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문제 정의
- 최근에 probiotic 미생물과 기능성 유기성분을 가진 건 강에 유익한 식품들에 관심이 높은 가운데, 건강증진 미생물인 kefir을 이용한 천연 음용 제품의 판매가 증가되고 있다[15]. 본 연구는 치즈 제조 후 얻은 유청을 kefir grain으로 발효 시켜 kefir의 발효 특성을 조사하고, 발효액을 human mast cell-1 (HMC-1)에 처리하여 염증 관련 cytokine의 발현에 미치는 영향을 조사하여 kefir 유청 발효 제품의 개발에 대한 기초자료를 제공하기 위해 수행하였다.
제안 방법
- 0, 24, 48, 72시간 배양한 유청 발효액을 3, 000× g으로 10분간 원심분리하여 상층 액을 100 μl 취해 스피드 백으로 건조 후 전기영동을 수행하였다[17]. Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacry- lamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)는 12% acrylamide gel, 10% SDS를 함유한 1.
- 24-well (Sigma, St. Louis, MO, USA)에 4×105 cells/ml로 조정하여 24시간 배양 후 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 배양한 유청 발효액을 HMC-1에 1, 50, 100 μg/ml로 처리한 뒤 0, 6, 12, 24시간 동안 배양 후 allergy 및 pro-, anti-inflammatory cytokine인 IL-4, IL-8의 mRNA의 발현은 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 수행하였다. Positive controle phorbol myristate acetate (PMA, Sigma-Aldrich Co.
- Kefir로 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 발효한 유청 발효액을 세포에 처리 후 분비된 IL-4, IL-8의 정량은 enzyme-linked im- mune-sorbent assay (ELISA) kit (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다. ELISA kit에 IL-4, IL-8의 표준 농도를 조정하고, 측정하고자 하는 시료를 처리한 세포배양액 50 μl를 well에 넣고 상온에서 2시간 반응시킨다.
- 15,000× g에서 10분 동안 원심분리하여 상층 액을 제거하고 pellete diethyl pyrocarbonate (DEPC) - DW 60 μl 에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR kits (Madison, WI, USA; Oligo dT, dNTP mix, Ribonuclease inhibitor, M-MLV Reverse Transcriptase, M-MLV RT 5×buffer)를 사용하여 45 ℃에서 30분, 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후 94℃에서 30초 동안 denaturation 시키고, 55∼62℃에서 30초 동안 annealing 시킨 다음, 72℃에서 1분 동안 extension 시키는 cycle을 24∼27회 반복한 뒤, 마지막 extensione 72℃에서 5분 동안 PCR (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) 을 수행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에 주입하고 100 V 조건에서 15분 동안 전기영동을 수행하였다.
- 유청을 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 배양 후 발효액의 pH 변화와 적정 산도를 측정하였다. pH 측정은 pH 측정기(S20 Seven EasyTM pH meter, Mettler Toledo AG, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였다. 적정산도는 시료 9 g에 증류수 9 ml 와 phenolphtalein 지시약 0.
- 유산균 수는 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 배양한 발효액을 10진 희석법으로 BCP (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) 고체 배지에 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하고 col- ony counter (Gallenkamp Co. Ltd., London, England)를 사용하여 생균 수를 조사하고 log 지수로 표시하였다. 효모 수는 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 배양한 발효액을 10진 희석법으로 Potato Dextrose agar (Becton, Dickinson Company, Sparks, MD, USA) 고체 배지에 접종한 후 30℃에서 72시간 동안 배양하고 colony counter (Gallenkamp Co.
- 유청 발효액의 유당 분해를 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 배양 후 원심분리기(Mega 17R, Hanil Science Industrial, Incheon, Korea)를 사용하여 5,000× g에서 5 min 동안 원심분리하고 분리된 상등액을 채취하여 0.2 μm membrane filter를 사용하여 여과한 후 high preformance liquid chromatography (HPLC) system (600E Multisolvent Delivery System, Waters Associates, Milford, MA, USA)을 사용하여 유당을 분석하였다. 시료는 7725 injector (Rheodyne, USA)를 사용하여 20 μl를 λ 주입하였고, Detector는 Waters model 2487 Dual Absorbance Detector (Waters Associates, MA, USA)를 사용하였고, Absorbance을 210 nm에 맞춰서 실시하였다.
