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문제 정의
- 따라서 본 논문에서는 국가별로 독활(獨活) 기원종의 차이에서 발생하는 혼·오용을 방지를 위해 독활, 중치모당귀, 유럽 당귀 및 어수리 4종을 대상으로 matK와 rbcL 두 개의 범용성 DNA 바코드 구간의 염기서열 정보 분석을 통해 종을 동정할 수 있는 marker nucleotide 발굴하고 유전자 마커로 활용 가능한 정보를 제공하고자 한다.
- 본 연구는 대한민국약전에 독활(獨活) 기원식물로 수재 되어 있는 독활(Ar. continentalis)과 독활(独活)의 위품으로 혼·오용되고 있거나 가능성이 있는 중치모당귀(An. biserrata), 유럽당귀(L. officinale) 및 어수리(H. moellendorffii)를 감별할 수 있는 marker nucleotide (MN)를 탐색하기 위해 4종을 대상으로 2종류의 범용성 DNA 바코드인 matK와 rbcL 유전자의 염기서열 비교분석을 통해 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- DNA 바코드 구간 증폭산물의 DNA 염기서열 분석을 위하여 각 시료당 전체 40 ㎕ 증폭산물을 1.5% agarose gel 상에서 100 bp DNA ladder (Solgent, Korea)와 함께 전기영동하고 Ecodye로 염색하여 관찰한 후, 정확하게 증폭된 PCR 증폭산물을 agarose gel로부터 회수하여 Gel Extraction Kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 정제한 뒤 pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, USA)에 삽입하였다. 삽입된 증폭 산물은 JM109 competent cell (RBC, USA)에 형질 전 환한 뒤 100 ㎍/㎖ ampicillin, 40 ㎍/㎖ X-gal 그리고 0.
- DNA 바코드 분석을 위해 –75℃에 보관 중인 각각의 시료는 약 100 mg을 Lysing matrix ATM tube (MP biomedicals, USA)에 담아 PrecellysTM Grinder (Bertin technologies, France)를 이용하여 5, 500 rpm으로 30초간 곱게 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, USA)을 이용하여 제작자가 제공한 protocol에 따라 추출·정제하였다. 정제된 DNA의 순도와 질을 확인하기 위하여 0.
- 5 mM IPTG가 첨가된 LB agar 배지에 도말하여 약 18시간 배양하였다. 각 시료별로 선별된 white colony를 이용하여 colony PCR 분석을 통해 예상된 크기로 증폭된 clone 4개씩을 solgent (Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 염기서열분석은 pGEM-T Easy Vector 내부에 존재하는 T7과 SP6 primer를 이용하여 증폭산물 전체의 염기서열을 확보하였으며 4개의 clone으로부터 얻은 각각의 염기서열 정보를 비교분석하여 각 시료의 matK 및 rbcL 바코드 염기서열을 최종 확정하였다.
- 약 15 ng의 genomic DNA와 각 20 pmole의 정방향과 역방향 primer (Table 2)를 SolgTM 2×Taq PCR Smart-MixI (Solgent, Korea)를 혼합하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler (MJ Research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 2분간 pre-denaturation한 후 95℃에서 60초 denaturation, 53℃에서 40초 annealing, 72℃에서 2 분 extension을 총 35회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 5분간 final-extension시켜 증폭하였다.
- 각 시료별로 선별된 white colony를 이용하여 colony PCR 분석을 통해 예상된 크기로 증폭된 clone 4개씩을 solgent (Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 염기서열분석은 pGEM-T Easy Vector 내부에 존재하는 T7과 SP6 primer를 이용하여 증폭산물 전체의 염기서열을 확보하였으며 4개의 clone으로부터 얻은 각각의 염기서열 정보를 비교분석하여 각 시료의 matK 및 rbcL 바코드 염기서열을 최종 확정하였다.
