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문제 정의
- 본 연구에서는 흰색 느티만가닥버섯을 갓(pileus)과 대 (stipe)로 분리하여 부위별 총 폴리페놀 함량, DPPH 라디칼소거능, ABTS 라디칼 소거능, oxygen radical absorbance ca- pacity (ORAC), 환원력(reducing power), 세포독성 등을 조사함으로써 천연물 유래 항산화 소재로서 흰색 느티만가닥버섯의 부위별 이용 가능성을 알아보고자 한다.
제안 방법
- 다음 분쇄하여 사용하였다. 분쇄한 갓 부위와 대 부위는 각각 5배(v/v)의 열수와 80% 에탄올에 침지한 후 50℃에서 100 rpm의 조건으로 2시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출물은 whatman filter paper (No.
- 분쇄한 갓 부위와 대 부위는 각각 5배(v/v)의 열수와 80% 에탄올에 침지한 후 50℃에서 100 rpm의 조건으로 2시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출물은 whatman filter paper (No. 2)로 여과한 후 회전감압농축기 (Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 완전히 제거한 다음 조추출물의 추출 수율을 구하였다. 열수 침지에서 갓 부위 조추출물의 추출 수율은 68.
- Louis, MO, USA) 100 ul를 첨가하였다. 혼합액은 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 multi-mode microplate reader (Molecular devices, SpectraMax M5, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였으며 gallic acid (Sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 작성한 검량선을 이용하여 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- Louis, MO, USA) 200 ul를 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 mul- ti-mode microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조구는 BHT (Sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료첨가구와 대조구 사이의 흡광도 차이를 구하여 백분율로 나타내었다.
- Louis, MO, USA) 900 ul를 첨가한 후 multi-mode microplate reader를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조 구는 L(+)-ascorbic acid (Sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며 ABTS 라디칼 소거 활성은 시료 첨가 구와 대조구 사이의 흡광도 차이를 구하여 백분율로 나타내었다.
- Cao 등의 방법(1993)에 준하여 측정하였다[6]. 흰색 느티만가닥 추출물 10 ul에 300 mM 2, 2'-azobis(2-amidino-pro- pane) dihydrochloride (AAPH, Sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액 20 ul와 250 nM fluorescein (Sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액 2.7 ml를 첨가한 다음 multi-mode microplate reader를 이용하여 485 nm (excitation wavelength)와 535 nm (emission wave- length)에서 1시간 동안 2분마다 형광을 측정하였다. 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 ORAC 지수는 trolox (Sigma-aldrich Chemical Co.
- 7 ml를 첨가한 다음 multi-mode microplate reader를 이용하여 485 nm (excitation wavelength)와 535 nm (emission wave- length)에서 1시간 동안 2분마다 형광을 측정하였다. 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 ORAC 지수는 trolox (Sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 작성한 검량선을 이용하여 구하였다.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 세포 독성은 WST (Water Soluble Tetrazolium salt)-1 assay를 이용하여 추출물이 대식세포 RAW 264.7의 세포생존율에 미치는 영향을 조사하여 확인하였다[15]. 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB 10092)으로부터 분양받은 대식세포 RAW 264.
- 흰색 느티만가닥버섯 갓 부위와 대 부위의 총 폴리페놀 함량은 gallic acid equivalents (GAE)으로 구하였으며 Fig. 1과 같다. 흰색 느티만가닥버섯 열수 추출물 중 갓 부위와 대 부위의 총 폴리페놀 함량은 각각 1137.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하여 확인하였으며 Fig. 2와 같다. 항산화 활성을 측정하는 방법 중 DPPH 라디칼 소거 활성은 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 화합물인 DPPH가 황 함유 아미노산, ascorbic acid, 페놀성 화합물 등의 항산화 물질로부터 전자나 수소를 제공받아 환원되면서 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법으로 환원력이 클수록 항산화 활성이 높다[31].
- 장점을 가지고 있다[34, 35]. 흰색 느티만가닥버섯 갓 부위와 대 부위의 ORAC 지수는 Trolox equivalents (TE)로 구하였으며 Fig. 4와 같다. 흰색 느티만가닥버섯 열수 추출물 중갓 부위와 대 부위의 ORAC 지수는 각각 93.
- 대식세포인 RAW 264.7에 대한 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 세포 독성은 대식세포 RAW 264.7에 추출물을 처리한 다음 WST-1 assay를 이용하여 확인하였다. 세포의 증식능력이나 세포생존력을 정량하는 대표적인 실험방법 중 하나인 WST assay는 세포 내 미토콘트리아의 탈수소 효소에 의해 엷은 붉은색의 수용성 기질인 water soluble tetrazolium salts 가 짙은 붉은색의 formazan으로 변환되는 성질을 이용하는 검사법으로 살아있는 세포수에 비례해서 흡광도를 나타낸다 [42].
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 흰색 느티만가닥버섯은 (주)그린피스에서 육종한 품종으로 자실체를 갓과 대로 분리한 후 동결건조한 다음 분쇄하여 사용하였다. 분쇄한 갓 부위와 대 부위는 각각 5배(v/v)의 열수와 80% 에탄올에 침지한 후 50℃에서 100 rpm의 조건으로 2시간 동안 3회 반복 추출하였다.
