선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- Candida antarctica lipase는 다른 효소들에 비해 높은 활성을 보였으나, Candida rugosa lipase가 가장 높은 초기 반 응 속도와 효소 활성을 보였다. 따라서 본 연구에서는 고정화를 위한 효소로 Candida rugosa lipase를 선정하여 진행하였다
- 이에 본 연구에서는 단위 부피당 큰 표면적을 가지고 있는 나노입자를 이용한 효소 고정화를 통해 효소의 안정성을 높이기 위해 연구를 수행하였다.고정화 지지체로 사용된 실리카나노입자와 실리카 코팅된 자성나노입자에 각각 epoxy group, epoxy-amine group, amine group의 작용기를 부착시켜 기능성을 부가한 후 리파아제를 고정화하였으며, 작용기를 달리하여 고정화된 효소의 활성 및 안정성 비교를 통해, 고정화시킬 때 부착한 작 용기가 효소의 활성과 안정성에 미치는 영향을 관찰하였다
제안 방법
- 2) Epoxy-amine group 부착- Epoxy gorup이 부착된 나노입자 또는 실리카 코팅된 자성 나노입자 2 g에 EDA 200 mL을 첨가하여 7시간 동안 80 oC에서 질소 환류하에 반응하였다. 3) Amine group 부착- Toluene 40 mL에 나노입자 또는 실리카 코팅된 자성 나노입자 2 g, APTES를 2% (v/v) 첨가하여 15시간 동안 80 oC에서 아르곤 환류하에 반응하였다. 1), 2), 3)과정 후 rotary evaporator로 용매를 증발시키고 80 oC, vacuum oven에서 하루 동안 건조시켜 파우더 형태로 보관하여 사용하였다.
- 3.4절의 결과로부터 내구성과 안정성이 우수한 실리카 코팅된 자성 나노입자를 지지체로 선정하였으며, 실리카 코팅된 자성 나노입자에 amine group을 부착한 후 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법과 공유 결합법으로 각각 달리하여 효소를 고정화시킬 때 고정화된 효소의 활성을 측정하였다. Fig.
- Epoxy group과 epoxy-amine group을 각각 부착한 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 Candida rugosa lipase를 고정화하여 효소 활성을 비교하였다. Fig.
- Epoxy group과 epoxy-amine group을 각각 부착한 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 고정화한 Candida rugosa lipase의 안정성을 즉정하였다 (Fig. 5). 이를 위해 효소 반응 후 반응이 종료된 용액에서 고정화 효소만을 회수하여 활성을 측정하였으며, 이 과정을 5번 반복하여 실험하였다.
- 리파아제의 재사용, 내구성 등의 안정성을 높이기 위해 실리카나노 나노입자 실리카 코팅된 자성 나노입 자를 효소 고정화를 위한 지지체로 사용하였다. 각 지지체 표면에 효소를 고정화하기 위해 epoxy group,amine group을 각각 부착시켜 효소 고정화를 진행하였다.고정화에 적합한 리파아제를 찾기 위해 8가지 종류의 리파아제 가수분해 활성을 측정한 결과 Candida rugosa lipase가 가장 높은 활성을 나타내어 이 효소를 표면고정화 방법을 이용하여 지지체에 고 정화하였다
- 이에 본 연구에서는 단위 부피당 큰 표면적을 가지고 있는 나노입자를 이용한 효소 고정화를 통해 효소의 안정성을 높이기 위해 연구를 수행하였다.고정화 지지체로 사용된 실리카나노입자와 실리카 코팅된 자성나노입자에 각각 epoxy group, epoxy-amine group, amine group의 작용기를 부착시켜 기능성을 부가한 후 리파아제를 고정화하였으며, 작용기를 달리하여 고정화된 효소의 활성 및 안정성 비교를 통해, 고정화시킬 때 부착한 작 용기가 효소의 활성과 안정성에 미치는 영향을 관찰하였다
- 각 지지체 표면에 효소를 고정화하기 위해 epoxy group,amine group을 각각 부착시켜 효소 고정화를 진행하였다.고정화에 적합한 리파아제를 찾기 위해 8가지 종류의 리파아제 가수분해 활성을 측정한 결과 Candida rugosa lipase가 가장 높은 활성을 나타내어 이 효소를 표면고정화 방법을 이용하여 지지체에 고 정화하였다
- 고정화효소의 작동 안정성을 측정하기 위해 2.2.6절의 가수분해 반응이 종료된 용액을 원심분리하여 상층액을 걷어내고 고정화 효소만을 회수하였다. 이때 고정화 효소는 잔류하는 기질이 없도록 10 mM SP buffer (pH 6.