- 9)의 ClustalW (command line interface)을 수행하였다. 정렬된 matK와 rbcL 염기서열의 종내 개체별 비교와 종별 비교를 통해 종 특이성을 갖는 염기의 삽입(insertions), 결실(deletions) 및 치환(substitutions) 을 정렬된 위치별로 분석하여 정리하였다. 전체 분석대상 시료의 유연관계 분석은 16 개체의 각 DNA 바코드 구간 전체염기서열과 GenBank에 등록된 Vauquelinia californica의 염기서열 정보를(matK, AF288129; rbcL, JQ391403) outgroup으로 하여 계통유전학적 거리 측정을 위해 MEGA6 program의 neighbor-joining (NJ) 방법으로 phylogenetic tree를 작성하고 군집의 형성 유·무와 군집간의 유연관계를 비교·분석하였다.
- 정제된 DNA의 순도와 질을 확인하기 위하여 0.8% agarose gel을 이용하여 전기영동 후, Ecodye (Biofact, Korea)로 염색하여 UV light 상에서 DNA band를 확인하였으며, UV spectrophotometer (Nanodrop, USA)를 이용하여 260 nm 와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
대상 데이터
- 그러나, 유럽당귀에서는 종 특이 MN이 단 한 곳도 존재하지 않음을 확인함으로서 rbcL 구간만을 이용한 독활(獨活) 및 혼·오용 유사품 3종을 포함한 4종을 명확하게 종단 위에서 감별하는 것이 불가능함을 확인하였다. rbcL 구간에 위치하는 독활 종 특이적 염기치환 MNe 정렬된 염기의 28번 위치(G→A)를 시작으로 4 위치에 존재하고 있었으며, G→T 2개 위치, G→C 2개 위치, C→T 10개 위치, C→A 4 개 위치, A→T 1개 위치, A→C 5개 위치, A→G 5개 위치, T →A 1개 위치, T→C 6개 위치 및 T→G 1개 위치의 형태로 존재하였고, 삽입/결실 MNe 1433-1438번 위치의 ‘CTAATT’ 염기결실 1개가 존재하였다. 중치모당귀는 495번 위치(T→ C), 982번 위치(T→G), 1315번 위치(A→C), 1320번 위치(A →G), 1408번 위치(C→G) 등 모두 5개 위치에서 염기치환 MN이 존재하였고, 어수리는 1356번 위치(C→T)와 1439번 위치(A→C) 2개 위치에서 염기치환 MN이 존재하였다(Table 5).
- 이용하였다(Table 1). 또한, 수집한 시료는 본초학, 식물분류학, 식물생태학 등의 전문가로 구성된 분류·동정 자문회의의 동정을 거쳐 그 종을 최종 확증하였으며, 각 시료의 기원 식물은 압착석엽표본을 제작하여 한국한의학연구원 한약 표준표본관(IH 표본관 코드 KIOM)에 표본번호를 부여하여 증거표본으로 보관하였다.
- 유전자 분석에 사용된 독활, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리 4종의 각 4개체씩 총 16개체 시료는 2008년부터 2013년까지 국내・외의 서로 다른 자생지와 재배지에서 수집하였으며, 수집한 분석용 시료는 장기보관을 위한 처리과정으로 증류수를 이용하여 2∼3회 수세한 후 병반부위가 포함되지 않은 부위만 액체질소에 급냉시켜 -75℃ 초저온 냉동고에 보관하여 이용하였다(Table 1). 또한, 수집한 시료는 본초학, 식물분류학, 식물생태학 등의 전문가로 구성된 분류·동정 자문회의의 동정을 거쳐 그 종을 최종 확증하였으며, 각 시료의 기원 식물은 압착석엽표본을 제작하여 한국한의학연구원 한약 표준표본관(IH 표본관 코드 KIOM)에 표본번호를 부여하여 증거표본으로 보관하였다.
데이터처리
- 16개체의 시료로부터 확보한 matK와 rbcL 유전자 최종염기서열을 DNA 바코드 종류별로 다중서열정렬을 위해 BioEdit program (Version 7.0.9)의 ClustalW (command line interface)을 수행하였다. 정렬된 matK와 rbcL 염기서열의 종내 개체별 비교와 종별 비교를 통해 종 특이성을 갖는 염기의 삽입(insertions), 결실(deletions) 및 치환(substitutions) 을 정렬된 위치별로 분석하여 정리하였다.
