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문제 정의
- 본 연구에서는 건강한 닭의 맹장에서 유래한 유산균(Lactic Acid Bacteria)을 분리하여 가금류 병원성의 주 원인균인 Salmonella를 비롯하여 병원성 내성균들(Antibiotic-Resistant Bacteria)에 대한 항균 효과를 측정하고 이를 생균제로 이용하기 위해 기본적인 장내환경에 대한 내성과 기능성에 대해 시험하였다.
제안 방법
- MRS 액체 배지에 유산균을 접종 후 세균의 생장에 따른 pH 변화, 항균력의 변화와 배양기간 중 생산되는 유기산의 변화를 0, 12, 24, 36, 48시간에 측정하였다.
- 건강한 닭의 맹장에서 분리한 유산균을 선별하기 위해 MRS 한천배지에 혐기 조건으로 배양하여 단일 colony를 형성하는 3종의 균주를 1차 선별하였다. 분리된 세균의 동정을 위해 형태적, 생화학적 특성과 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 Lactobacillus sakei 2종, Enterococcus feacium 1종으로 나타났다.
- 내담즙성 검사는 MRS 배지에서 37℃ 48시간 배양한 시험 균주 1 ml을 0%, 0.3%와 1.0% (w/v)의 oxgall이 포함된 MRS 액체배지 9 ml에 접종하고, 24시간 후 생균수를 측정하였다. 생균수는 MRS 평판배지에서 48시간 동안 37℃에 배양하여 측정하였다.
- 대식세포 활성능 측정은 Conrad [5]의 방법을 변형하여 이용하였다. ICR mouse(6주령, female)에 3% thioglycollate 배지 2 ml를 복강에 주사하고, 2일 후 유도된 복강 내 대식세포를 RPMI 1640-FBS medium을 이용하여 회수하고 3회 세척하였다.
- 면역 증진 효과를 알아보기 위해 대식세포(macrophage)의 활성능과 대식세포(macrophage)로부터 분비되는 사이토카인 interleukin-6 (IL-6)과 tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 생성을 측정하였다. 실험동물은 ICR mouse를 ㈜코아텍에서 구입하여 1주일 이상 사육장 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
- 본 선발 균주를 생균제로 활용할 수 있는지의 여부를 판단하기 위해 균주의 내산성, 펩신효소의 내성, 내담즙성을 알아보았다.
- 이 중 대표적으로 IL-6과 TNF-α은 급성기 반응을 유발하는데 핵심적인 역할을 하며[23], 대식세포는 이들 사이토카인의 생성을 통해 숙주의 방어를 효과적으로 돕는다[15]. 본 연구에서는 대식세포에 LAB 2와 8의 사균체를 이용하여 대식세포에서 생성되어 분비된 사이토카인 IL-6과 TNF-α를 측정하였다. 그 결과, LAB 2와 8 모두 음성대조군(PBS)과 비교하여 사이토카인의 생성을 유도하였고(Fig.
- 분리된 세균의 동정을 위해 형태적, 생리적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 형태학적인 특성은 그람염색 후 현미경으로 관찰하였으며, 생리적, 생화학적 특성 조사는 API 50 CHL 키트 (biomerieux, France)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였다.
- 유산균의 분리를 위해 건강한 닭의 맹장에서 1 g 정도의 내용물을 10 g에 멸균수를 가한 후 섞어주고, 희석액 1 ml를 취해 105, 106, 107 배율로 단계별 희석하였다. 각 희석액을 0.
- 2)으로 균체를 연속적으로 희석시키고 MRS 평판배지 상에서 생균수를 측정하였다. 인공위액 내성 검사는 1% (w/v) pepsin이 포함된 pH 2, 3으로 조정된 MRS 배지를 이용하여 시험하였다.
- 분리된 세균의 동정을 위해 형태적, 생리적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 형태학적인 특성은 그람염색 후 현미경으로 관찰하였으며, 생리적, 생화학적 특성 조사는 API 50 CHL 키트 (biomerieux, France)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였다. 분리된 균주의 염기서열분석을 위해 16S rDNA sequencing을 실시하였다.
대상 데이터
- 면역 증진 효과를 알아보기 위해 대식세포(macrophage)의 활성능과 대식세포(macrophage)로부터 분비되는 사이토카인 interleukin-6 (IL-6)과 tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 생성을 측정하였다. 실험동물은 ICR mouse를 ㈜코아텍에서 구입하여 1주일 이상 사육장 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 사육장의 실내 온도는 20−24℃, 상대습도는 45.
이론/모형
- 이를 5% CO2 incubator에서 배양(37℃, 2시간)하여 macrophage monolayer를 형성시키고, 상등액을 제거한 후 각 well에 RPMI 1640 medium을 180 μl를 분주하고, LAB2와 LAB8의 사균 샘플 20 μl를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 1일간 배양하였다. 배양 후 WST-1(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt reagent) assay를 시행하여 대식세포의 활성능을 측정하였다. 샘플의 활성 정도를 평가하기 위해 lipopolysaccharide (LPS, Sigma Co.