- 나노입자에 고정화하기 위한 최적의 리파아제를 선정하기 위해, 많이 사용되는 8종의 리파아제의 자유효소 (free enzyme) 활성을 _p-nitrophenyl butyrate의 가수분해 반응으로 측정하여 비교하였다. Fig.
- 그런 다음 원심분리하고 ethan이로 세척한 후 냉장 보관하였다. 실리카 나노 입자의 크기와 균질 여부는 dynamic light scattering (DLS) (Dynapro NanoStar, Wyatt Technology, USA)과 asymmetric flow field-flow fractionation (AF4) (Eclipse channel, Wyatt Technology, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 실리카 코팅된 자성 나노입자에 amine group을 부착한 후 CLEA 방법과 공유 결합법으로 각각 다르게 효소를 고정화시킬 때 고정화된 효소의 안정성을 비교하였다. Fig.
- 실리카 코팅된 자성 나노입자의 구성 성분과 크기는 TEM과 XRD를 통해 분석을 하였다. Fig.
- 6절의 동일한 방법으로 고정화 효소의 활성을 측정하였다. 이 과정을 5번 반복하여 사용한 고정화 효소의 활성을 최초 활성과 비교하고 그 잔류활성 (residual activity) 을 계산하여 작동 안정성을 측정하였다.
- 6절의 가수분해 반응이 종료된 용액을 원심분리하여 상층액을 걷어내고 고정화 효소만을 회수하였다. 이때 고정화 효소는 잔류하는 기질이 없도록 10 mM SP buffer (pH 6.5)로 깨끗이 세척한 후 2.2.6절의 동일한 방법으로 고정화 효소의 활성을 측정하였다. 이 과정을 5번 반복하여 사용한 고정화 효소의 활성을 최초 활성과 비교하고 그 잔류활성 (residual activity) 을 계산하여 작동 안정성을 측정하였다.
- 반응이 끝난 후 1시간 동안 천천히 40 oC까지 낮춘 후, TEOS를 주입하여 10시간 동안 반응하였다. 이렇게 형성된 실리카 코팅된 자성 나노입자의 구성 성분은 X-ray diffraction (XRD) (SmartLab, Rigaku, Japan)을 이용하여 분석하였으며, 자성나노입자 크기와 코팅된 실리카의 두께는 transmission electron microscopy (TEM) (Jeol Ltd, Japan)을 이용하여 분석하였다.
- 5). 이를 위해 효소 반응 후 반응이 종료된 용액에서 고정화 효소만을 회수하여 활성을 측정하였으며, 이 과정을 5번 반복하여 실험하였다. 그 결과, 3회에 걸쳐 재사용하였을 때 epoxy group과 epoxyamine group을 각각 부착한 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 고정화한 Candida rugosa lipase는 최초 활성 대비 92.
- 자성나노입자를 형성하는 중에 TEOS를 첨가함으로써 실리카가 자성나노입자를 코팅하는 one-pot 합 성 방법에 따라 실리카 코팅된 자성 나노입자를 합성하였다.17 Xylene 15 mL에 NaDBS 1.
- 1), 2), 3)과정 후 rotary evaporator로 용매를 증발시키고 80 oC, vacuum oven에서 하루 동안 건조시켜 파우더 형태로 보관하여 사용하였다. 작용기의 부착 여부는 attenuated total reflection (ATR-FTIR)을 이용하여 확인하였다.
- 효소 고정화를 위한 지지체로 합성한 실리카나노입자는 dynamic light scattering (DLS)과 asymmetric flow field-flow fractionation (AF4)를 이용하여 실리카나노입자의 크기가 균일하게 분포되어 있는지를 분석하였다. AF4를 이용하여 실리카나노입자의 머무름 시간을 확인할 수 있었으며, 최대 peak의 머무름 시간으로부터 수화직경 (hydrodynamic diameter, Dh)을 계산한 결과 200 nm의 크기를 가지고 있음을 확인할 수 있었으며, DLS 측정 결과 또한 유사한 크기를 가지고 있음을 보여주고 있다.
