[논문]Hep3B 간암세포에서 개똥쑥추출물로부터 Akt-mTOR-GSK3β 신호경로에 의한 apoptosis 효과

김은지; 김근태; 김보민; 임은경; 하성호; 김상용; 김영민

doi:10.5352/jls.2016.26.7.764

Hep3B 간암세포에서 개똥쑥추출물로부터 Akt-mTOR-GSK3β 신호경로에 의한 apoptosis 효과
Apoptotic Effect of Extract from Artemisia annua Linné by Akt/mTOR/GSK-3β Signal Pathway in Hep3B Human Hepatoma Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.26 no.7 = no.195, 2016년, pp.764 - 771

김은지 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 김근태 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 김보민 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 임은경 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과) , 하성호 (한남대학교 생명나노과학대학 화학공학과) , 김상용 (신안산대학교 식품생명과학과) , 김영민 (한남대학교 생명나노과학대학 생명시스템과학과)

초록
AI-Helper

개똥쑥 추출물은 항박테리아, 항바이러스 그리고 항산화효과를 포함한 다양한 기능을 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, 개똥쑥 항증식 작용기전은 알려지지 않았다. 따라서, 우리는 Hep3B 간암 세포에서 AAE추출물의 apoptotic 효과를 알아보고자 한다. 본 연구의 목적은 AAE가 인체 간암 세포주(Hep3B)의 증식에 미치는 효과를 분석하고 이에 대한 apoptosis의 효과를 조사하는데 있다. 인산화에 의해 활성화된 Akt는 TSC2, mTOR 그리고 GSK-3β의 인산화를 유도하여 세포증식을 유도한다. 본 연구에서, 우리는 AAE가Akt-mTOR-GSK3β 신호 경로와 mitochondria를 매개하는 apoptotic 단백질을 통한 암세포의 apoptosis 유도할 것이라고 추측하였다. 이를 위해, 먼저 AAE가 처리농도에 따라 세포증식에 미치는 효과를 분석하였다. AAE처리는 세포증식을 억제시켰을 뿐만 아니라 젖산 탈수소 효소의 방출을 유도하였다. 이러한 결과는 MTT assay, LDH assay로 확인하였다. 또한 Hoechst 33342 staining, Annexin Ⅴ- PI staining, JC-1 staining 그리고 Western blotting을 통해 apoptosis 효과를 확인하였다. 본 연구에서는 간암세포에 AAE의 처리가 Akt, TSC2, GSK-3β-phosphorylated, Bim, Bcl-2, pro-caspase 3의 억제와 Bak, Bax 활성을 유도한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 AAE가 Akt-mTOR-GSK-3β 신호 경로를 통해 intrinsic apoptosis를 유도한다는 것을 나타낸다.

Abstract ▼ AI-Helper

Extracts from Artemisia annua Linné (AAE) have been known to possess various functions, including anti-bacterial, anti-virus, and anti-oxidant effects. However, the mechanism of those effects of AAE is not well-known. The aim of this study was to analyze the inhibitory effects of AAE on cell proliferation of the human hepatoma cell line (Hep3B) and to examine its effects on apoptosis. Activation by phosphorylation of Akt is cell proliferation through the phosphorylation of TSC2, mTOR, and GSK-3β. We suggested that AAE may exert cancer cell apoptosis through Akt/mTOR/GSK-3β signal pathways and mitochondria-mediated apoptotic proteins. For this, we examined the effects of extracts of AAE on cell proliferation according to treatment concentration. Treatment with AAE not only reduced cell viability, but also resulted in the induced release of lactate dehydrogenase (LDH). These results were determined with a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and a lactate dehydrogenase (LDH) assay. Furthermore, we determined the effects of apoptosis through Hoechst 33342 staining, annexinⅤ-propidium iodide (PI) staining, 5,5′, 6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1) staining, and Western blotting. Our study showed that the treatment of liver cancer cells with AAE resulted in the inhibition of Akt, TSC2, GSK-3β-phosphorylated, Bcl-2, and pro-caspase 3 and the activation of Bim, Bax, Bak, and cleaved PARP expressions. These results indicate that AAE induced apoptosis by means of a mitochondrial event through the regulate of Akt/mTOR/GSK-3β signaling pathways.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

따라서, 본 연구에서는 개똥쑥 추출물(AAE)의 항암 활성기전을 확인하기 위해 AAE처리를 통한 Hep3B 인체 간암세포의 증식 억제가 apoptosis유도에 의한 것인지 알아보고자 하였다. 또한, AAE 농도 증가에 따른 apoptosis 관련 단백질의발현 변화를 확인하였다.