- 유산균의 사균 샘플을 이용하여 자극시킨 대식세포에서 분비된 사이토카인 IL-6과 TNF-α의 양의 측정은 IL-6와 TNF-α ELISA kit (BD Opt EIA, BD Biosciences, USA)을 이용하였으며, 제공된 지시사항에 따라 실험을 진행하였다.
- 항균활성은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; formerly NCCLS)의 디스크 확산법(NCCLS M2-A7, 2000)에 준하여 측정하였다. 분리된 유산균을 100 ml의 MRS 액체배지에 접종하여 37℃, 48시간 배양하고, 그 배양액을 8,000 × g에서 원심분리한 후 균체를 제거하였다.
성능/효과
- 0% (w/v)의 oxgall이 함유된 배지에서도 높은 생존율을 보여(Fig. 2) 생균제로 이용 가능함을 알 수 있었다. LAB 17은 높은 내 담즙성을 보였지만 내산성이 낮아 추가 실험을 진행하지 않았다.
- 유산균의 사균체는 살아있는 생균과 면역증진의 효과가 비슷하다는 여러 문헌이 있으며[14, 16], 면역력이 약한 사람에게는 더 안전하게 사용할 수 있는 장점이 있다. LAB 2와 LAB 8의 사균체는 대식세포를 이용한 활성능과 대식세포에서 생성되는 사이토카인의 증가를 통해 면역증진 효과를 보여 Probiotics의 가능성을 보였다.
- LAB 2와 LAB 8의 농축 상등액은 대상 병원균에 투명대를 형성하여 항균활성을 확인하였으며(Table 1), 이러한 유산균의 항균력은 유기산, 과산화수소, 디아세틸, 박테리오신 등의 물질에 기인한다[8]. LAB 2와 LAB 8의 상등액의 pH를 중성으로 조절하여 항균력을 측정한 결과 투명대가 형성되지 않아 LAB 2와 LAB 8의 항균활성 물질은 유기산임을 알 수 있었다. 다양한 논문에서 유산균이 생성하는 젖산과 초산 등의 유기산에 기인한 항균력을 보고하고 있으며[10, 11], 유산균이 생성하는 Lactobacillus 종에서 생산하는 젖산은 항균력 외에도 그람음성 세균의 outer membrane의 막투과제로 작용하여 항균물질이 투과할 수 있게 하여 항균물질의 효과를 증진 시킬 수 있는 것으로 나타났다[1].
- LAB2와 8의 생장에 따른 항균력을 측정하기 위해 12시간 간격으로 상등액을 채취하여 농축하여 이용하였다. 가금류 병원성의 주 원인균인 Salmonella 종을 병원성 균으로 이용 하여 항균력을 시험한 결과 LAB2와 LAB8 모두 48시간 배양한 결과에서 가장 높은 항균력을 보였다(Table 2).
- 본 연구에서는 대식세포에 LAB 2와 8의 사균체를 이용하여 대식세포에서 생성되어 분비된 사이토카인 IL-6과 TNF-α를 측정하였다. 그 결과, LAB 2와 8 모두 음성대조군(PBS)과 비교하여 사이토카인의 생성을 유도하였고(Fig. 6, Fig.
- 대식세포의 활성능은 LAB 2와 8의 사균체를 이용하여 측정하였으며, 음성대조군(PBS)과 비교하였다. 그 결과, 가장 높은 농도(1 × 108 cells/ml)로 처리했을 때 각각 51%, 49% 증가 효과를 보여 가장 높은 증가효과를 보였으며, 이는 양성 대조군(LPS)이 43% 증가효과를 보인 것 보다 조금 더 높게 나타났다(Fig. 5).
- 건강한 닭의 맹장에서 분리한 유산균을 선별하기 위해 MRS 한천배지에 혐기 조건으로 배양하여 단일 colony를 형성하는 3종의 균주를 1차 선별하였다. 분리된 세균의 동정을 위해 형태적, 생화학적 특성과 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 Lactobacillus sakei 2종, Enterococcus feacium 1종으로 나타났다.
- 분리세균에 의해 배양시간에 따라 생산되는 유기산을 분석하기 위해 HPLC를 사용하여 측정한 결과, acetic acid 보다 lactic acid의 생산량이 높게 나타났다(Fig. 3B, 4B).
- LAB 17의 경우 pH 2와 pH 3에서 71%, 53%로 좀 더 낮은 생존율을 보였다. 인공위액 내성을 보기 위해 펩신효소를 첨가하여 시험한 결과 LAB 2는 80% 이상 생존하여 가장 높은 생존율을 보였으며, LAB 17은 50% 이상의 생존율을 보였다. 0.
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