- 유청 발효액의 점도는 점도계(BM type, Tokimec Inc., Tokyo, Japan)를 이용하여 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 배양 후 측정하였으며, spindle No. 3, 6을 이용하여 60 rpm으로 1분 동안 측정하여 Centi Poise (cP) 값으로 나타내었다.
- 유청발효액이 HMC-1세포에 미치는 세포독성 여부를 측정하기 위해 96 well에 1×104 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 배양한 후에 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 발효한 유청 발효액 을 1, 50, 100 μg/well를 처리하여 37℃, 5% CO2의 상태에서 24시간 배양 후 WST (Water soluble tetrazolium) assay를 실시하였다. EZ-Cytox WST assay reagent (Daeil Lab Service Co.
- 유청을 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 배양 후 발효액의 pH 변화와 적정 산도를 측정하였다. pH 측정은 pH 측정기(S20 Seven EasyTM pH meter, Mettler Toledo AG, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였다.
- , London, England)를 사용하여 생균 수를 조사하고 log 지수로 표시하였다. 효모 수는 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 배양한 발효액을 10진 희석법으로 Potato Dextrose agar (Becton, Dickinson Company, Sparks, MD, USA) 고체 배지에 접종한 후 30℃에서 72시간 동안 배양하고 colony counter (Gallenkamp Co. Ltd., London, England) 를 사용하여 생균 수를 조사하고 log 지수로 표시하였다
대상 데이터
- 6.8), 10% ammonium persulfate (APS) 를 조제하여 사용하였다. Gele 0.
- 시료는 7725 injector (Rheodyne, USA)를 사용하여 20 μl를 λ 주입하였고, Detector는 Waters model 2487 Dual Absorbance Detector (Waters Associates, MA, USA)를 사용하였고, Absorbance을 210 nm에 맞춰서 실시하였다. Columne SUPELCOGEL C-610H (38 cm×7.8 mm, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였고, column의 온도는 Waters Column Heater Module (serial #F98CHM095M)을 사용하여 40℃를 유지하였고, 이동상은 HPLC용 0.1% phosphoric acid를 사용하여 0.5 ml/min의 유속으로 30분 분석하였다. 분석프로그램은 Autochro-WIN 2.
- 8), 10% ammonium persulfate (APS) 를 조제하여 사용하였다. Gele 0.2% (w/v) commassie brilliant blue R-250 (Sigma Co., Louis, MO, USA)을 함유한 acetic acid/methanol/water (1:3:6, v/v/v) 용액을 사용하였다.
- 농촌진흥청 축산과학원(Wansan, Korea)에서 분양받은 ke- fir grain을 우유 배지에 배양하여 starter를 제조한 후 유청에 3%(v/v)를 접종하여 27℃에서 48시간까지 배양하였다
- 사람 유래 세포주인 HMC-1 세포(allergy 관련 세포)는 한국 생명공학연구원(Daejeon, Korea)에서 분양을 받았고 생장 및 유지를 위하여 기본 배양액은 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Rockville, MD, USA)과 1% (100 U/mg) penicillin/streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가하고, 37℃, 5% CO2와 대기 습도가 유지되는 배양 조건에서 배양하였다.
- 유청은 충남대학교 동물자원연구센터(Cheungyang, Korea) 에서 신선한 원유로 고다치즈를 제조한 후 부산물로 얻은 유 청을 사용하였다.
데이터처리
- PMA (1 μg/ml) treatment alone served as a positive control. Level of significance was identified statisti- cally compare with control using Duncan's multiple range test (*p<0.05).
- PMA (1 μg/ml) treatment alone served as a positive control. Level of significance was identified statisti- cally compare with control using Duncan's multiple range test (*p<0.05).
- 5 ml/min의 유속으로 30분 분석하였다. 분석프로그램은 Autochro-WIN 2.0 plus (Young Lin Instrument Co., Ltd., Anyang, Korea)를 사용하여 정량하였다.