- 정렬된 matK와 rbcL 염기서열의 종내 개체별 비교와 종별 비교를 통해 종 특이성을 갖는 염기의 삽입(insertions), 결실(deletions) 및 치환(substitutions) 을 정렬된 위치별로 분석하여 정리하였다. 전체 분석대상 시료의 유연관계 분석은 16 개체의 각 DNA 바코드 구간 전체염기서열과 GenBank에 등록된 Vauquelinia californica의 염기서열 정보를(matK, AF288129; rbcL, JQ391403) outgroup으로 하여 계통유전학적 거리 측정을 위해 MEGA6 program의 neighbor-joining (NJ) 방법으로 phylogenetic tree를 작성하고 군집의 형성 유·무와 군집간의 유연관계를 비교·분석하였다.
성능/효과
- 1. 4종 16개체의 DNA 바코드 구간 염기서열을 해독하고 구조를 분석한 결과 matK와 rbcL 유전자는 독활은 1, 259 bp와 1, 497 bp의 염기로, 독활을 제외한 3종(중치 모 당귀, 유럽당귀 및 구당귀)은 1, 268 bp와 1, 503 bp 염기의 동일한 길이로 구성되어 있었으며, 종간 변이율에서도 두릅나무과에 속한 독활이 미나리과에 속한 중치 모 당귀, 유럽당귀 및 어수리에 비해 2배 이상 높은 값을 보였다.
- 2. 종 단위 감별이 가능한 MN을 확인하기 위해 matK와 rbcL 유전자의 염기서열을 비교‧분석한 결과, 염기의 삽입/결실에 의한 MNe 독활에서만 확인되었으며, 염기 치환에 의한 MNe 독활, 어수리, 중치모당귀 그리고 유럽 당귀 순으로 확인되었다.
- 3. MN을 기준으로 matK는 4종을 명확하게 감별 가능한 DNA 바코드 구간으로 확인된 것에 비해 rbcLe 유럽 당귀를 제외한 3종의 감별이 가능하였으며, 유연관계 분석을 통한 결과는 matK와 rbcL 모두 종 단위 감별이 가능함을 확인하였다.
- CBOL에서 권장하는 universal primer를 이용하여 독활, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리 4종 16개체의 matK와 rbcL 유전자를 증폭한 결과, 모든 시료에서 각각 예상된 크기의 1.3 kb와 1.5 kb의 DNA 절편이 증폭되었음을 agarose 겔 전기영동을 통해 확인하였으며, 두 DNA 바코드의 PCR 효율은 모두 100%였다. 각 시료당 4개 clone에 대한 염기서열분석을 통해 PCR 에러를 확인하고 최종 확정된 matK 유전자 증폭 산물 크기는 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리에서 1, 268 bp로 동일하였으며, 독활은 1, 259 bp로 다른 종들에 비해 9 bp가 짧음을 확인하였다(Table 3).
- DNA barcode 분석에 이용된 4종 16개체 시료의 multiple alignment를 통해 염기서열이 정렬된 결과를 토대로 종내 염기 치환 또는 삽입/결실을 제외한 종 특이적으로 존재하는 염기 치환 또는 삽입/결실을 종 동정 및 감별용 유전자 마커로 활용할 수 있어 이들의 위치와 염기서열을 marker nucleotide (MN)라 명명하였다. matK 유전자의 MN 분석 결과, 독활에서는 101개 위치의 염기치환 및 3개 위치의 삽입/결실을 포함하여 총 104곳의 MN이 확인되었고, 중치모당귀, 유럽 당귀 및 어수리에서의 염기치환은 각각 3개 위치, 4개 위치, 그리고 7개 위치가 각각의 종에서 확인되었으나 삽입/결실은 3종 모두 확인되지 않았다 (Table 4).
