대황과 감초 병용의 항산화 및 간보호효과 Effect of Rheum undulatum Linne extract and Glycyrriza uralensis Fischer extract against arachidonic acid and iron-induced oxidative stress in HepG2 cell and CCl4-induced liver injury in mice원문보기
Objectives : Rheum undulatum Linne and Glycyrriza uralensis Fischer are widely used herbal medicine. In this study, anti-oxidant and liver protective effects of R. undunlatum extract (RUE) and G. uralensis extract (GUE) were investigated in HepG2 cells, respectively. Oxidative stress and liver fibro...
Objectives : Rheum undulatum Linne and Glycyrriza uralensis Fischer are widely used herbal medicine. In this study, anti-oxidant and liver protective effects of R. undunlatum extract (RUE) and G. uralensis extract (GUE) were investigated in HepG2 cells, respectively. Oxidative stress and liver fibrosis were induced by arachidonic acid (AA) and iron, and CCl4.Methods : MTT assay was assessed for cell viability, and immunoblotting analysis was performed to detect expression of apoptosis related proteins. In addition, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial dysfunction were measured. In vivo, BALB/c mouse were orally administrated with the aqueous extract of 10 mg/kg RUE and 100 mg/kg GUE for 3 days and then, injected with CCl4 0.5 ml/kg body weight to induce acute liver damage. Serum ALT level was measured, and histological change was observed in Harris's hematoxylin and eosin stainResults : RUE and GUE pre-treatment increased relative cell viability in concentration dependent manner and altered the expression levels of apoptosis-related proteins such as procaspase 3, PARP and Bcl-xL. RUE and GUE also inhibited the mitochondrial dysfunction and excessive reactive oxygen species (ROS) production induced by AA and iron. In addition, RUE and GUE activated liver kinase B1 (LKB1), by increasing phosphorylation. Moreover, RUE and GUE treatment decreased liver injuries induced by CCl4, as evidenced by decreases in histological liver damage as well as serum alanine amino transferase (ALT) level.Conclusions : These data suggest that RUE and GUE has anti-oxidant and liver protective effects against AA and iron-induced oxidative stress and CCl4-induced liver injury.
Objectives : Rheum undulatum Linne and Glycyrriza uralensis Fischer are widely used herbal medicine. In this study, anti-oxidant and liver protective effects of R. undunlatum extract (RUE) and G. uralensis extract (GUE) were investigated in HepG2 cells, respectively. Oxidative stress and liver fibrosis were induced by arachidonic acid (AA) and iron, and CCl4.Methods : MTT assay was assessed for cell viability, and immunoblotting analysis was performed to detect expression of apoptosis related proteins. In addition, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial dysfunction were measured. In vivo, BALB/c mouse were orally administrated with the aqueous extract of 10 mg/kg RUE and 100 mg/kg GUE for 3 days and then, injected with CCl4 0.5 ml/kg body weight to induce acute liver damage. Serum ALT level was measured, and histological change was observed in Harris's hematoxylin and eosin stainResults : RUE and GUE pre-treatment increased relative cell viability in concentration dependent manner and altered the expression levels of apoptosis-related proteins such as procaspase 3, PARP and Bcl-xL. RUE and GUE also inhibited the mitochondrial dysfunction and excessive reactive oxygen species (ROS) production induced by AA and iron. In addition, RUE and GUE activated liver kinase B1 (LKB1), by increasing phosphorylation. Moreover, RUE and GUE treatment decreased liver injuries induced by CCl4, as evidenced by decreases in histological liver damage as well as serum alanine amino transferase (ALT) level.Conclusions : These data suggest that RUE and GUE has anti-oxidant and liver protective effects against AA and iron-induced oxidative stress and CCl4-induced liver injury.
undulatum extract, RUE)과 감초 추출물(G. uralensis extract, GUE) 병용처치의 간보호 효능을 AA와 iron의 병용처치를 통해 산화적 스트레스를 유발하는 HepG2 세포 독성 모델과 사염화탄소(carbon tetrachloride, CCl4)에 의해 간독성이 유발된 간경화 동물모델을 활용하여 확인하므로 급∙만성 간질환 치료의 후보소재 개발을 위한 가능성을 규명하고자 하였다.
아직까지 산화적 스트레스에 의해 유도된 간손상에 미치는 대황과 감초의 병용 효과에 대해 보고 된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 대황과 감초의 병용 처치가 HepG2세포에서 AA와 iron에 의해 유도된 산화적 스트레스와 CCl4에 의해 유도된 간경변 모델 실험동물에 미치는 영향을 규명하였다.
제안 방법
그러므로 RUE와 GUE가 LKB1의 활성화를 통한 간세포 보호 효능이 있을 것으로 여겨진다. HepG2 세포에서 RUE와 GUE의 산화적 스트레스에 의한 효능을 토대로 CCl4에 의해 유도된 간경변 마우스 모델에서 RUE와 GUE의 효능을 실험하였다. In vivo 모델에서 사용된 대표적인 간독성 유발물질인 CCl4는 체내에서 산소와 반응해 간독성을 일으키는 CCl3을 만들며, 이들은 세포막의 인지질을 공격하여 지질의 과산화를 유발한다.