제안 방법

12 well plate에 Hep3B cell 를 1×10⁵cells/ml로 분주하고 37℃, 5% CO₂가 공급되는 조건에서 24시간 동안 안정화시킨후 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하였다. 그 후 24시간 배양한 세포를 Hoechst 33342를 0.
추출한 단백질은 ELISA-reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 만들어놓은 sample을 loading한뒤 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer 하였고, 다음에 2% Bovine serum albumin (BSA)을 이용해 blocking 한 후, 1차항체를 4℃에서 밤새 반응시키고 TBST로 5분씩 4번 washing후 2차항체를 결합시킨 다음 실험결과를측정하였다.
Annexin V-PI staining을 위해, Hep3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음, 1×10⁶cells/ml 의농도에서 binding buffer로 suspension하였다.
Apoptosis는 FITC-Annexin V apoptosis detection kit (BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. Annexin V-PI staining을 위해, Hep3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하였다.
이러한 apoptosis가 instrinsic path- way에 의한 것인지 알아보기 위해 mitochondria membrane potential변화를 확인하고, 이와 관련된 단백질의 발현 변화를확인하였다. Mitochondria membrane potential을 조절하는상위조절자인 p-Akt, p-mTOR, p-TSC₂, p-GSK-3β 신호분자조절의 연관성을 알아보기 위하여 LY294002, Rapamycin, 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO)를 각각 단독으로 처리하였다.
apoptosis시 세포막의 손상으로 발생되는 LDH의 양을 측정하는 LDH cytotoxicity assay kit (Thermo Scientific, USA) 를 사용하여 세포 독성을 확인하였다. 배양된 Hep3B cell을 12 well plate에 1×10⁵cells/ml로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후 AAE와 LY294002, Rapamycin, BIO를 24시간과 48 시간 동안 처리하여 CO₂incubator에서 배양하였다.
개똥쑥추출물(AAE)이 Hep3B 간암 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 AAE를 농도별(10, 20, 30, 40, 60, 80 μg/ ml)로 처리한 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 증식률을 조사하였다. 그 결과 AAE를 12시간, 24시간, 48시간 동안 처리하였을 때 농도 및 시간 의존적으로 세포 증식이 억제되는 것을확인하였다(Fig.
24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음, 1×10⁶cells/ml 의농도에서 binding buffer로 suspension하였다. 그 후 Hep 3B cell을 Annexin V-FITC와 prodipium iodide (PI)로 15분간 염색한 후, Flow cytometry - FACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하여 결과를 관찰하였다.
5% formalin을 처리하여 20분간 고정 시켰다. 그 후, PBS로 세척하여 sample을 제작하여 형광 현미경(DAPI)에서 관찰하였다.
또한, AAE 농도 증가에 따른 apoptosis 관련 단백질의발현 변화를 확인하였다. 이러한 apoptosis가 instrinsic path- way에 의한 것인지 알아보기 위해 mitochondria membrane potential변화를 확인하고, 이와 관련된 단백질의 발현 변화를확인하였다.
1B). 또한, 구체적인 독성 수준 파악을 위해세포가 사멸할 때 미토콘드리아 세포막이 파괴되면서 방출되는 물질인 lactate dehydrogenase방출량을 측정하는 LDH as- say를 실시하였다. AAE를 Hep3B cell에 MTT assay와 같은농도로 처리하여 24시간과 48시간에서 LDH 방출량을 측정한결과, 농도 의존적으로 LDH 방출량이 증가함을 확인할 수 있으며(Fig.
JC-1 assay를 통해 AAE가 미토콘드리아 막 전위의탈분극을 유도함 확인하였다. 미토콘드리아 막 전위가 탈분극화되면 Cytochrome C 유리에 의해 caspase가 활성화되어 apoptosis를 유도하게 되는데, 본 실험에서 AAE를 처리하였을 때 caspase 활성을 확인하기 위해 caspase -3/7 activity as- say를 실시하였다. Fig.
배양된 Hep3B cell을 12 well plate에 1×10⁵cells/ml로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후 AAE와 LY294002, Rapamycin, BIO를 24시간과 48 시간 동안 처리하여 CO₂incubator에서 배양하였다. 상등액 100 μl와 LDH reagent 100 μl를 혼합하여 30분간 암조건에서반응 시킨 다음 stop solution으로 1N HCl 50 μl를 가한 후 490 nm와 595 nm에서 흡광도를 측정하여 LDH방출량을 비교하였다.
세포의 caspase activity 변화 정도를 측정하기 위하여 Hep3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은다음 50 μl의 1X assay buffer BA로 세포를 풀어준 뒤 caspase 3/7 Reagent waking solution을 5 μl 처리하여 37℃, 5% CO₂ 에 30분 동안 반응 시켰다.
암세포의 MMP 변화 정도를 측정하기 위하여 Hep3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하였다. 24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음 10 μM의 5, 5‘, 6, 6’-tetrachloro-1, 1‘, 3, 3’-tetraethyl-imidacarbocyanine io- dide (JC-1, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다.
또한, AAE 농도 증가에 따른 apoptosis 관련 단백질의발현 변화를 확인하였다. 이러한 apoptosis가 instrinsic path- way에 의한 것인지 알아보기 위해 mitochondria membrane potential변화를 확인하고, 이와 관련된 단백질의 발현 변화를확인하였다. Mitochondria membrane potential을 조절하는상위조절자인 p-Akt, p-mTOR, p-TSC₂, p-GSK-3β 신호분자조절의 연관성을 알아보기 위하여 LY294002, Rapamycin, 6-Bromoindirubin-3'-oxime (BIO)를 각각 단독으로 처리하였다.
이러한 세포 손상에 의한 세포증식 억제 효과가 apoptosis 에 의한 것인지 알아보기 위해 Fig. 2에서 나타낸 바와 같이 Hep3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 후 Annexin Ⅴ-PI staining을 통한 FACS 분석과 Hoechst 3342 (10 mM) staining을 실행하였다. Annexin Ⅴ-PI staining결과 AAE를 처리하였을 때 농도 의존적으로 apopto- sis가 유도됨을 확인하였다.
24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음 10 μM의 5, 5‘, 6, 6’-tetrachloro-1, 1‘, 3, 3’-tetraethyl-imidacarbocyanine io- dide (JC-1, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 20분 동안 상온에서 반응시켰다. 이렇게 준비된 세포를 Flow cytometry - FACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하여 결과를 관찰하였다.
24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은다음 50 μl의 1X assay buffer BA로 세포를 풀어준 뒤 caspase 3/7 Reagent waking solution을 5 μl 처리하여 37℃, 5% CO₂ 에 30분 동안 반응 시켰다. 준비 된 sample에 caspase 7-AAD waking solution을 150 μl 처리하여 5분 동안 상온에서 반응시킨 뒤 Muse automated cell analyzer (Merck Millipore)로분석하여 결과를 관찰하였다.