- 78%의 순서였다(Table 3). matK 유전자 염기서열의 종내 변이율은 중치모당귀가 0.12%로 가장 높았으며, 독활 0.07%로 그 다음이었으며 유럽당귀와 어수리는 0.00%로 종내 변이가 확인되지 않았다. rbcL 유전자 염기서열의 종내 변이율도 중치모당귀가 0.
- 명명하였다. matK 유전자의 MN 분석 결과, 독활에서는 101개 위치의 염기치환 및 3개 위치의 삽입/결실을 포함하여 총 104곳의 MN이 확인되었고, 중치모당귀, 유럽 당귀 및 어수리에서의 염기치환은 각각 3개 위치, 4개 위치, 그리고 7개 위치가 각각의 종에서 확인되었으나 삽입/결실은 3종 모두 확인되지 않았다 (Table 4). 즉 독활 감별에 활용 가능한 종 특이적 MNe 정렬된 염기의 73번 위치에서 발생한 G→A 염기치환이 matK 유전자 전체에서 17개 위치에서 확인되었으며, 그 외에도 G→C 염기치환 4개 위치, G→T 염기치환 6개 위치, C→A 염기치환 9개 위치, C→T 염기치환 13개 위치, C→G 염기치환 1개 위치, A→T 염기치환 2개 위치, A→G 염기치환 11개 위치, A→C 염기치환 12개 위치, T→A 염기 치환 6개 위치, T→G 염기치환 5개 위치 그리고 T→C 염기 치환 15개 위치 등 총 101개 위치에서 확인되었다(Table 4).
- 각 시료당 4개 clone에 대한 염기서열분석을 통해 PCR 에러를 확인하고 최종 확정된 matK 유전자 증폭 산물 크기는 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리에서 1, 268 bp로 동일하였으며, 독활은 1, 259 bp로 다른 종들에 비해 9 bp가 짧음을 확인하였다(Table 3). matK 유전자의 염기서열삽입/결실 구간의 정확한 위치정보를 확인하기 위해 최종 확정된 4종 16개체의 염기서열을 ClustalW 방법으로 multiple alignment하여 비교 분석한 결과, 독활의 97-99번 위치에서 ‘GAC’ 염기삽입이 존재하였으며, 150-155번과 710-715번두 위치에서 각각 ‘GTCTGA’와 ‘GACTTG’ 염기결실이 확인되었다(Table 4). rbcL 유전자 증폭산물의 크기는 중 모치 당귀, 유럽당귀 및 어수리는 1, 503 bp로 동일한 반면 독활은 1, 497 bp로 확인되었다(Table 3).
- rbcL 구간의 분석 결과, 독활에서만 확인되는 종 특이적 염기 치환 41개 위치와 1개 위치의 삽입/결실을 포함하여 총 42개 위치에서 MN가 확인되었고, 중치모당귀와 어수리에서는 염기치환의 MN이 각각 5개 위치와 2개 위치에서 확인되었다(Table 5). 그러나, 유럽당귀에서는 종 특이 MN이 단 한 곳도 존재하지 않음을 확인함으로서 rbcL 구간만을 이용한 독활(獨活) 및 혼·오용 유사품 3종을 포함한 4종을 명확하게 종단 위에서 감별하는 것이 불가능함을 확인하였다.
- 00%로 종내 변이가 확인되지 않았다. rbcL 유전자 염기서열의 종내 변이율도 중치모당귀가 0.07%로 가장 높았으며, 나머지 3종의종내 변이는 확인되지 않았다(Table 3). matK와 rbcL 두 유전자 모두 중치모당귀에서 종내 변이율이 가장 높게 나타났는데, 이는 분석시료 4개 중에서 An.
