본 연구는 "축산물의 가공기준 및 성분규격"에 기준규격은 설정되어 있지 않으나, 국제 기준과의 조화를 위해 규격 신설 검토 대상 성분인 비오틴의 분석법을 마련하고자 수행하였다. 조제유류에 미량으로 함유된 비오틴함량 분석을 위해 선택성과 정밀성이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다. 비오틴 표준품을 이용하여 LC-MS/MS를 이용한 기기분석조건을 확립하고, 식품의 기준 및 규격 분석법을 참고로 0.01 M 인산이수소칼륨(pH 4.8) 용액을 이용하여 시료중의 비오틴을 추출하여 분석하였다. 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다. 5~60 ng/mL의 농도범위에서 $R^2=0.999$ 이상의 우수한 직선성을 확인할 수 있었으며, LOD와 LOQ는 각각 0.10, 0.31 ng/mL 이었다. CRM (NIST SRM 1849a) 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 검토하였으며, CRM에서 103%, 조제분유에서 101~104%, 조제우유에서 99~101%의 회수율을 확인할 수 있었다. 정밀성을 검토한 결과 시료 채취량에 따른 상대표준편차가 조제분유 0.4~0.9%, 조제우유1.4~1.6%로 확인하였으며, 실험일자에 따른 재현성은 조제분유에서 1.3%, 조제우유에서 1.2%로 확인하였다. 본 연구에서 확립된 분석법을 적용하여 조제분유 39건, 조제우유 3건, 성장기용조제분유 23건 등 국내 유통중인 조제유류 65건에 대해 적용성 검토를 실시한 결과 전체시료에서 분석이 용이하였으며, 모두 표시기준에 적합함을 확인하였다.
본 연구는 "축산물의 가공기준 및 성분규격"에 기준규격은 설정되어 있지 않으나, 국제 기준과의 조화를 위해 규격 신설 검토 대상 성분인 비오틴의 분석법을 마련하고자 수행하였다. 조제유류에 미량으로 함유된 비오틴함량 분석을 위해 선택성과 정밀성이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다. 비오틴 표준품을 이용하여 LC-MS/MS를 이용한 기기분석조건을 확립하고, 식품의 기준 및 규격 분석법을 참고로 0.01 M 인산이수소칼륨(pH 4.8) 용액을 이용하여 시료중의 비오틴을 추출하여 분석하였다. 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다. 5~60 ng/mL의 농도범위에서 $R^2=0.999$ 이상의 우수한 직선성을 확인할 수 있었으며, LOD와 LOQ는 각각 0.10, 0.31 ng/mL 이었다. CRM (NIST SRM 1849a) 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 검토하였으며, CRM에서 103%, 조제분유에서 101~104%, 조제우유에서 99~101%의 회수율을 확인할 수 있었다. 정밀성을 검토한 결과 시료 채취량에 따른 상대표준편차가 조제분유 0.4~0.9%, 조제우유1.4~1.6%로 확인하였으며, 실험일자에 따른 재현성은 조제분유에서 1.3%, 조제우유에서 1.2%로 확인하였다. 본 연구에서 확립된 분석법을 적용하여 조제분유 39건, 조제우유 3건, 성장기용조제분유 23건 등 국내 유통중인 조제유류 65건에 대해 적용성 검토를 실시한 결과 전체시료에서 분석이 용이하였으며, 모두 표시기준에 적합함을 확인하였다.
This study was conducted to establish the standard method for the contents of biotin in milk formulas. To optimize the method, we compared several conditions for liquid extraction, purification and instrumental measurement using spiked samples and certified reference material (NIST SRM 1849a) as tes...
This study was conducted to establish the standard method for the contents of biotin in milk formulas. To optimize the method, we compared several conditions for liquid extraction, purification and instrumental measurement using spiked samples and certified reference material (NIST SRM 1849a) as test materials. LC-MS/MS method for biotin was established using $C_{18}$ column and binary gradient 0.1% formic acid/acetonitrile, 0.1% formic acid/water mobile phase is applied for biotin. Product-ion traces at m/z 245.1 ${\rightarrow}$ 227.1, 166.1 are used for quantitative analysis of biotin. The linearity was over $R^2=0.999$ in range of $5{\sim}60{\mu}g/L$. For purification, chloroform was used as a solvent for eliminating lipids in milk formula. The linearity was over 0.999 in range of 5~60 ng/mL. The detection limit and quantification limit were 0.10, 0.31 ng/mL. The accuracy and precision of LC-MS/MS method using CRM were 103%, 2.5% respectively. Optimized methods were applied in sample analysis to verify the reliability. All the tested milk formulas were acceptable contents of biotin compared with component specification and standards for nutrition labeling. The standard operating procedures were prepared for biotin to provide experimental information and to strengthen the management of nutrient in milk formula.