- 효소를 나노입자 또는 실리카 코팅된 자성 나노입자로 고정화하기 위해 epoxy group, epoxy-amine group, amine group을 다음과 같은 방법으로 나노입자 또는 실리카 코팅된 자성 나노입자에 각각 부착하여 기능화시켰다. 1) Epoxy group 부착- 나노입자 또는 실리카 코팅된 자성 나노입자 2 g에 GMA 3.
대상 데이터
- 리파아제의 재사용, 내구성 등의 안정성을 높이기 위해 실리카나노 나노입자 실리카 코팅된 자성 나노입 자를 효소 고정화를 위한 지지체로 사용하였다. 각 지지체 표면에 효소를 고정화하기 위해 epoxy group,amine group을 각각 부착시켜 효소 고정화를 진행하였다.
- 본 연구에 사용된 효소인 리파아제는 Candida rugosa lipase, Rhizopus oryzae lipase, Porcine pancreas lipase, Aspergillus niger lipase, Trametes versicolor lipase, Candida antarctica lipase, Candida antarctica lipase B, Pseudomonas cepacia lipase는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
- 9 %의 Fe 성분으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서는 직경이 평균 7 nm의 실리카 코 팅된 자성 나노입자를 효소 고정화 지지체로 사용하 였다
- 1). 본 연구에서는 평균 210 nm의 실리카나노입자를 효소 고정화 지지체로 사용하였다.
- 실험에 사용한 시약인xylene, sodium dodecylbenzenesulfonic acid (NaDBS), FeCh - 4H2O,Fe(NO3)3 9H2O, hydrazine (34 wt% aqueous solution), tetraethyl orthosilicate (TEOS), ethylenediamine (EDA), toluene, aminopropyl triethoxysilane (APTES), glycidyl methacrylate (GMA), 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (AIBN), cetyltrimethylammoniumbromide (CeTAB), glutaraldehyde (GA) (25 % in H2O), N,N-dimethylformamide (DMF), p-nitrophenyl butyrate는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 그 외 모든 시약은 분석시 약급의 제품을 사용하였다.
- 그런 후 분광광도계 (BioMATE 3S, Thermo, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 한 후 분석하였다. 표준시료로는 효소 고정화로 사용한 리파아제인 Candida rugosa lipase를 사용하였다.
이론/모형
- 나노입자에 고정화된 리파아제의 양은 단백질 정량분석법인 Lowry 법을 적용하여 측정하였다.26측정할 효소용액 100 pL에 동일한 양의 alkaline copper tartrate 용액을 첨가한 후 실온에서 15분 동안 반응하였다.
- 23가두기는 효소를 한정된 공간 속에 물리적으로 가두는 것을 말하며, 표면 고정화는 효소를 지지체 표면에 흡착 또는 공유결합을 통해 부착시키는 방법이다. 본 연구에서 사용되는 고정화 방법은 표면고정화이다. 표면고정화 방법 중 홉착(adsorption)은 효소를 약한 물리적 힘에 의하여지지체의 표면에 부착하는 것이다.
성능/효과
- 효소 고정화를 위한 지지체로 합성한 실리카나노입자는 dynamic light scattering (DLS)과 asymmetric flow field-flow fractionation (AF4)를 이용하여 실리카나노입자의 크기가 균일하게 분포되어 있는지를 분석하였다. AF4를 이용하여 실리카나노입자의 머무름 시간을 확인할 수 있었으며, 최대 peak의 머무름 시간으로부터 수화직경 (hydrodynamic diameter, Dh)을 계산한 결과 200 nm의 크기를 가지고 있음을 확인할 수 있었으며, DLS 측정 결과 또한 유사한 크기를 가지고 있음을 보여주고 있다. (Fig.