- matK 유전자의 염기서열삽입/결실 구간의 정확한 위치정보를 확인하기 위해 최종 확정된 4종 16개체의 염기서열을 ClustalW 방법으로 multiple alignment하여 비교 분석한 결과, 독활의 97-99번 위치에서 ‘GAC’ 염기삽입이 존재하였으며, 150-155번과 710-715번두 위치에서 각각 ‘GTCTGA’와 ‘GACTTG’ 염기결실이 확인되었다(Table 4). rbcL 유전자 증폭산물의 크기는 중 모치 당귀, 유럽당귀 및 어수리는 1, 503 bp로 동일한 반면 독활은 1, 497 bp로 확인되었다(Table 3). 이들 염기서열을 multiple alignment하여 비교한 결과, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리와는 달리 독활의 1433-1438번 위치에서 ‘CTAATT’ 염기결실이 존재함을 확인되었다(Table 5).
- 72%의 순서였다(Table 3). rbcL 유전자의 G+C(%) 비율에서는 중치모당귀가 44.28%로 가장 높았으며, 그 다음으로 어수리 43.91%, 독활 43.89%, 유럽당귀 43.78%의 순서였다(Table 3). matK 유전자 염기서열의 종내 변이율은 중치모당귀가 0.
- 또한, 중치 모 당귀, 유럽당귀 및 어수리 3종이 유전적으로 가깝게 유집되어 독활과 독립된 하나의 분계조를 형성하였다. rbcL 유전자의 유연관계 분석결과, matK 유전자와 마찬가지로 4종이 bootstrap value 95 이상에서 각각의 종단위로 clade를 형성하며 유집이 되었는데, 이는 미나리과(Apiaceae)에 속하는 중치 모 당귀, 유럽당귀 및 어수리와 두릅나무과(Araliaceae)에속하는 독활이 각각 독립된 분계조를 형성하였다(Figure 2). 따라서 4종간의 유연관계 분석은 두 DNA 바코드 구간 모두 종단 위 clade 형성으로 종 감별을 위한 방법으로 활용이 가능할 수 있으나, 종간 유전적 거리에서 보다 명확하게 차이를 보인 matK를 이용하는 것이 rbcL보다 유리하다는 것을 보여준다.
- 각 바코드 구간의 염기서열 분석에서 구아닌과 시토신 염기의 비율 [G+C(%)]을 분석한 결과, matK 유전자는 유럽 당귀가 34.23%로 가장 높았으며, 어수리 33.91%, 중치모당귀 33.87%, 독활 33.72%의 순서였다(Table 3). rbcL 유전자의 G+C(%) 비율에서는 중치모당귀가 44.
- 5 kb의 DNA 절편이 증폭되었음을 agarose 겔 전기영동을 통해 확인하였으며, 두 DNA 바코드의 PCR 효율은 모두 100%였다. 각 시료당 4개 clone에 대한 염기서열분석을 통해 PCR 에러를 확인하고 최종 확정된 matK 유전자 증폭 산물 크기는 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리에서 1, 268 bp로 동일하였으며, 독활은 1, 259 bp로 다른 종들에 비해 9 bp가 짧음을 확인하였다(Table 3). matK 유전자의 염기서열삽입/결실 구간의 정확한 위치정보를 확인하기 위해 최종 확정된 4종 16개체의 염기서열을 ClustalW 방법으로 multiple alignment하여 비교 분석한 결과, 독활의 97-99번 위치에서 ‘GAC’ 염기삽입이 존재하였으며, 150-155번과 710-715번두 위치에서 각각 ‘GTCTGA’와 ‘GACTTG’ 염기결실이 확인되었다(Table 4).
- 즉, 두 DNA 바코드 유전자 염기서열에서 나타난 G+C(%) 함량차이는 종간 변이율에 영향을 미친 것으로 보이며, 독활에서는 matK가 rbcL 보다 3배 가까이 높았으며 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리도 2배 이상 높은 수치로 나타났다. 결과적으로 염기서열 분석을 통해 나타난 DNA 바코드 구간 matK와 rbcL, 그리고 독활(獨 活) 및 혼·오용 가능성이 있는 식물 4종간의 G+C(%) 함량 값, 종간 변이율과 MN 개수 차이는 유연관계 분석을 통한 유전적 거리를 확인한 결과에서 더욱 명확하게 나타났으며, Tulipa edulis (Miq.) Baker 및 이와 동속근연종인 5종간의 DNA 바코드 분석을 통해 나타난 결과와 유사한 경향성을 보였다 29). 또한, 4종간의 유연관계는 matK 보다 rbcL에서 유전적 거리가 가까운 것을 확인할 수 있었고 두릅나무과에 속하는 독활은 미나리과에 속하는 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리가 이루는 분계와 달리 독립된 분계를 이루고 있으면서 명확하게 종단위로 유집하였다.