- 7의 세포생존율에 미치는 영향을 조사하여 확인하였다[15]. 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB 10092)으로부터 분양받은 대식세포 RAW 264.7은 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Rockvile, Md, USA)과 1%의 pen- icillin-streptomycin (Gibco, Rockvile, Md, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM, Gibco, Rock- vile, Md, USA) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 2일 동안 배양하였다. 배양된 대식세포 RAW 264.
데이터처리
- 모든 실험은 5회 이상 반복실험을 수행하여 얻어진 결과이며 실험결과의 평균값과 표준오차는 SAS (Statistical analysis system, USA) program을 사용하여 구하였고 Duncan’s 다중검정법으로 p<0.05 수준에서 통계적 유의성 검정을 실시하였다.
- marmoreus (white cultivar). Values are ex- pressed as mean±SD (n=5), values with different super- script letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- marmoreus (white cultivar). Values are ex- pressed as mean±SD (n=5), values with different super- script letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- The cell proliferation was determined using WST-1 assay. Values are expressed as mean±SD (n=5), Values with different superscript letters are significantly differ- ent at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
이론/모형
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin- Ciocalteu reagent가 추출물에 의해 환원되면 몰리브덴이 청색으로 발색되는 원리를 이용한 Singleton 등(1981)의 방법에 준하여 측정하였다[36]. 흰색 느티만가닥버섯 추출물 100 ul에 2% sodium carbonate (Na2CO3) 용액(Sigma-aldrich Chemi- cal Co.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 1, 1-diphenyl-2-picrylhy- drazyl (DPPH) 라디칼에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 짙은 보라색을 띄는 안정한 라디칼인 DPPH 가 항산화물질의 전자공여능에 의해 수소 혹은 전자를 받아 탈색되는 원리를 이용한 Blois 등(1985)의 방법에 준하여 측정하였다[4]. 흰색 느티만가닥버섯 추출물 50 ul에 0.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 2, 2'-azino-bis(3-ethylben- zothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) 라디칼 소거 활성은 청록색을 띄는 ABTS·+ 라디칼이 항산화물질의 전자공여능에 의해 수소 혹은 전자를 받아 탈색되는 원리를 이용한 Re 등 (1999)의 방법에 준하여 측정하였다[39]. 흰색 느티만가닥버섯 추출물 100 ul에 ABTS 용액(Sigma-aldrich Chemical Co.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 peroxyl 라디칼 소거 능을 나타내는 oxygen radical absorbance capacity (ORAC)는 per- oxyl 라디칼의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 측정하는 Cao 등의 방법(1993)에 준하여 측정하였다[6]. 흰색 느티만가닥 추출물 10 ul에 300 mM 2, 2'-azobis(2-amidino-pro- pane) dihydrochloride (AAPH, Sigma-aldrich Chemical Co.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 환원력은 추출물이 수소를 공여하여 ferric ion (Fe3+)을 ferrous ion (Fe2+)으로 환원시키는 능력을 측정하는 potassium ferricyanide법을 이용한 Oyaizu (1986)의 방법에 준하여 측정하였다[34]. 흰색 느티만가닥버섯 추출물 500 ul에 0.
- marmoreus (white culti- var). The cell proliferation was determined using WST-1 assay. Values are expressed as mean±SD (n=5), Values with different superscript letters are significantly differ- ent at p<0.
성능/효과
- , Tokyo, Japan)를 이용하여 용매를 완전히 제거한 다음 조추출물의 추출 수율을 구하였다. 열수 침지에서 갓 부위 조추출물의 추출 수율은 68.0%, 대 부 위조추출물의 추출 수율은 75.0%였고 에탄올 침지에서 갓 부 위조추출물의 추출 수율은 44.0%, 대 부위 조추출물의 추출 수율은 53.0%였다.
- 1과 같다. 흰색 느티만가닥버섯 열수 추출물 중 갓 부위와 대 부위의 총 폴리페놀 함량은 각각 1137.39±0.38 mg GAE/100 g과 700.86±0.06 mg GAE/100 g였고 에탄올 추출물 중 갓 부위와 대 부위의 총 폴리페놀 함량은 각각 923.47±0.18 mg GAE/100 g과 324.05±0.03 mg GAE/100 g으로 에탄올 추출물에 비 해열 수 추출물의 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났으며 대 부위보다는 갓 부위의 총 폴리페놀 함량이 더 높게 나타났다. 시판 버섯의 부위별 항산화능에 관한 연구, 부위별 새송이 추출물의 항산화 효과, 갈색 느티만가닥버섯 메탄올 추출물의 항산화 효과에 관한 연구에서도 대 부위보다 갓 부위의 총 폴리페놀 함량이 높은 것으로 보고되었으며[22, 25, 28] 본 실험에 사용된 흰색 느티만가닥버섯은 새송이(메탄올 추출물 갓 부위 374.
