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문제 정의
- 실험결과를 이용한 회귀식 대한 분산분석의 결과는 반응표면분석법에 의해 수립된 모델의 적합성 여부를 알려준다. 다중반응표면 최적화는 다수의 반응변수를 최적화하는 입력변수의 조건을 찾는 것을 목적으로 한다[26]. Quadratic 회기 모델의 분석 결과는 Table 3에 나타내었다.
- 따라서 본 연구는 오계 다리 육으로부터 펩타이드 형태의 단백질 가수 분해물 최적 생산 공정 조건을 연구하고 생산물의 특성(가수분해도, 유리아미노산, 분자량 분포)을 연구하였다.
제안 방법
- 샘플의 농도는 50～100 ppm 정도로 준비하였으며, matrix시료와 시료를 1:1비율로 섞었다. MS plate위에 1 mL 정도 떨어뜨려 건조한 후 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기(MALDI-TOF, Voyager DE-STR, Applied biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 가수분해도 측정은 Lowry법을 변형하여 측정하였다[25]. 오계 다리육의 단백질 가수 분해물 1 mL에 0.
- , Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택하여 X1(압력)는 30 MPa(-1), 50 M Pa(0), 100 MPa(+1)로 정하고, X2(시간)는 1시간(-1), 3시간(0) 5시간(+1)로 정하고, X3(기질의 농도)는 10%(-1), 20%(0), 30%(+1)로 정하였다(Table 1).
- Box-Behnken Design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수(coeff icients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다[24]. 본 실험에서는 반응 변수는 가수분해도(DH, Degree of Hydrolysis)로 하였고, 통계적인 계산을 원활하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code)하여 사용하였다. 세 개의 변수들을 각각 X1(압력), X2(시간), X3(기질농도)로 하였다.
- 상등액은 0.2 μm membrane filter (Millipore Co., MA, USA)로 여과하여 아미노산 자동분석기(Sykam GmbH, S430-H, Germany)로 아미노산량을 측정하였다.
- 상업용 단백질 가수분해 효소 bromelain 1200을 이용하여 오계 다리육 단백질로부터 펩타이드 분자량을 가지는 단백질 가수 분해물 최적 제조 공정 조건을 표면반응 분석법을 이용하여 수행을 하였다. 제조 공정 변수들은 범위는 압력(30-100 MPa), 반응시간(1-3시간), 반응 기질 양(10-30%) 이었다.
- 본 실험에서는 반응 변수는 가수분해도(DH, Degree of Hydrolysis)로 하였고, 통계적인 계산을 원활하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code)하여 사용하였다. 세 개의 변수들을 각각 X1(압력), X2(시간), X3(기질농도)로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 의하여 구할 수 있고 그 값을 Z로 하였다.
- 연산오계 다리육 단백질을 bromelain을 이용하여 최적 고압 조건에서 단백질 가수분해하고 TCA를 이용하여 가수 분해물을 추출을 하였다. 추출된 가수분해물의 분자량의 분포를 MALDI-TOP를 이용하여 분석한 크로마토그램이 Fig.
- 진공파우치에 균질화 된 다리육과 효소 BM 1200 1%를 첨가하여 고압기(TFS–2L, Toyoko Tasu Co., LTD, Hiroshima, Japan)에 반응시켰다.
- 펩타이드 생산 최적화 공정을 위한 실험 계획은 3개의 독립변수 반응압력(MPa), 반응시간(h), 기질의 농도 즉, 오계 다리육 농도(%)를 각각 50 MPa, 3시간, 20%로 하는 Center run을 5번 반복을 포함하여 총 17개의 처리 조합으로 구성 되었다. Box-Behnken Design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수(coeff icients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다[24].
- 반응 후 샘플을 여과하여 578 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 L-tyrosine의 표준곡선을 이용하여 가수분해도 DH(%)를 계산하였다.
- 플라스틱 비커에 30 mL PBS 용액와 오계 다리육을 10%, 20%, 30%씩 각각 넣어 Homoge nizer를 이용하여 균질화 시켰다. 진공파우치에 균질화 된 다리육과 효소 BM 1200 1%를 첨가하여 고압기(TFS–2L, Toyoko Tasu Co.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 오계육은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 깃털이 없이 냉동상태로 공급되었고, 실험 전까지 –20℃에서 냉동 보관하였다. trichloroacetic acid(TCA)시약과 Foli n ciocalteu`s phenol(FCP)시약은 Sigma Comp any 사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 단백질 분해효소 bromelain 1200GDU(BM 1200)은 대종상사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejeon, Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 오계육은 지산농원(Nonsan, Choongnam, Korea)에서 깃털이 없이 냉동상태로 공급되었고, 실험 전까지 –20℃에서 냉동 보관하였다.