대상 데이터

Hep3B세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Laboratoris Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics가 포함된RPMI media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였다. 매 48시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Labor- atories Inc.
각 농도별 개똥쑥 추출물은 상기 추출물을 동일 용량의 Dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 만들었으며, -20℃에서 냉동 보관하여 사용하였다. LY 294002와 Rapamycin, BIO는 Calbiochem (Calbiochem, SD, CA, USA)에서 구입하여 20 mM으로 만들어 사용하였다.
실험에 사용된 개똥쑥은 대전 한약재시장에서 구입 하였고, 개똥쑥 100 g에 95% 에탄올 800 ml을 가하여 48시간 동안 상온에서 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 개똥쑥 추출물을 감압농축기를 이용하여 감압 농축시킨 뒤, 농축된 추출물은 -20℃에서 보관하였다.

데이터처리

(B) is Fibroblast cell line. The statistical analysis of the data was carried out by use of an ANOVA-test. ^a~cp<0.
(B) LDH assay was performed for assessing cell deaths. The statistical analysis of the data was carried out by use of an T-test. *p<0.
IL, USA)의 Student's t-test로 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.05인 경우 통계적으로 유의 하다고 판정하였다.
실험설계에 대한 분석은 통계 프로그램인 SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA)의 Student's t-test로 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.
Tokyo, Japan)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 각 농도 별로 세 번 시행하였으며, 이에 따른 평균값과 표준오차는 Microsoft Excel program을 사용하여 분석하였다.