This study was conducted to establish the standard method for the contents of biotin in milk formulas. To optimize the method, we compared several conditions for liquid extraction, purification and instrumental measurement using spiked samples and certified reference material (NIST SRM 1849a) as test materials. LC-MS/MS method for biotin was established using $C_{18}$ column and binary gradient 0.1% formic acid/acetonitrile, 0.1% formic acid/water mobile phase is applied for biotin. Product-ion traces at m/z 245.1 ${\rightarrow}$ 227.1, 166.1 are used for quantitative analysis of biotin. The linearity was over $R^2=0.999$ in range of $5{\sim}60{\mu}g/L$. For purification, chloroform was used as a solvent for eliminating lipids in milk formula. The linearity was over 0.999 in range of 5~60 ng/mL. The detection limit and quantification limit were 0.10, 0.31 ng/mL. The accuracy and precision of LC-MS/MS method using CRM were 103%, 2.5% respectively. Optimized methods were applied in sample analysis to verify the reliability. All the tested milk formulas were acceptable contents of biotin compared with component specification and standards for nutrition labeling. The standard operating procedures were prepared for biotin to provide experimental information and to strengthen the management of nutrient in milk formula.
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문제 정의
본 연구는 「축산물의 가공기준 및 성분규격」에 기준규격은 설정되어 있지 않으나, 국제 기준과의 조화를 위해 규격 신설 검토 대상 성분인 비오틴의 분석법을 마련하고자 수행하였다. 조제유류에 미량으로 함유된 비오틴 함량 분석을 위해 선택성과 정밀성이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다.
제안 방법
LC-MS/MS를 이용한 비오틴 분석법에 대한 유효성을 검증하기 위하여 AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시하는 방법을 참고하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection)와 정량한계(limit of quantification)를 구하였다. 직선성을 확인하기 위하여 5, 15, 30, 45, 60 ng/mL의 비오틴 표준용액을 LC-MS/MS로 측정하여 얻은 각각의 피크 면적으로부터 검량선을 작성하였다.
분석법 검증을 통하여 확립된 방법으로 시중에 유통 중인 조제유류 65건에 대한 비오틴 함량을 확인하였다. LCMS/MS에 주입하여 얻어진 크로마토그램에서 검출된 피크 면적을 구하고, 미리 작성한 표준 검량곡선의 회귀방정식에 대입하여 비오틴 함량을 구하였다.
검체량에 따른 반복성과 실험일자에 따른 재현성으로 정밀성을 확인하였다. 시료량을 달리 취하여 각 시료량에 따른 5회 반복 분석 결과에서 측정값에 대한 상대표준편차를 이용하여 반복성을 확인하였다.
식품공전에서 비오틴 분석법으로 사용하고 있는 육방전환밸브시스템 분석법을 조제분유에 적용하는데 있어 10 µg/L의 농도에서 정량에 필요한 S/N비 확보가 어렵고 건강기능식품공전의 미생물학적 분석법은 분석시간에 많은 시간이 소요되는 어려움이 있었다. 따라서 본 연구를 통해 보다 선택성과 분리능이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 조제유류의 비오틴 공인 분석법을 마련하고자 식품공전 및 논문 등을 참고하여 분석법을 확립하고 AOAC에서 제시하는 시험법 검증 가이드라인을 참고하여 밸리데이션을 수행한 후 시중에 유통 중인 조제유류에 대한 적용성을 확인하여 분석법을 검증하였다.
분석 칼럼으로는 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 × 100 mm, 1.7µm, Waters, USA)를 사용하여 0.1% 포름산 수용액과 0.1% 포름산 포함 아세토니트릴을 이동상으로 하는 기울기 용리 방식을 선택하여 분석하였다.
8) 용액을 이용하여 시료중의 비오틴을 추출하여 분석하였다. 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다. 5~60 ng/mL의 농도범위에서 R2 = 0.
분석법 적용성 검토를 위해 국내 유통 중인 조제유류 65건(조제분유 39건, 조제우유 3건, 성장기용조제분유 23건)에 대해 본 연구를 통해 확립한 비오틴 분석법을 적용하여 함량을 확인하였다(Table 12).
조제유류에 미량으로 함유된 비오틴 함량 분석을 위해 선택성과 정밀성이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다. 비오틴 표준품을 이용하여 LC-MS/MS를 이용한 기기분석조건을 확립하고, 식품의 기준 및 규격 분석법을 참고로 0.01 M 인산이수소칼륨(pH 4.8) 용액을 이용하여 시료중의 비오틴을 추출하여 분석하였다. 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다.