- 3에 보인 바와 같이 Porcine pancreas lipase, Trametes versicolor laccase는 거의 활성을 보이지 않았다. Candida antarctica lipase는 다른 효소들에 비해 높은 활성을 보였으나, Candida rugosa lipase가 가장 높은 초기 반 응 속도와 효소 활성을 보였다. 따라서 본 연구에서는 고정화를 위한 효소로 Candida rugosa lipase를 선정하여 진행하였다
- 실리카 코팅된 자성 나노입자의 구성 성분과 크기는 TEM과 XRD를 통해 분석을 하였다. Fig. 2에 보인 바와 같이 TEM을 통해 5 nm의 자성입자에 실리카가 1 nm의 두께로 코팅되어 직경이 7 nm인 실리카 코팅된 자성 나노입자가 형성되었음을 알 수 있었으며, XRD 분석을 통해 55.1 %의 실리카 성분과 44.9 %의 Fe 성분으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 본 연구에서는 직경이 평균 7 nm의 실리카 코 팅된 자성 나노입자를 효소 고정화 지지체로 사용하 였다
- 4절의 결과로부터 내구성과 안정성이 우수한 실리카 코팅된 자성 나노입자를 지지체로 선정하였으며, 실리카 코팅된 자성 나노입자에 amine group을 부착한 후 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법과 공유 결합법으로 각각 달리하여 효소를 고정화시킬 때 고정화된 효소의 활성을 측정하였다. Fig. 6에 보인 바와 같이 고정화 방법이 다름에도 불구하고 초기 반 응 속도와 최종 활성이 모두 유사하였고, 자유효소의 활성과 비교하였을 때 더 높은 활성을 가짐을 알 수 있었다.
- 실리카 코팅된 자성 나노입자에 amine group을 부착한 후 CLEA 방법과 공유 결합법으로 각각 다르게 효소를 고정화시킬 때 고정화된 효소의 안정성을 비교하였다. Fig. 7에 보인 바와 같이 3회에 걸쳐 재사용하였을 때 CLEA 방법과 공유 결합법으로 각각 달리하여 amine group이 부착된 실리카 코팅된 자성 나노입자에 고정화한 Candida rugosa lipase는 82.31 %, 83.87 %의 활성을 유지하였으며 , 5 회까지 평균 73% 이상의 활성을 유지함을 보였다. 그러나, 5회까지 재사용 후 CLEA 방법으로 고정화한 Candida rugosa lipase는 71.
- 이를 위해 효소 반응 후 반응이 종료된 용액에서 고정화 효소만을 회수하여 활성을 측정하였으며, 이 과정을 5번 반복하여 실험하였다. 그 결과, 3회에 걸쳐 재사용하였을 때 epoxy group과 epoxyamine group을 각각 부착한 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 고정화한 Candida rugosa lipase는 최초 활성 대비 92.82 %, 91.38%, 93.58 %, 92.70 %의 활성을 유지하였으며 , 5회 까지 평균 69% 이상의 활성을 유지함을 보였다. 또한, 실리카 나노입 자와 실리카 코팅된 자성 나노입자로 나누어 내구성 및 안정성을 비교해 보았을 때, 5회까지 재사용 후 실리카 나노입자는 63% 정도의 활성을 유지하는 반면 실리카 코팅된 자성 나노입자는 75 % 정도의 활성을 유지하는 것으로 실리카나노입자보다 실리카 코팅된 자성나노입자가 내구성과 안정성이 우수함을 알 수 있었다.
- 87 %의 활성을 유지하였으며 , 5 회까지 평균 73% 이상의 활성을 유지함을 보였다. 그러나, 5회까지 재사용 후 CLEA 방법으로 고정화한 Candida rugosa lipase는 71.95 %의 활성을 유지하는 반면 공유 결합법 으로 고정화한 Candida rugosa lipase는 보다 높은 76.55 %의 활성을 유지하는 것으로 보아 CLEA 방법보다 공유 결합법 이 고정화된 Candida rugosa lipase의 안정성에 좋은 효과를 보이는 것을 알 수 있다
- 내구성과 안정성이 우수한 실리카 코팅된 자성 나노입자 지지체에 CLEA 방법과 공유결합법으로 각각 다르게 고정화한 효소의 활성을 측정한 결과, CLEA 방법과 공유결합법으로 고정화한 효소가 자유효소보다 높은 활성을 가짐을 보였다. 또한 5회에 걸쳐 재사용하였을 때 공유결합법으로 고정화한 효소의 활성이 CLEA 방법보다 높은 활성을 유지함을 나타내어 CLEA 방법보다는 공유결합법으로 고정화한 효소의 내구성과 안정성이 우수함을 알 수 있다.