본 연구에서는 AA와 iron에 의해 산화적 스트레스가 유도된 HepG2 세포를 활용한 in vitro 모델과 CCl4에 의해 급성 간손상이 유발된 마우스의 in vivo 모델에서 활성산소종에 의한 간독성에 대한 RUE와 GUE의 항산화 및 간보호 효과를 평가하였다. In vitro 모델에서는 MTT assay를 통하여 세포 보호효과 및 immunoblotting analysis로 세포자멸사 단백질 발현을 관찰함으로써 세포자멸사 억제 효능을 확인하였다. 또한, 유세포 분석을 실시하여 미토콘드리아 보호효과를 입증하였고 HepG2 세포, AML12 세포, SKHep1 세포 세 종류의 간세포주에서 LKB1의 인산화를 확인하였다.
실험군은 대조군, 10 mg/kg RUE와 100 mg/kg GUE 투여군, CCl4 투여군, RUE 및 CCl4 투여군, GUE 및 CCl4 투여군, RUE와 GUE 및 CCl4 투여군으로 분류하였다. RUE와 GUE를 1일 1회, 3일간 경구투여하였고, 마지막 투여 2시간 후, CCl4를 체중 1kg당 0.5ml씩 복강주사하였다. 대조군과 CCl4 투여군에는 전 실험기간 동안 동일량의 생리식염수를 경구투여하였다.
LKB1은 AMPK upstream kinase 중 하나로 에너지 대사 조절 인자인 AMPK의 활성화를 촉진시키며, 간에서는 LKB1의 아세틸화가 LKB1의 세포 내 위치와 활성에 관여하는 것으로 나타났다34). 따라서, immunoblotting analysis를 통해 간세포주인 HepG2 세포, AML12 세포, SKHep1 세포에서 RUE와 GUE가 LKB1의 활성화에 미치는 영향을 알아보았다. HepG2 세포에서는 1시간, AML12 세포와 SKHep1 세포에 10분에서 LKB1의 활성화를 보였다.
본 연구에서는 AA와 iron에 의해 산화적 스트레스가 유도된 HepG2 세포를 활용한 in vitro 모델과 CCl4에 의해 급성 간손상이 유발된 마우스의 in vivo 모델에서 활성산소종에 의한 간독성에 대한 RUE와 GUE의 항산화 및 간보호 효과를 평가하였다. In vitro 모델에서는 MTT assay를 통하여 세포 보호효과 및 immunoblotting analysis로 세포자멸사 단백질 발현을 관찰함으로써 세포자멸사 억제 효능을 확인하였다.
대상 데이터
대황 200g과 감초 200g은 Daewon pharmacy(Daegu, Korea)에서 구매하여 열수추출 후 필터하여 동결건조 하였다. 대황의 회수율은 11.
인간 간암세포주인 HepG2 세포, SKHep1 세포 및 마우스 간세포주인 AML12 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였고 세포는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% Normocin (InvivoGen, San Diego, CA, USA)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) (Welgene, Daegu, Korea)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포는 12시간 동안 FBS 고갈한 후, RUE와 GUE를 각 실험별 제시된 농도로 1시간 전 처치한 후 30 μM AA를 12시간 처치하고 5 μM iron을 첨가하여 2시간 추가 배양하였다.
체중 18g 정도의 5주령 BALB/c 마우스를 (주)오리엔트 바이오사 (Seong Nam, Korea)로부터 구매하여 7일간 예비 사육하여 환경에 적응 시킨 후 실험에 사용하였다. 실험기간 동안 물과 사료(Lab Diet 5L79, Lab Diet, USA)의 양은 제한 없이 공급하였고 온도 25℃, 습도 50~55%에서 12 시간씩 명암주기를 조절하여 사육하였다.
이론/모형
HepG2 세포에서 AA와 iron에 의해 유도된 세포자멸사에서 RUE (3, 10, 30 μg/ml)와 GUE (10, 30, 100 μg/ml)의 효과적인 농도 선정을 위해 MTT assay를 실시하였다. 그 결과, RUE 10 μg/ml 단독 처리군 보다 10 μg/ml RUE와 100 μg/ml GUE의 병용 처치에서 효과적인 세포 보호 효과를 보였다(Figure 1A).
대황 및 감초에 의한 세포 생존율을 알아보기 위해 MTT assay를 실시하였다. HepG2 세포를 48-well plate에 각 well당 1x105개씩 분주한 뒤 80-90%의 confluency로 배양하여 실험에 사용하였다.
산화적 스트레스를 통해 유도한 세포 독성에 대한 RUE와 GUE의 보호효능을 MTT assay를 통해 알아보았다. 그 결과 RUE와 GUE는 AA와 iron에 의해 유도된 세포 독성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였으며, RUE 와 GUE 병용 처치가 각각의 단독처치보다 더 높은 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다.