- 5). 그러나, 유럽당귀에서는 종 특이 MN이 단 한 곳도 존재하지 않음을 확인함으로서 rbcL 구간만을 이용한 독활(獨活) 및 혼·오용 유사품 3종을 포함한 4종을 명확하게 종단 위에서 감별하는 것이 불가능함을 확인하였다. rbcL 구간에 위치하는 독활 종 특이적 염기치환 MNe 정렬된 염기의 28번 위치(G→A)를 시작으로 4 위치에 존재하고 있었으며, G→T 2개 위치, G→C 2개 위치, C→T 10개 위치, C→A 4 개 위치, A→T 1개 위치, A→C 5개 위치, A→G 5개 위치, T →A 1개 위치, T→C 6개 위치 및 T→G 1개 위치의 형태로 존재하였고, 삽입/결실 MNe 1433-1438번 위치의 ‘CTAATT’ 염기결실 1개가 존재하였다.
- 독활, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리 4종 16개체의 matK, rbcL 각 DNA 바코드 구간 염기서열과 과(family)가 다른 V. californica를 outgroup으로 종간 유연관계를 분석한 결과, matK 유전자는 독활, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리가 bootstrap value 97 이상에서 각각의 종단위로 clade 를 형성하며 유집되는 것을 확인하였다(Figure 1). 또한, 중치 모 당귀, 유럽당귀 및 어수리 3종이 유전적으로 가깝게 유집되어 독활과 독립된 하나의 분계조를 형성하였다.
- rbcL 유전자의 유연관계 분석결과, matK 유전자와 마찬가지로 4종이 bootstrap value 95 이상에서 각각의 종단위로 clade를 형성하며 유집이 되었는데, 이는 미나리과(Apiaceae)에 속하는 중치 모 당귀, 유럽당귀 및 어수리와 두릅나무과(Araliaceae)에속하는 독활이 각각 독립된 분계조를 형성하였다(Figure 2). 따라서 4종간의 유연관계 분석은 두 DNA 바코드 구간 모두 종단 위 clade 형성으로 종 감별을 위한 방법으로 활용이 가능할 수 있으나, 종간 유전적 거리에서 보다 명확하게 차이를 보인 matK를 이용하는 것이 rbcL보다 유리하다는 것을 보여준다.
- ) Baker 및 이와 동속근연종인 5종간의 DNA 바코드 분석을 통해 나타난 결과와 유사한 경향성을 보였다 29). 또한, 4종간의 유연관계는 matK 보다 rbcL에서 유전적 거리가 가까운 것을 확인할 수 있었고 두릅나무과에 속하는 독활은 미나리과에 속하는 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리가 이루는 분계와 달리 독립된 분계를 이루고 있으면서 명확하게 종단위로 유집하였다. 이는 독활, 중치모당귀, 유럽 당귀 및 어수리를 대상으로 한 rDNA-ITS 구간의 종간 변이율, MN 및 유연관계를 보고한 김 등6)의 연구결과와 유사한 결과이지만, 핵 내에 위치하는 rDNA-ITS 구간과 달리 엽록체에 위치한 matK와 rbcL의 염기서열을 기반으로 보고된 연구결과는 전무하기 때문에 기 보고된 sequence characterized amplified region (SCAR) 마커 또는 multiplex-SCAR 마커개발과 함께 독활(獨活) 및 독활(獨活) 혼·오용 종들의 엽록체 게놈을 이용한 종 단위로 감별 할 수 있는 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- . 본 연구에서 사용한 matK와 rbcL 구간은 CBOL에서 권장하는 DNA 바코드로 독활, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리 4종 모두에서 적용 가능하였으며, 확보된 염기서열의 분석을 통해 rbcL이 matK 보다 G+C(%) 함량이 10% 이상 높음을 확인한 결과는 조구등 (釣鉤藤)으로 이용되는 Uncaria 동속 5종을 대상으로 한 분석에서 나타난 결과나 파두(巴豆) 기원종인 Croton tiglium L.과 동속근연종인 11종의 분석결과와 유사하였다27-28).