-
통계처리
통계분석은 MYSTAT statistical analysis program (ver 2.0, Korea)과 IBM SPSS Statistics 21 (version 21.0, IBM Co., USA) 을 사용하여 평균, 표준편차 및 Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의적 차이를 검정하였다.
성능/효과
- 3에 나타난 바와 같다. 0, 24, 48, 72시간 동안 발효하는 과정에서 유청 단백질의 변화가 있는 것으로 나타났다. BSA (bovine se- rum albumin, 69 kDa), β-LG (ß-lactoglobulin, 18.
- 5와 같다. IL-4는 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 발효시킨 발효액을 각각 HMC-1 세포에 처리한 결과 발효 0시간에는 발현이 일어나지 않았고, 4, 8, 16, 24시간 발효액에서 IL-4의 발현은 positive control인 PMA 처리에 비해서는 약하게 일어났지만, 48시간 배양액에서는 발현이 일어나지 않음을 확인하였다. IL-8은 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 발효 시 킨 발효액을 HMC-1 세포에 처리한 결과 IL-4의 발현양상과 비슷하게 발현이 되었지만, 4, 8시간에 강하게 발현이 일어났고 48시간 배양한 배양액에서는 발현이 일어나지 않음을 알 수 있다.
- 1C에 나타내었다. pH는 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 배양 시간이 지남에 따라 유산균과 효모의 숫자가 증가하여 유산 생산 양이 증가하면서 pH가 급 속히 낮아져 배양 16시간에는 5.3, 배양 48시간에는 4.7로 감소 하였다. 적정산도는 Fig.
- 7은 IL_8의 생산량을 측정한 결과로 kefir로 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 발효한 유청 발효액을 세포에 처리한 경우 4, 8, 16시간 동안 발효한 유청 발효액을 HMC-1 세포에 6, 12시간 반응시켰을 때 IL-8은 15-20 ng/ml 전후로 유의적으로 분비되었다. 그러나 24시간 유청 발효액으로 6, 12, 24시간 처리 구는 11-13 ng/ml, 48시간 유청 발효액으로 6, 12, 24시간 처리 구는 8 ng/ml 정도로 IL-8의 분비가 저해됨을 알 수 있는데, 이 또한 kefir 유청 발효액이 배양 초기에 비해 배양 시간이 길어짐에 따라 IL-8의 발현이 저해되는 결과와 동일한 것으로 kefir 유청 발효액의 발효 초기보다는 48시간 배양액의 다양한 대사산물 들에 의해 유청 발효액이 염증 관련 cytokine인 IL-8의 분비를 저해 시켜 염증반응을 저감시키는 것으로 사료된다.
- 4에 나타난 바와 같이 유청 발효액은 HMC-1 세포의 성장을 저해하는 독성이 없는 것으로 나타났다. 대조군을 100% 기준으로 0, 4, 8, 16, 24, 48시간 동안 배양한 유청발 효액은 대조군보다 높은 생존율을 보임으로서 유청 발효액이 세포 성장에 어떠한 독성효과도 나타나지 않았다.
- 2에 나타난 바와 같다. 배양 시간이 경과하면서 유당은 분해되어 단당류인 glucose와 galactose로 분해되어 glucose는 유산균과 효모가 이용하고 galactose는 조금씩 증가됨을 알 수 있다. 유청에는 유당이 약 4.
- 1D에 나타난 바와 같다. 유산균과 효모가 증식하면서 유산의 생산이 증가하여 적정산도는 배양 48시간에는 0.8%로 증가되어, 요구르트의 적정산도 0.8-1.0%와 유사한 수준으로 유청 발효액도 적정 산도를 유지할 수 있음을 알 수 있다.
- 5×105 CFU/ml로 최대로 성장하였고 그 이후에는 약간 감소하면서 48시간까지 그대로 유지되었다. 이와 같이 유청에 kefir를 배양시키면 유산균은 유당을 이용하고 효모는 유당 발효성 효모가 유당을 이용하기 때문에 성장을 잘하는 것으로 나타났다.
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