이론/모형

1. (A, B) Cell viability was measured by MTT assay. (A) is Hep3B cell line.
3B, D). JC-1 assay를 통해 AAE가 미토콘드리아 막 전위의탈분극을 유도함 확인하였다. 미토콘드리아 막 전위가 탈분극화되면 Cytochrome C 유리에 의해 caspase가 활성화되어 apoptosis를 유도하게 되는데, 본 실험에서 AAE를 처리하였을 때 caspase 활성을 확인하기 위해 caspase -3/7 activity as- say를 실시하였다.
Caspase는 initiator caspase인 caspase-8 및 -9와 effector cas- pase인 caspase-3, -6 및 -7으로 나뉘는데, initiator caspase가 활성화 되면 하위 단계에 있는 effector caspase를 활성화 시킴으로써 세포의 apoptosis를 유발한다[7]. 본 실험에서는 Hep 3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하여 apop- tosis 조절 단백질들의 양상을 알아보기 위해 Western blotting 을 실시하였다. Fig.
본 실험에서는 LY294002와 Rapamycin, BIO를 Hep3B cell 에 각각 처리하였을 때, 세포증식에 미치는 영향과 신호 단백질의 발현 양상을 알아보기 위해 MTT assay, LDH assay, Western blotting을 실시하였다. 그 결과, Fig.
세포질로 유출시킨다[3, 25]. 이와 같이 AAE에 의한 apop- tosis 기전을 확인하기 위해 mitochondrial membrane depola- rization assay(JC-1)를 실시하였다. AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 24시간 동안 처리 결과, 30 μg/ml에서 10.