- rbcL 유전자 증폭산물의 크기는 중 모치 당귀, 유럽당귀 및 어수리는 1, 503 bp로 동일한 반면 독활은 1, 497 bp로 확인되었다(Table 3). 이들 염기서열을 multiple alignment하여 비교한 결과, 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리와는 달리 독활의 1433-1438번 위치에서 ‘CTAATT’ 염기결실이 존재함을 확인되었다(Table 5).
- continentalis_AT에서 염기변이가 발생되었기 때문으로 확인되었다. 종간 변이율(inter-species variability)을 확인한 결과에서도 matK 유전자는 독활이 9.23%로 가장 높았으며, 그 다음으로 어수리 3.87%, 중치모당귀 3.72% 그리고 유럽 당귀 3.68% 순서였다(Table 3). rbcL 종간 변이율에서도 독활이 3.
- 독활 특이적인 삽입/결실에 의해 확인되는 MN는 97-99번 위치의 ‘GAC’ 염기삽입 위치 1곳, 150-155번 ‘GTATGA’와 710-715번 ‘GACTTG’ 위치에서 나타난 염기결실 2곳이었다. 중치모당귀 종 특이적인 염기치환 MNe 219번과 435번 위치(G→A) 그리고 801번 위치(A→C) 3곳에서 확인되었고, 유럽당귀는 26번 위치(A→T), 771번 위치 (C→G), 810번과 1207번 위치(T→A) 4곳에서 확인되었다. 또한, 어수리의 MNe 76번 위치(T→G), 262번 위치(G→C), 630번 위치(C →G), 721번과 732번 위치(G→A), 938번 위치(A/C→T), 973번 위치(C→T) 그리고 1221번 위치(G→T) 8곳에서 확인되었다.
- matK 유전자의 MN 분석 결과, 독활에서는 101개 위치의 염기치환 및 3개 위치의 삽입/결실을 포함하여 총 104곳의 MN이 확인되었고, 중치모당귀, 유럽 당귀 및 어수리에서의 염기치환은 각각 3개 위치, 4개 위치, 그리고 7개 위치가 각각의 종에서 확인되었으나 삽입/결실은 3종 모두 확인되지 않았다 (Table 4). 즉 독활 감별에 활용 가능한 종 특이적 MNe 정렬된 염기의 73번 위치에서 발생한 G→A 염기치환이 matK 유전자 전체에서 17개 위치에서 확인되었으며, 그 외에도 G→C 염기치환 4개 위치, G→T 염기치환 6개 위치, C→A 염기치환 9개 위치, C→T 염기치환 13개 위치, C→G 염기치환 1개 위치, A→T 염기치환 2개 위치, A→G 염기치환 11개 위치, A→C 염기치환 12개 위치, T→A 염기 치환 6개 위치, T→G 염기치환 5개 위치 그리고 T→C 염기 치환 15개 위치 등 총 101개 위치에서 확인되었다(Table 4). 독활 특이적인 삽입/결실에 의해 확인되는 MN는 97-99번 위치의 ‘GAC’ 염기삽입 위치 1곳, 150-155번 ‘GTATGA’와 710-715번 ‘GACTTG’ 위치에서 나타난 염기결실 2곳이었다.