- trichloroacetic acid(TCA)시약과 Foli n ciocalteu`s phenol(FCP)시약은 Sigma Comp any 사(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 단백질 분해효소 bromelain 1200GDU(BM 1200)은 대종상사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejeon, Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
- 실험 후에 확정된 결과들의 통계분석은 Des ign Expert(Couresy: Statease Inc., Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택하여 X1(압력)는 30 MPa(-1), 50 M Pa(0), 100 MPa(+1)로 정하고, X2(시간)는 1시간(-1), 3시간(0) 5시간(+1)로 정하고, X3(기질의 농도)는 10%(-1), 20%(0), 30%(+1)로 정하였다(Table 1).
이론/모형
- BM1200에 효소를 이용하여 오계 다리육을 효소가수분해 하여 최적 조건요인들인 압력, 시간, 기질의 양의 실험변수에 대하여 Box-Behnken Design으로 실험을 설계하여 얻어진 실험결과 즉, 가수분해도를 Table 2에 나타내었다. 가수분해도의 범위는 16.
- ΔX는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법으로 사용을 하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.
성능/효과
- 제조 공정 변수들은 범위는 압력(30-100 MPa), 반응시간(1-3시간), 반응 기질 양(10-30%) 이었다. 가수분해도 최적 조건은 압력은 높을수록 증가를 하였고, 반응 시간은 시간은 3시간, 기질의 농도는 20%에서 결정되었다. 이때 최대 가수분해도가 34.
- 시간 또한 비슷하게 1시간부터 3시간 30분까지 증가하다가 그 이후에는 감소하는 결과를 보여주었다. 가수분해도의 범위는 16.15%～33.65%으로 나타났으며, 가수분해도는 펩타이드 생산량을 평가하는 지표가 되므로 최대 예측 펩타이드 생산량은 33.65%로 보여 진다.
- 펩타이드 생성물의 유리 아미노산 함량은 다음과 같다(Table 6). 고압 처리한 오계 다리육 단백질에서는 32 종류의 유리아미노산이 검출되었으며(344.80 mg/100g), 구성 아미노산은 leucine, lysine, alanine, glutamic acid, phenylalanine 순으로 존재하였고, 구성아미노산을 제외한 아미노산에서는 taurine(4.9%), ornitine(1.8%), anserine (1.6%), hydroxylysine(1.4%) 등의 순으로 존재하였다. 아미노산 함량은 식품의 기호성에 영향을 미치는 중요한 요소이고[28], 식품의 풍미를 예측하는 하나의 중요한 요소이다[29].
- 시간은 3시간 반응 하였을 때 최고 고압액화 가수분해 정도를 보여주다가 시간이 더 지날수록 가수분해도가 낮아지는 것을 보여준다. 기질의 양은 10%보다 20%의 양일 때 일정하게 계속 증가하는 것을 보여주다가 30%의 양일 때 서서히 가수분해가 줄어드는 것을 볼 수 있다. 최대 고압액화를 이용한 오계다리육의 가수분해는 34.
- 크로마토그램은 대부분 단백질 가수 분해물들의 분자량 분포는 m/z 400이상에서 1,000이하 분자량 분포를 보여 주었다. 따라서 본 연구에서 생산된 단백질 가수 분해물은 1,000 Da 이하의 펩타이드로 구성되었다는 것을 보여 준다[34].
- 05). 본 실험 결과는 압력, 시간, 기질의 양에 대한 영향은 1차, 2차, 교호항(cross product term)에서 유의성이 나타나 요인들이 단독 또는 교호적으로 영향을 미침을 알 수 있다. 이들에 대한 회귀식은 Table 5에 있다.
- 9626 이므로 이 모델은 4% 범위에서 설명되지 않는다는 것을 보여준다. 적합결여(lack of fit) 테스트 검정에서는 유의성이 나타나지 않아 본 실험에 사용한 모델이 매우 적절함을 알 수 있다. Table 4에서는 모델의 회귀계수를 나타내는 것으로 가수분해도가 3가지 요인 즉 압력, 시간, 기질들에 대하여 크게 영향을 받는 것으로 나타났다(P<0.
- 10%이였다. 종합적으로 보면 오계다리육의 고압액화 효소가수분해에 따른 펩타이드 양에 가장 영향을 미치는 것은 압력이고 다음에 기질의 농도 그리고 반응시간 순으로 나타났다(Fig. 4). Shon등[27]은 닭고기 부산물을 이용하여 protease(Amano 6)와 peptidase를 5:1의 비율로 효소 가수분해하였을 때 시간이 지날수록 가수분해도가 급격히 증가하다가 점차적으로 완만히 증가하는 것을 보여주었다.
- 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 예측 최대 고압 처리한 오계다리살의 단백질 효소가수분해는 압력이 높을수록, 반응시간이 많을수록, 기질양이 많이 사용될수록 영향을 받는 것으로 나타났다. 압력은 높을수록 점차 증가되면서 가수분해가 더욱 잘 된 것을 보여주었다.
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