성능/효과

또한, 구체적인 독성 수준 파악을 위해세포가 사멸할 때 미토콘드리아 세포막이 파괴되면서 방출되는 물질인 lactate dehydrogenase방출량을 측정하는 LDH as- say를 실시하였다. AAE를 Hep3B cell에 MTT assay와 같은농도로 처리하여 24시간과 48시간에서 LDH 방출량을 측정한결과, 농도 의존적으로 LDH 방출량이 증가함을 확인할 수 있으며(Fig. 1C). 이러한 결과로 AAE에 의한 세포 증식 억제가세포 손상에 의한 것임을 알 수 있다.
이와 같이 AAE에 의한 apop- tosis 기전을 확인하기 위해 mitochondrial membrane depola- rization assay(JC-1)를 실시하였다. AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 24시간 동안 처리 결과, 30 μg/ml에서 10.3%, 40 μg/ml에서 26.7%, 60 μg/ml에서 84.7%의 결과를 보였다(Fig. 3B, D). JC-1 assay를 통해 AAE가 미토콘드리아 막 전위의탈분극을 유도함 확인하였다.
2에서 나타낸 바와 같이 Hep3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 후 Annexin Ⅴ-PI staining을 통한 FACS 분석과 Hoechst 3342 (10 mM) staining을 실행하였다. Annexin Ⅴ-PI staining결과 AAE를 처리하였을 때 농도 의존적으로 apopto- sis가 유도됨을 확인하였다. Hoechst 3342 (10 mM) staining에서는 아무것도 처리하지 않은 Hep3B cell의 핵이 타원형의온전한 핵 모양을 나타냈지만, AAE를 농도별로 처리하였을때 세포의 핵이 응축과 분절로 인한 세포 사멸체가 핵 주변에나타나는 전형적인 apoptosis의 특징을 나타내었다(Fig.
반면에 BIO를 처리한 군에서는 세포 생장에 관여하는 신호 단백질인 p-mTOR, p-TSC₂, p-Akt, p-GSK-3β의 발현 양이아무것도 처리하지 않은 군과 같았고, 이로 인해 anti-apop- totic 단백질인 Bcl-2가 발현됨으로써 pro-apoptotic 단백질인 Bim과 Bax. Bak 그리고 cleaved PARP의 발현을 감소시켜 세포 생장 신호경로를 조절한 다는 것을 확인하였다.
3C와 같이 AAE, LY294002, Rapamycin을 처리한 군에서 Bcl-2의 발현이 억제됨으로써 Bim과 Bax. Bak 그리고 cleaved PARP의 발현을 증가시키는 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 반면에 BIO를 처리한 군에서는 세포 생장에 관여하는 신호 단백질인 p-mTOR, p-TSC₂, p-Akt, p-GSK-3β의 발현 양이아무것도 처리하지 않은 군과 같았고, 이로 인해 anti-apop- totic 단백질인 Bcl-2가 발현됨으로써 pro-apoptotic 단백질인 Bim과 Bax.
본 실험에서는 Hep 3B cell에 AAE를 농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 처리하여 apop- tosis 조절 단백질들의 양상을 알아보기 위해 Western blotting 을 실시하였다. Fig. 3A에서 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 세포 생장에 관여하는 신호 단백질인 p-mTOR, p-TSC₂, p-Akt, p-GSK-3β의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 이로 인해 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 활성이 억제됨으로써 pro-apoptotic 단백질인 Bim과 Bax, Bak의 발현이 증가하는 일련의 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, caspase의 비활성화 상태인 procaspase-3의 발현양이 감소 하는 것을 확인하였고, apoptosis시 활성화된 caspase에 의한 cleaved PARP의 발현양이 AAE 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.
미토콘드리아 막 전위가 탈분극화되면 Cytochrome C 유리에 의해 caspase가 활성화되어 apoptosis를 유도하게 되는데, 본 실험에서 AAE를 처리하였을 때 caspase 활성을 확인하기 위해 caspase -3/7 activity as- say를 실시하였다. Fig. 3C, E에서 나타낸 바와 같이 AAE를농도별(30, 40, 60 μg/ml)로 24시간 동안 처리 결과, 30 μg/ml 에서 36.60%, 40 μg/ml에서 45.15%, 60 μg/ml에서 69.65%의결과를 보였다. 이러한 결과를 통하여 AAE가 Hep3B cell에서 intrinsic pathway를 통하여 apoptosis를 유도한다는 것을 확인하였다.
MTT assay와 LDH assay를 통해 Hep3B cell의 증식 억제에 있어서 AAE가 농도 및 시간 의존적으로 작용함을 관찰하였다. 이러한 세포 손상에 의한 세포증식 억제 효과가 apoptosis 에 의한 것인지 알아보기 위해 Fig.
그 결과 AAE를 12시간, 24시간, 48시간 동안 처리하였을 때 농도 및 시간 의존적으로 세포 증식이 억제되는 것을확인하였다(Fig. 1A). 정상세포인 섬유아세포(Fibroblast cell) 에 대한 AAE의 세포 독성을 측정한 결과 AAE를 위와 동일한농도로 24시간 동안 처리하였을 때 섬유아세포의 증식률이 90% 이상으로 유지되는 것으로 보아 AAE의 독성이 없음을확인하였다(Fig.
blotting을 실시하였다. 그 결과, Fig. 4A에 나타난 바와 같이 MTT assay에서 AAE와 LY294002, Rapamycin에서는 세포 증식이 억제됨을 확인한 반면 BIO를 처리한 군에서는아무것도 처리 하지 않은 control군과 유사한 세포 생장률을확인하였다. 또한, Fig.
4A에 나타난 바와 같이 MTT assay에서 AAE와 LY294002, Rapamycin에서는 세포 증식이 억제됨을 확인한 반면 BIO를 처리한 군에서는아무것도 처리 하지 않은 control군과 유사한 세포 생장률을확인하였다. 또한, Fig. 4B에서는 LDH assay에서 AAE 처리군에서는 33.4%, LY294002를 처리한 군에서는 15.4%, Rapa- mycin을 처리한 군에서는 14.5%로 LDH 방출량이 증가되는것을 확인한 반면, BIO를 처리한 군에서는 10.4%로 아무것도처리하지 않은 control군과 비슷한 정도의 양을 나타남을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 Akt와 mTOR를 저해했을 때암세포 증식을 억제 시킨다는 것을 확인하였으며, 반면, BIO 처리로 인해 GSK-3β의 인산화가 이루어지지 않아 GSk-3β는억제되며, 억제된 GSk-3β는 세포 자가 사멸에 영향을 주지않고 세포 증식을 유도하는 것을 확인하였다.
3A에서 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 세포 생장에 관여하는 신호 단백질인 p-mTOR, p-TSC₂, p-Akt, p-GSK-3β의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 이로 인해 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 활성이 억제됨으로써 pro-apoptotic 단백질인 Bim과 Bax, Bak의 발현이 증가하는 일련의 신호경로를 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, caspase의 비활성화 상태인 procaspase-3의 발현양이 감소 하는 것을 확인하였고, apoptosis시 활성화된 caspase에 의한 cleaved PARP의 발현양이 AAE 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.
4%로 아무것도처리하지 않은 control군과 비슷한 정도의 양을 나타남을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 Akt와 mTOR를 저해했을 때암세포 증식을 억제 시킨다는 것을 확인하였으며, 반면, BIO 처리로 인해 GSK-3β의 인산화가 이루어지지 않아 GSk-3β는억제되며, 억제된 GSk-3β는 세포 자가 사멸에 영향을 주지않고 세포 증식을 유도하는 것을 확인하였다. 이와 같은 조건으로 Western blotting을 실시한 결과, Fig.
65%의결과를 보였다. 이러한 결과를 통하여 AAE가 Hep3B cell에서 intrinsic pathway를 통하여 apoptosis를 유도한다는 것을 확인하였다.
2B). 이를 통해 AAE의 처리에 따른 Hep3B cell의 증식억제 효과는 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하였다.
이상의 결과를 종합해보면, Hep3B cell에서 개똥쑥 추출물인 AAE를 처리하였을 경우 유발되는 apoptosis는 Akt/ mTOR/GSK-3β 경로 활성을 통한 Bcl-2의 발현 감소에 동반된 mitochondria의 기능 이상으로 Bim, Bax, Bak을 활성화시켜세포질로의 cytochrome C의 유리에 따른 caspase의 활성으로이루어진다는 것을 알 수 있었다. 즉, AAE 처리에 의해 유도되는 apoptosis는 Akt/mTOR/GSK-3β 경로를 통한 intrinsic pathway에 의하여 조절되는 것을 알 수 있다.
1A). 정상세포인 섬유아세포(Fibroblast cell) 에 대한 AAE의 세포 독성을 측정한 결과 AAE를 위와 동일한농도로 24시간 동안 처리하였을 때 섬유아세포의 증식률이 90% 이상으로 유지되는 것으로 보아 AAE의 독성이 없음을확인하였다(Fig. 1B). 또한, 구체적인 독성 수준 파악을 위해세포가 사멸할 때 미토콘드리아 세포막이 파괴되면서 방출되는 물질인 lactate dehydrogenase방출량을 측정하는 LDH as- say를 실시하였다.