- 이러한 연구보고는 유전자를 이루는 염기구성에서 G+C(%) 함량의 차이가 염기치환 및 삽입/결실과 같은 변이율 차이에 영향을 주는 것과의 상관관계를 보여주며27-28), 본 연구결과에서 확인된 MNe rbcL에서 49곳으로 matK의 119곳과 비교하면 41%에 불과했다(Table 4-5). 즉, 두 DNA 바코드 유전자 염기서열에서 나타난 G+C(%) 함량차이는 종간 변이율에 영향을 미친 것으로 보이며, 독활에서는 matK가 rbcL 보다 3배 가까이 높았으며 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리도 2배 이상 높은 수치로 나타났다. 결과적으로 염기서열 분석을 통해 나타난 DNA 바코드 구간 matK와 rbcL, 그리고 독활(獨 活) 및 혼·오용 가능성이 있는 식물 4종간의 G+C(%) 함량 값, 종간 변이율과 MN 개수 차이는 유연관계 분석을 통한 유전적 거리를 확인한 결과에서 더욱 명확하게 나타났으며, Tulipa edulis (Miq.
후속연구
- 또한, 최근 들어 전통적으로 사용되고 있는 한약재의 효능을 과학적으로 평가하는 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 중국에서 기원 식물로 사용되고 있는 중치모당귀가 류마티즘, 항염증, 진통제, 구충제 및 항암 등의 치료제로 효과가 있다는 연구 보고와 한국의 기원식물인 독활이 요통, 두통 및 류마티즘에 효과적이라는 연구 보고에 반해, 유럽당귀 및 어수리에 대한 효능 특성 평가 연구는 아직 보고된 바 없어 이들 4종의 약리적 효과를 비교하는 것은 아직까진 불가능하여 이들 2종을 독활(獨 活)의 대체품으로 이용하기에는 무리가 있다18-22). 그러므로 약재시장에서 독활(獨活)로 유통될 수 있지만 약효 동등성이 확인되지 않은 이들 4종간의 종 단위 감별을 위한 유전자 분석 연구는 필요하다.
- DNA 바코드 분석은 모든 생물에 공통적으로 존재하는 nuclear ribosomal RNA gene internal transcribed spacer (rDNA-ITS), 진핵생물에 존재하는 미토콘드리아 유전자 cytochrome c oxidase 1 (COI1), 그리고 식물계 특이적으로 존재하는 엽록체 게놈의 matK 및 rbcL 등이 생물종에 따라 적용 가능한 범용성 유전자 구간으로 이용되고 있으며, 이를 통해 종을 동정하고 계통분류학적 근연관계를 분석하는 것이 가능하다11-13). 또한, 이렇게 전 세계적으로 진행되고 있는 DNA 바코드 연구결과는 국제생물 바코드 컨소시엄(CBOL, Consortium for Barcode of Life)에서 DB화하여 실시간 모니터링이 가능하기 때문에 종 동정 및 감별에 가장 적합한 DNA 바코드 구간 및 primer 정보를 활용할 수 있다. CBOL에서 권장하는 식물 DNA 바코드 구간으로는 엽록체에 존재하는 matK와 rbcL 두 유전자가 있다11).
- 또한, 4종간의 유연관계는 matK 보다 rbcL에서 유전적 거리가 가까운 것을 확인할 수 있었고 두릅나무과에 속하는 독활은 미나리과에 속하는 중치모당귀, 유럽당귀 및 어수리가 이루는 분계와 달리 독립된 분계를 이루고 있으면서 명확하게 종단위로 유집하였다. 이는 독활, 중치모당귀, 유럽 당귀 및 어수리를 대상으로 한 rDNA-ITS 구간의 종간 변이율, MN 및 유연관계를 보고한 김 등6)의 연구결과와 유사한 결과이지만, 핵 내에 위치하는 rDNA-ITS 구간과 달리 엽록체에 위치한 matK와 rbcL의 염기서열을 기반으로 보고된 연구결과는 전무하기 때문에 기 보고된 sequence characterized amplified region (SCAR) 마커 또는 multiplex-SCAR 마커개발과 함께 독활(獨活) 및 독활(獨活) 혼·오용 종들의 엽록체 게놈을 이용한 종 단위로 감별 할 수 있는 자료로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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