of significance was identified statistically (*, p<0.05; **, p<0.01) using Student's t test.
- from three independent experiments. Level of significance was identified statistically (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) using Student’s t test.
- 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료농도 군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료농도 군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.
이론/모형
- Aesculetin의 HT1080 세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig.
- Aesculetin의 환원력을 조사하기 위해 potassium ferrycya- nide reduction법을 사용하였다. 그 결과 Fig.
- Oyaizu [21]의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1 ml에 pH 6.
- Hansen et al. [11]의 방법에 따라 HT1080 세포에 대한 aes- culetin의 세포독성을 MTT (3-(4, 5-dimethyl-2-yl)-2, 5-diphe- nyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
- 세포침윤실험은 Invasion Assay Kit (ECM550) Chemicon® 의 방법에 따라 수행하였다. 24well cell culture plate에 cell culture insert를 넣고 insert안에는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지를 넣은 뒤 36℃에서 30분간 배양하였다.
성능/효과
- 6에서 보는 바와 같이, 공시험 군에 비하여 MMPs 효소의 발현을 유도하는 PMA처리군에서는 세포질 부위에서 MMP-9의 발현을 증가시켰다. Aesculetin 처리 군은 8 μM 농도에서 PMA로 유도된 대조군과 비교해 MMP-9 단백질 발현을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다.
- 그러므로 본연구에서는 HT1080세포에서 분비되는 MMP-9의 효소 활성 및 단백질 발현에 대한 aesculetin의 효능을 조사하였다. Aesculetine MMP-9의 활성 및 발현에 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 알려진 aesculetin의 p38 MAPK와 AP-1을 통한 MMP-9의 단백질 발현 억제 효과와 유사한 것으로 사료된다[5].
- 7에서 보는 바와 같이 aescule-tin처리군은 대조군인 VEGF 처리군과 비교 시 농도 의존적으로 세포침윤을 억제하는 것으로 나타났다. Aesculetine 최고농도인 8 μM 농도에서 VEGF 처리군과 비교하여 약 60%의 세포침윤을 억제하는 것으로 나타났다.
- DPPH radical 소거법은 항산화 물질에 의해 DPPH radical의 흡광도 변화의 정도를 지표로 하여 산화 억제 정도를 예측할 수 있다. Aesculetin의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정한 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 DPPH에 대하여 aesculetin의 소거효과가 우수하게 나타났다. 양성 대조군 vitamin C는 0.
- 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 aesculetine 공시험군과 비교하여 농도가 증가함에 따라 세포독성이 증가하였으나 시험농도인 16 μM 이하의 농도에서 80% 이상의 세포가 생존하였으므로 그 효과는 미미한 것으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서는 16 μM 이하의 농도 범위에서 계속적인 실험을 수행하였다.
- reduction법을 사용하였다. 그 결과 Fig. 2에서 vitamin C는 0.001%의 농도에서 대조군과 비교하여 217%의 환원력을 나타냈다. 그리고 aesculetine 4 μM이상의 농도에서 환원력이 대조군에 비해 증가하였고 4, 8, 16 μM의 농도에서 각각 25, 68, 115%의 환원력을 나타내었다.
- 뿐만 아니라 연구결과에서 MMPs 의 효소 활성을 억제하는 TIMP-1의 단백질 발현을 증가시켰다. 그리고 TIMP-1과 MMP-9의 관계에 대한 연구를 조사하였을 때 naringin의 효과와 유사하게[1], aesculetin의 암 전이효과는 TIMP-1의 단백질 발현을 증가시켜 MMP-9의 활성 및 단백질의 발현을 감소시킨 것으로 사료된다. TIMP-1은 생체 내에 존재하는 MMP-9의 직접적인 억제제로 TIMP-1의 생성량이 증가되면 MMP-9의 활성이 억제될 수 있다.
- 001%의 농도에서 대조군과 비교하여 217%의 환원력을 나타냈다. 그리고 aesculetine 4 μM이상의 농도에서 환원력이 대조군에 비해 증가하였고 4, 8, 16 μM의 농도에서 각각 25, 68, 115%의 환원력을 나타내었다.