- 내구성과 안정성이 우수한 실리카 코팅된 자성 나노입자 지지체에 CLEA 방법과 공유결합법으로 각각 다르게 고정화한 효소의 활성을 측정한 결과, CLEA 방법과 공유결합법으로 고정화한 효소가 자유효소보다 높은 활성을 가짐을 보였다. 또한 5회에 걸쳐 재사용하였을 때 공유결합법으로 고정화한 효소의 활성이 CLEA 방법보다 높은 활성을 유지함을 나타내어 CLEA 방법보다는 공유결합법으로 고정화한 효소의 내구성과 안정성이 우수함을 알 수 있다.
- 실리카 나노입자 및 실리카 코팅된 자성 나노입자에 epoxy group, amine group을 각각 부착시켜 리파아제를 고정화하여 활성을 측정한 결과, 고정화하지 않은 자유효소의 초기반응 속도가 다소 높았으나, 최종 활성은 부착한 작용기 및 지지체 여부와 상관없이 고정화한 효소의 활성이 유사하게 관찰되어 실리카 나 노입자 및 실리카 코팅된 자성 나노입자 지지체에 효소를 고정화하였을 때 효소 본래의 활성에는 영향을 미치지 않고 고정화됨을 알 수 있었다. 또한 내구성과 안정성 측정을 위한 재사용 실험 결과, 3회 재사용하였을 때 최초 활성대비 92% 이상의 활성을 유지하였으며, 5회까지 평균 69% 이상의 활성을 유지함을 보였다. 또한 실리카나노입자 및 실리카 코팅된 자성 나노입자 지지체를 비교해 보았을 때, 실리카 코팅된 자성 나노입자의 내구성과 안정성이 우수함을 알 수 있었다.
- 또한 내구성과 안정성 측정을 위한 재사용 실험 결과, 3회 재사용하였을 때 최초 활성대비 92% 이상의 활성을 유지하였으며, 5회까지 평균 69% 이상의 활성을 유지함을 보였다. 또한 실리카나노입자 및 실리카 코팅된 자성 나노입자 지지체를 비교해 보았을 때, 실리카 코팅된 자성 나노입자의 내구성과 안정성이 우수함을 알 수 있었다.
- 70 %의 활성을 유지하였으며 , 5회 까지 평균 69% 이상의 활성을 유지함을 보였다. 또한, 실리카 나노입 자와 실리카 코팅된 자성 나노입자로 나누어 내구성 및 안정성을 비교해 보았을 때, 5회까지 재사용 후 실리카 나노입자는 63% 정도의 활성을 유지하는 반면 실리카 코팅된 자성 나노입자는 75 % 정도의 활성을 유지하는 것으로 실리카나노입자보다 실리카 코팅된 자성나노입자가 내구성과 안정성이 우수함을 알 수 있었다.
- 실리카 나노입자 및 실리카 코팅된 자성 나노입자에 epoxy group, amine group을 각각 부착시켜 리파아제를 고정화하여 활성을 측정한 결과, 고정화하지 않은 자유효소의 초기반응 속도가 다소 높았으나, 최종 활성은 부착한 작용기 및 지지체 여부와 상관없이 고정화한 효소의 활성이 유사하게 관찰되어 실리카 나 노입자 및 실리카 코팅된 자성 나노입자 지지체에 효소를 고정화하였을 때 효소 본래의 활성에는 영향을 미치지 않고 고정화됨을 알 수 있었다. 또한 내구성과 안정성 측정을 위한 재사용 실험 결과, 3회 재사용하였을 때 최초 활성대비 92% 이상의 활성을 유지하였으며, 5회까지 평균 69% 이상의 활성을 유지함을 보였다.
- 이는 자유효소가 효소 입자들이 고정화한 효소보다 자유롭기 때문에 더 높은 초기 활성을 가지는 것으로 보인다. 하지만 최종 활성은 고정화 여부와 상관없이 비슷함을 보이는데, 이로부터 실리카 나노입자나 실리카 코팅된 자성 나노입자를 지지체로 이용한 고정화 방법이 효소 활성에 나쁜 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.