이중 생산 중단된 제품 및 수출용 제품, 품목제조 보고가 중복된 것을 제외한 나머지 제품에 대해서 국내 유가공업체 홈페이지 및 인터넷 판매 사이트를 통하여 조제분유(39건), 조제우유(3건), 성장기용조제분유(23건) 등 조제유류 65건을 구매하였다. 시료는 전처리 후 24시간 이내에 분석을 실시함을 원칙으로 하였다.
직선성을 확인하기 위하여 5, 15, 30, 45, 60 ng/mL의 비오틴 표준용액을 LC-MS/MS로 측정하여 얻은 각각의 피크 면적으로부터 검량선을 작성하였다. 정확성은 표준인 증시료(NIST SRM 1849a)와 표준물질 첨가법을 이용하여 회수율을 구하여 확인하였고, 정밀성 확인을 위해 실험일자와 시료량을 달리하여 실험하였다.
표준인증시료인 NIST사 Infant/Adult Nutritional Formula 1849a를 이용하여 비오틴의 정확성을 확인한 결과, 103%의 회수율을 나타냈다(Table 7). 조제분유와 조제우유 시료에 각기 다른 3개 농도의 표준물질을 첨가하여 분석 후 회수율을 확인하였다. 그 결과, 조제분유 시료에서 101~104%, 조제우유 시료에서 99~101% 수준의 회수율을 나타냈다(Table 8).
조제유류에 대한 비오틴의 기준·규격은 따로 설정되어있지 않아 제품의 표시값과 비교하여 함량을 확인하였다. 조제유류 제품의 영양성분 함량은 100 mL에 함유된 값으로 표시되어 있어 이를 분석 결과값과 비교하기 위하여 각각의 제품에 표시된 사용법 및 사용량에 따라 조제하였을 때의 함량값으로 환산하여 비교하였다. 그 결과 조제분유의 비오틴 함량은 표시량의 118~253%, 조제우유는 201~235%, 성장기용조제분유는 102~230% 함유되어 있어, 시중 제품 모두 ‘표시값의 80%이상 함유되어야 한다’는 표시 기준에 적합하게 관리되고 있었으며, 대체적으로 제품에 표기된 양보다 많은 양이 함유되어 있음을 확인하였다.
조제유류에 대한 비오틴의 기준·규격은 따로 설정되어있지 않아 제품의 표시값과 비교하여 함량을 확인하였다.
본 연구는 「축산물의 가공기준 및 성분규격」에 기준규격은 설정되어 있지 않으나, 국제 기준과의 조화를 위해 규격 신설 검토 대상 성분인 비오틴의 분석법을 마련하고자 수행하였다. 조제유류에 미량으로 함유된 비오틴 함량 분석을 위해 선택성과 정밀성이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다. 비오틴 표준품을 이용하여 LC-MS/MS를 이용한 기기분석조건을 확립하고, 식품의 기준 및 규격 분석법을 참고로 0.
LC-MS/MS를 이용한 비오틴 분석법에 대한 유효성을 검증하기 위하여 AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시하는 방법을 참고하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection)와 정량한계(limit of quantification)를 구하였다. 직선성을 확인하기 위하여 5, 15, 30, 45, 60 ng/mL의 비오틴 표준용액을 LC-MS/MS로 측정하여 얻은 각각의 피크 면적으로부터 검량선을 작성하였다. 정확성은 표준인 증시료(NIST SRM 1849a)와 표준물질 첨가법을 이용하여 회수율을 구하여 확인하였고, 정밀성 확인을 위해 실험일자와 시료량을 달리하여 실험하였다.
표준인증시료 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 확인하였다. 표준인증시료인 NIST사 Infant/Adult Nutritional Formula 1849a를 이용하여 비오틴의 정확성을 확인한 결과, 103%의 회수율을 나타냈다(Table 7).
대상 데이터
분석법 적용성 확인을 위해 조제유류의 품목제조보고서(1997년~2015년)와 수입신고서(2013년~2015년)를 확인하였다. 국내에 품목제조 보고된 제품은 총 309건이었으며 수입 신고된 제품은 총 59건으로 조사되었다.
비오틴 표준품은 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료의 전처리에 사용된 potassium dihydrogen phosphate, formic acid는 Sigma-Aldrich사 (St, Louis, Mo, USA), chloroform, acetonitrile은 Merck사 (White house Station, NJ, USA)로부터 HPLC 급으로 구입하여 사용하였다.
Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료의 전처리에 사용된 potassium dihydrogen phosphate, formic acid는 Sigma-Aldrich사 (St, Louis, Mo, USA), chloroform, acetonitrile은 Merck사 (White house Station, NJ, USA)로부터 HPLC 급으로 구입하여 사용하였다.
국내에 품목제조 보고된 제품은 총 309건이었으며 수입 신고된 제품은 총 59건으로 조사되었다. 이중 생산 중단된 제품 및 수출용 제품, 품목제조 보고가 중복된 것을 제외한 나머지 제품에 대해서 국내 유가공업체 홈페이지 및 인터넷 판매 사이트를 통하여 조제분유(39건), 조제우유(3건), 성장기용조제분유(23건) 등 조제유류 65건을 구매하였다. 시료는 전처리 후 24시간 이내에 분석을 실시함을 원칙으로 하였다.
데이터처리
LC-MS/MS의 분석조건에 따라 검량선의 기울기 및 표준편차를 이용하여 검출한계 및 정량한계를 구하였다. 검출한계와 정량한계는 각각 0.
검체량에 따른 반복성과 실험일자에 따른 재현성으로 정밀성을 확인하였다. 시료량을 달리 취하여 각 시료량에 따른 5회 반복 분석 결과에서 측정값에 대한 상대표준편차를 이용하여 반복성을 확인하였다. 고체 시료로써 조제분유를 5.
재현성은 3일간의 다른 일자에서 5회 반복 실험하였을 때 얻어진 결과로부터 측정값에 대한 상대표준편차를 이용하여 확인하였다. 조제분유와 조제우유에서 각각 1.
조제유류 분석법의 유효성 확인을 위해 CRM을 이용하여 실험실간 교차검증을 실시하였다. Table 11과 같이 기관별 회수율은 각각 A 기관 103%, B 기관 89%로 만족할 만한 결과를 나타내었으며 분석법의 일관성을 확인할 수 있었다.
이론/모형
1% 포름산 포함 아세토니트릴을 이동상으로 하는 기울기 용리 방식을 선택하여 분석하였다. 각 대상 성분의 이온화법으로는 electro-spray ionization (ESI)법의 positive-ion mode를 사용하였으며 LC-MS/MS 분석조건을 Table 3에 상세하게 제시하였다.
성능/효과
분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다. 5~60 ng/mL의 농도범위에서 R2 = 0.999 이상의 우수한 직선성을 확인할 수 있었으며, LOD와 LOQ는 각각 0.10, 0.31 ng/mL 이었다. CRM (NIST SRM 1849a) 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 검토하였으며, CRM에서 103%, 조제분유에서 101~104%, 조제우유에서 99~101%의 회수율을 확인할 수 있었다.
CODEX 등에서는 infant formula의 비오틴 규격을 ‘1.5 µg/100 kcal 이상’으로 정하고 있어 조제유류 비오틴 함량을 100 kcal당 함량으로도 환산하여 비교한 결과 조제분유는 2.74~8.32, 조제우유 6.30~7.26, 성장기용조제분유 4.05~10.29µg/100 kcal로 함유되어 있어 모두 제외국의 기준·규격과 비교하였을 경우에도 충분한 양을 함유하고 있음을 확인하였다.
31 ng/mL 이었다. CRM (NIST SRM 1849a) 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 검토하였으며, CRM에서 103%, 조제분유에서 101~104%, 조제우유에서 99~101%의 회수율을 확인할 수 있었다. 정밀성을 검토한 결과 시료 채취량에 따른 상대표준편차가 조제분유 0.
조제유류 분석법의 유효성 확인을 위해 CRM을 이용하여 실험실간 교차검증을 실시하였다. Table 11과 같이 기관별 회수율은 각각 A 기관 103%, B 기관 89%로 만족할 만한 결과를 나타내었으며 분석법의 일관성을 확인할 수 있었다.
시료량을 달리 취하여 각 시료량에 따른 5회 반복 분석 결과에서 측정값에 대한 상대표준편차를 이용하여 반복성을 확인하였다. 고체 시료로써 조제분유를 5.0, 7.5, 10.0 g을 취하여 실험하였으며, 액상 시료로써 조제우유를 10, 15, 20 mL 취하여 실험한 결과 조제분유와 조제우유에서 시료 채취량에 따른 상대표준편차가 각각 0.4~0.9, 1.4~1.6%로 확인되었다(Table 9).
그 결과 조제분유의 비오틴 함량은 표시량의 118~253%, 조제우유는 201~235%, 성장기용조제분유는 102~230% 함유되어 있어, 시중 제품 모두 ‘표시값의 80%이상 함유되어야 한다’는 표시 기준에 적합하게 관리되고 있었으며, 대체적으로 제품에 표기된 양보다 많은 양이 함유되어 있음을 확인하였다.