성능/효과
또한, 유세포 분석을 실시하여 미토콘드리아 보호효과를 입증하였고 HepG2 세포, AML12 세포, SKHep1 세포 세 종류의 간세포주에서 LKB1의 인산화를 확인하였다. In vivo 모델에서도 RUE와 GUE의 병용 처치가 혈청 중 ALT 수치를 감소시키고, 간조직 내 손상 및 염증을 억제하는 것으로 확인되었다.
산화적 스트레스를 통해 유도한 세포 독성에 대한 RUE와 GUE의 보호효능을 MTT assay를 통해 알아보았다. 그 결과 RUE와 GUE는 AA와 iron에 의해 유도된 세포 독성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였으며, RUE 와 GUE 병용 처치가 각각의 단독처치보다 더 높은 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다. 이와 더불어 RUE와 GUE의 세포 보호효능을 세포자멸사 관련 단백질인 procaspase 3, PARP, Bcl-xL의 발현 변화를 immonoblotting analysis로 확인하였다.
이러한 효과는 RUE와 GUE의 병용 처치가 각 추출물의 단독 처리보다 효과적으로 나타났다. 따라서, RUE와 GUE는 in vivo 모델에서 CCl4에 의해 유도된 산화적 스트레스에 의한 간조직 내 손상 및 이로 인한 염증을 억제를 통해 효율적인 간보호 효과가 있음을 확인하였다.
따라서 RUE와 GUE의 병용 처치가 AA와 iron에 의해 유도된 세포자멸사에 세포 보호효과를 보인다고 여겨진다. 또한, RUE와 GUE의 병용처치는 AA와 iron에 의해 유도된 활성산소종 생성을 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과를 종합하면 RUE와 GUE의 병용처치는 산화적 스트레스에 의해 유발된 간세포의 자멸사에 대해 활성산소종 생성억제와 항산화 효과를 통해 세포보호작용을 나타내는 것으로 사료된다.
In vitro 모델에서는 MTT assay를 통하여 세포 보호효과 및 immunoblotting analysis로 세포자멸사 단백질 발현을 관찰함으로써 세포자멸사 억제 효능을 확인하였다. 또한, 유세포 분석을 실시하여 미토콘드리아 보호효과를 입증하였고 HepG2 세포, AML12 세포, SKHep1 세포 세 종류의 간세포주에서 LKB1의 인산화를 확인하였다. In vivo 모델에서도 RUE와 GUE의 병용 처치가 혈청 중 ALT 수치를 감소시키고, 간조직 내 손상 및 염증을 억제하는 것으로 확인되었다.
본 연구에서 유세포 분석기 분석을 통해 미토콘드리아 막 전위 변화를 측정한 결과, AA와 iron의 처치는 미토콘드리아 막 전위의 저하를 일으켰으며, RUE와 GUE 전 처치가 AA와 iron에 의해 유도된 미토콘드리아 막 전위의 저하를 통계적으로 유의하게 억제하였다. 본 연구를 통해 RUE와 GUE의 AA와 iron으로 유도된 미토콘드리아의 기능 장애에 대한 보호 효과를 확인하였다.
따라서, 과도한 산화적 스트레스는 세포 내 활성산소종의 축적을 야기하여, 미토콘드리아의 막 전위 변화를 통한 기능 장애를 유발하므로 미토콘드리아의 세포자멸사 회로를 활성화시킨다32). 본 연구에서 유세포 분석기 분석을 통해 미토콘드리아 막 전위 변화를 측정한 결과, AA와 iron의 처치는 미토콘드리아 막 전위의 저하를 일으켰으며, RUE와 GUE 전 처치가 AA와 iron에 의해 유도된 미토콘드리아 막 전위의 저하를 통계적으로 유의하게 억제하였다. 본 연구를 통해 RUE와 GUE의 AA와 iron으로 유도된 미토콘드리아의 기능 장애에 대한 보호 효과를 확인하였다.
이러한 결과는 대황과 감초의 병용처치가 in vitro와 in vivo 모델에서 산화적 손상에 대해 세포보호 효능과 간보호 효과가 있음을 입증한 것으로 대황과 감초는 항산화 효과와 더불어 간을 보호하는 유효한 약물 후보이다. 따라서 대황과 감초의 병용처치 효과의 명확한 세포 보호효과 기전에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
또한, RUE와 GUE의 병용처치는 AA와 iron에 의해 유도된 활성산소종 생성을 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과를 종합하면 RUE와 GUE의 병용처치는 산화적 스트레스에 의해 유발된 간세포의 자멸사에 대해 활성산소종 생성억제와 항산화 효과를 통해 세포보호작용을 나타내는 것으로 사료된다.
후속연구
이러한 결과는 대황과 감초의 병용처치가 in vitro와 in vivo 모델에서 산화적 손상에 대해 세포보호 효능과 간보호 효과가 있음을 입증한 것으로 대황과 감초는 항산화 효과와 더불어 간을 보호하는 유효한 약물 후보이다. 따라서 대황과 감초의 병용처치 효과의 명확한 세포 보호효과 기전에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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