참고문헌 (28)

Adams, J. M. and Cory, S. 2007. The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy. Oncogene26, 1324-1337.

상세보기
Avery, M. A., Chong, W. K. M. and Jennings, W. C. 1992. Stereoselective total synthesis of (dextro)-artemisinin, the antimalarial constituent of Artemisia annua L. J. Am. Chem. Soc. 114, 974-979.

상세보기
Baek, I. S., Im, L. H., Park, C. and Choi, Y. H. 2015. Anti-cancer Potentials of Rhus verniciflua Stokes, Ulmus davidiana var. japonica Nakai and Arsenium sublimatum in human gastric cancer AGS cells. J. Life Sci. 25, 849-860.

원문보기 상세보기
Cantrell, D. A. 2001. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathways. J. Cell Sci. 114, 1439-1445
Chung, U. J., Park, C., Jeong, Y. K. and Choi, Y. H. 2011. Apoptosis induction by methanol extract of Prunus mume fruits in human Leukemia U937 Cells. J. Life Sci. 21, 1109-1119.

원문보기 상세보기
Doble, B. W. and Woodgett, J. R. 2003. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. J. Cell Sci. 116, 1175-86.

상세보기
Fiandalo, M.V. and Kyprianous, N. 2012. Caspase control:protagonists of cancer cell apoptosis. Exp. Oncol. 34, 165-175.
Fulda, S.and Debatin, K. M. 2006. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy. Oncogene 25, 4798-4811.

상세보기
Hacker, G.and Weber, A. 2007. BH3-only proteins trigger cytochrome c release, but how? Arch. Biochem. Biophys. 462, 150-155.