- 항산화 활성을 측정하는 방법 중 DPPH 라디칼 소거 활성은 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 화합물인 DPPH가 황 함유 아미노산, ascorbic acid, 페놀성 화합물 등의 항산화 물질로부터 전자나 수소를 제공받아 환원되면서 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법으로 환원력이 클수록 항산화 활성이 높다[31]. 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 갓 부위와 대 부위 모두 농도 의존적으로 증가하였으며 대 부위보다는 갓 부위의 DPPH 라디칼 소거 능이 높게 나타났고 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 높게 나타났다. 흰색 느티만가닥버섯의 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 우수한 DPPH 라디칼 소거 능을 나타낸 이유는 흰색 느티만가닥버섯에는 친수성보다는 소수성의 항산화물질이 더 많이 함유되어 있기 때문으로 판단된다.
- 흰색 느티만가닥버섯의 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 우수한 DPPH 라디칼 소거 능을 나타낸 이유는 흰색 느티만가닥버섯에는 친수성보다는 소수성의 항산화물질이 더 많이 함유되어 있기 때문으로 판단된다. 열수 추출물 10 mg/ml의 농도에서 갓 부위와 대 부위의 DPPH 라디칼 소거능은 각각 31.02±0.16%, 21.50±0.06%였고 에탄올 추출물 10 mg/ml의 농도에서 갓 부위와 대 부위의 DPPH 라디칼 소거능은 각각 47.32±0.23%, 35.31±0.39%였다 (Fig. 2). 시판버섯의 부위별 항산화 활성에 관한 연구에서도 갓 부위의 DPPH 라디칼 소거능이 대 부위보다 높은 것으로 보고되었다[23].
- 3과 같다. 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 ABTS 양이온 소거능은 갓 부위와 대 부위 모두 농도 의존적으로 증가하였으며 대 부위보다는 갓 부위의 ABTS 양이온 소거능이 높게 나타났고 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 ABTS 양이온 소거능이 높게 나타났다. 10 mg/ml의 농도에서 열수 추출물 갓 부위와 대 부위의 ABTS 양이온 소거능은 각각 45.
- 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 ABTS 양이온 소거능은 갓 부위와 대 부위 모두 농도 의존적으로 증가하였으며 대 부위보다는 갓 부위의 ABTS 양이온 소거능이 높게 나타났고 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 ABTS 양이온 소거능이 높게 나타났다. 10 mg/ml의 농도에서 열수 추출물 갓 부위와 대 부위의 ABTS 양이온 소거능은 각각 45.01±0.43%, 29.78±0.44%였고 에탄올 추출물 갓 부위와 대 부위의 ABTS 양이온 소거 능은 각각 57.33±0.10%, 48.02±0.12%였다. 시판버섯의 부위별 항산화 활성에 관한 연구에서도 갓 부위의 ABTS 양이온 소거 능이 대 부위보다 높은 것으로 보고되었다[23].
- 4와 같다. 흰색 느티만가닥버섯 열수 추출물 중갓 부위와 대 부위의 ORAC 지수는 각각 93.34±1.00 uM TE/g 과 58.33±0.48 uM TE/g이였고 에탄올 추출물 중 갓 부위와 대 부위의 ORAC 지수는 각각 64.76±0.98 uM TE/g와 46.22± 1.12 uM TE/g으로 에탄올에 비해 열수 추출물의 ORAC 지수가 높게 나타났으며 대 부위보다는 갓 부위의 ORAC 지수가 더 높게 나타났다. 목이 품종간 생리활성 비교에 관한 보고에 의하면 털목이의 ORAC 지수는 101.
- 5 와 같다. 흰색 느티만가닥버섯 추출물의 환원력은 갓 부위와 대 부위 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며 에탄올 추출물에 비해 열수 추출물의 환원력이 높게 나타났으며 갓 부위와 대 부위의 차이는 없었다. 흰색 느티만가닥버섯 열수 추출물은 10 mg/ml의 농도에서 갓 부위와 대 부위의 환원력은 각각 0.
- 세포의 증식능력이나 세포생존력을 정량하는 대표적인 실험방법 중 하나인 WST assay는 세포 내 미토콘트리아의 탈수소 효소에 의해 엷은 붉은색의 수용성 기질인 water soluble tetrazolium salts 가 짙은 붉은색의 formazan으로 변환되는 성질을 이용하는 검사법으로 살아있는 세포수에 비례해서 흡광도를 나타낸다 [42]. 대식세포 RAW 264.7 세포에 흰색 느티만가닥버섯 추출물을 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40 mg/ml의 농도로 처리한 다음 WST-1 assay에 의한 세포생존율을 조사한 측정한 결과, 모든 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포독성은 나타나지 않는 것으로 판단된다(Fig. 6).
- 67 uM/g이였다[10]. 흰색 느티만가닥버섯 열수 추출물 갓 부위의 ORAC 지수는 이전에 보고된 갈색 목이, 흑목이, 양송이, 잎새버섯, 표고 버섯에 비해 높게 나타났으며 이는 열수 추출물 갓 부위의 총 폴리페놀 함량이 높기 때문에 ORAC 지수도 높은 것으로 판단된다.
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