조제분유와 조제우유 시료에 각기 다른 3개 농도의 표준물질을 첨가하여 분석 후 회수율을 확인하였다. 그 결과, 조제분유 시료에서 101~104%, 조제우유 시료에서 99~101% 수준의 회수율을 나타냈다(Table 8).
본 연구에서 확립된 분석법을 적용하여 조제분유 39건, 조제우유 3건, 성장기용조제분유 23건 등 국내 유통중인 조제유류 65건에 대해 적용성 검토를 실시한 결과 전체시료에서 분석이 용이하였으며, 모두 표시기준에 적합함을 확인하였다.
분석법 검증을 통하여 확립된 방법으로 시중에 유통 중인 조제유류 65건에 대한 비오틴 함량을 확인하였다. LCMS/MS에 주입하여 얻어진 크로마토그램에서 검출된 피크 면적을 구하고, 미리 작성한 표준 검량곡선의 회귀방정식에 대입하여 비오틴 함량을 구하였다.
2에 나타내었다. 비오틴은 2개의 product ion (227.1, 166.1 m/z)에서 검출되었으며, 동일한 시간에서 단일 피크가 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한 표준품과 시료에서 MS 이온의 비가 Table 4와 같은 허용기준을 만족하는 것으로 확인 되었다.
CRM (NIST SRM 1849a) 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 검토하였으며, CRM에서 103%, 조제분유에서 101~104%, 조제우유에서 99~101%의 회수율을 확인할 수 있었다. 정밀성을 검토한 결과 시료 채취량에 따른 상대표준편차가 조제분유 0.4~0.9%, 조제우유1.4~1.6%로 확인하였으며, 실험일자에 따른 재현성은 조제분유에서 1.3%, 조제우유에서 1.2%로 확인하였다.
재현성은 3일간의 다른 일자에서 5회 반복 실험하였을 때 얻어진 결과로부터 측정값에 대한 상대표준편차를 이용하여 확인하였다. 조제분유와 조제우유에서 각각 1.3%와 1.2%로 일간 재현성을 확인하였다(Table 10).
표준인증시료 및 표준물질 첨가법을 이용하여 정확성을 확인하였다. 표준인증시료인 NIST사 Infant/Adult Nutritional Formula 1849a를 이용하여 비오틴의 정확성을 확인한 결과, 103%의 회수율을 나타냈다(Table 7). 조제분유와 조제우유 시료에 각기 다른 3개 농도의 표준물질을 첨가하여 분석 후 회수율을 확인하였다.
후속연구
본 연구를 통하여 확립된 LC-MS/MS를 이용한 조제유류 중 비오틴 분석법은 향후 신설 예정인 비오틴의 기준·규격을 관리하기 위한 분석법으로 적합함을 확인하였으며 국내 조제유류 영양성분의 관리 기반을 강화하는데 기여할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비오틴 결핍 시 어떤 증상이 나타나는가?
비오틴의 결핍은 영아나 성장기 아동에서는 성장 저하, 성인의 경우 피부염, 결막염, 탈모증, 무기력증, 우울증 등을 가져오기도 하지만2) 체내 비오틴 회로를 통해서 재사용될 수 있기 때문에 단순 결핍 증상은 거의 나타나지 않는다3).
비오틴 함량 분석 방법 중 미생물에 의한 분석법의 문제점은?
식품공전에서 비오틴 분석법으로 사용하고 있는 육방전환밸브시스템 분석법을 조제분유에 적용하는데 있어 10 µg/L의 농도에서 정량에 필요한 S/N비 확보가 어렵고 건강기능식품공전의 미생물학적 분석법은 분석시간에 많은 시간이 소요되는 어려움이 있었다. 따라서 본 연구를 통해 보다 선택성과 분리능이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용한 조제유류의 비오틴 공인 분석법을 마련하고자 식품공전 및 논문 등을 참고하여 분석법을 확립하고 AOAC에서 제시하는 시험법 검증 가이드라인을 참고하여 밸리데이션을 수행한 후 시중에 유통 중인 조제유류에 대한 적용성을 확인하여 분석법을 검증하였다.
생체 내에서 비오틴의 역할은 무엇인가?
비오틴은 황을 함유한 수용성비타민으로 생체 내 대사 과정 중 카르복실기를 제공하는 카르복실화 효소 및 탈탄산 효소의 조효소로 작용하며 아미노산으로부터 에너지 생성 및 DNA 합성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다1).
참고문헌 (15)
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