상세보기
Holcik, M., Gibson, H. and Korneluk, R. G. 2001. IAP:apoptotic brake and promising therapeutic target. Apoptosis 6, 253-261.

상세보기
Hyun, J. H., Kim, E., Kang, J. I., Kim, S. C., Yoo, E. S. and Kang, H. K., 2008. Apoptosis induction of HL-60 Leukemia cells by extract of Crinum asiaticum. Yakhak Hoeji 52, 1-6.
Jeong, J. W., Baek, J. Y., Kim, K. D., Choi, Y. H. and Lee, J. D., 2015. Induction of apoptosis by pachymic acid in T24 human bladder cancer cells. J. Life Sci. 25, 93-100.

원문보기 상세보기
Kim, E. J., Park, H., Lim, S. S., Kim, J. S., Shin, H. K. and Yoon, J. H. 2008. Effect of the hexane extract of Saussurea lappa on the growth of HT-29 human colon cancer cells. Kor. J. Food Sci. Technol. 40, 207-214.
Kirschenbaum, F., Hsu, S. C., Cordell, B. and McCarthy, J. V. 2001. Glycogen synthase kinase 3-beta regulates presenilin 1 cterminal fragment levels. J. Biol. Chem. 276, 30701-30707.

상세보기
Labi, V., Erlacher, M., Kiessling, S. and Villunger, A. 2006. BH3-only proteins in cell death initiation, malignant disease and anticancer therapy. Cell Death Differ 13, 1325-1338.

상세보기
Leevers, S. J., Vanhaesebroeck, B. and Waterfield, M. D. 1999. Signaling through phosphoinositide 3-kinases: the lipids take center stage. Curr. Opin. Cell Biol. 11, 219-225

상세보기
Mikami, I., Zhang, F., Hirata, T., Okamoto, J., Koizumi, K., Shimizu, K., Jablons, D. and He, B. 2010. Inhibition of activated phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in malignant pleural mesothelioma leads to G1 cell cycle arrest. Oncol. Rep. 24, 1677-1681.
Moon, J. Y., Nguyen, L. T. T., Hyun, H. B., Osman, A., Cho, M. H., Han, S., Lee, D. S. and Ahn, K. S. 2015. Anticancer activities of the methanolic extract from lemon leaves in human breast cancer stem cells. J. Appl. Biol. Chem. 58, 219-226.

원문보기 상세보기
Majchrzak, A., Witkowska, M. and Smolewski, P. 2014. Inhibition of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in diffuse Large B-cell lymphoma: current knowledge and clinical significance. Molecules 19, 14304-14315.

상세보기
Reed, J. C. 2006. Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins: mechanisms, physiological roles, and therapeutic opportunities. Cell Death and Differentiation 13, 1378-1386.

상세보기
Romero, M. R., Serrano, M. A., Vallejo, M., Efferth, T., Alvarez, M. and Marin, J. J. 2006. Antiviral effect of artemisinin from Artemisia annua against a model member of the Flaviviridae family, the bovine viral diarrhoea virus (BVDV). Planta. Med. 72, 1169-1174.

상세보기
Roymans, D. and Slegers, H. 2001. Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. Eur. J. Biochem. 268, 487-498

상세보기
Ryu, J. H., Lee, S. J., Kim, M.J., Shin, J. H., Kang, S. K., Cho, K. M. and Sung, A. J. 2011. Antioxidant and Anticancer Activities of Artemisia annua L. and Determination of Functional Compounds. J. Kor. Soc. Food. Sci. Nutr. 40, 509-516.

원문보기 상세보기
Schmid, G. and Hofheinz, W. 1983. Total synthesis of qinghaosu. J. Am. Chem. Soc. 105, 624-625

상세보기
Susan, E. 2007. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicol. Pathol. 35, 495-516
Vanhaesebroeck, B. and Waterfield, M. D.1999 Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases. Exp. Cell Res. 253, 239-254.

상세보기
Yun, H. J., Hwang, S. G., Yun, H. J., Kim, C. H., Seo, G. S., Park, W. H. and Park, S. D. 2006. Anticancer effect of Rheum rhizoma on human liver cancer HepG2 cells. Kor. J. Herbology 4, 27-36.
Zinkel, S., Gross, A. and Yang, E. 2006. Bcl-2 family in DNA damage and cell cycle control. Cell Death. Differ. 13, 1351-1359.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증