- 5에서 보는 바와 같이, aesculetin의 8 μM 농도처리 군에서 PMA 처리군과 비교 시 MMP-9의 단백질 발현은 억제되는 것으로 나타났다. 또한 MMP-9을 조절한다고 알려진 TIMP-1의 단백질 발현도 aesculetin에 의하여 증가되는 것으로 관찰되어, aesculetine TIMP-1의 발현을 증가시켜 MMP- 9의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
- 그러므로 항산화 활성을 가진 안전한 약물의 개발이 요구된다. 본 연구에서는 천연물 유래의 aesculetin의항산화 효과를 조사한 결과 DPPH radical 소거능력에서는 대조군으로 사용된 vitamin C와 유사한 억제효과를 나타냈으며 또한 환원력도 매우 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 aesculetin이 hydroxyl radical의 소거효과를 가진다는 연구 결과와 일맥 상통하는 것임으로[24], aesculetine 생체 내에서 발생하는 활성산소종을 소거함으로써 지질, 단백질 및 DNA 의 산화적 손상을 억제하여 암과 같은 질병을 예방하는데 도움을 줄 수 있다는 것을 암시하고 있다.
- 이러한 결과는 알려진 aesculetin의 p38 MAPK와 AP-1을 통한 MMP-9의 단백질 발현 억제 효과와 유사한 것으로 사료된다[5]. 뿐만 아니라 연구결과에서 MMPs 의 효소 활성을 억제하는 TIMP-1의 단백질 발현을 증가시켰다. 그리고 TIMP-1과 MMP-9의 관계에 대한 연구를 조사하였을 때 naringin의 효과와 유사하게[1], aesculetin의 암 전이효과는 TIMP-1의 단백질 발현을 증가시켜 MMP-9의 활성 및 단백질의 발현을 감소시킨 것으로 사료된다.
- TIMP-1은 생체 내에 존재하는 MMP-9의 직접적인 억제제로 TIMP-1의 생성량이 증가되면 MMP-9의 활성이 억제될 수 있다. 암은 전이되기 위해서 신생혈관이 다른 혈관이나 세포에 침투해야 하는데 이와 같은 침윤 정도를 알아보기 위해 혈관표피성장인자 (VEGF)로 자극시켜 invasion assay 수행한 결과 aesculetin 이 암세포의 침윤을 억제하는 것으로 나타났다. 이와 유사하게 이전 연구에서도 aesculetin이 in vitro와 in vivo에서 VEGF로 유발된 angiogenesis를 억제한다.
- 본 연구에서는 천연물 유래의 aesculetin의항산화 효과를 조사한 결과 DPPH radical 소거능력에서는 대조군으로 사용된 vitamin C와 유사한 억제효과를 나타냈으며 또한 환원력도 매우 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 aesculetin이 hydroxyl radical의 소거효과를 가진다는 연구 결과와 일맥 상통하는 것임으로[24], aesculetine 생체 내에서 발생하는 활성산소종을 소거함으로써 지질, 단백질 및 DNA 의 산화적 손상을 억제하여 암과 같은 질병을 예방하는데 도움을 줄 수 있다는 것을 암시하고 있다.
후속연구
- 이러한 암세포의 침윤과 전이에 효과적인 억제제의개발은 아직까지 미흡한 실정이다. 그러므로 MMP-2와 MMP- 9의 활성을 억제하는 천연물에 대한 연구가 더욱 구체적이고 활발히 진행되어야만 한다.
- 연구결과가 보고되었다[22]. 이러한 연구결과를 통해 aesculetine 우수한 항산화 효과는 물론 암 전이 시에 분비되는 MMPs를 억제하는 효소인 TIMP-1의 단백질 발현을 증가시켜 MMP-9의 효소 활성과 단백질 발현을 감소시킴으로써 암세포의 침윤 및 전이 억제에 도움을 줄 수 있는 암 전이 치료제로서 기대된다.
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