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문제 정의
- Fruits of ‘Haryejosaeng’ and ‘Shiranuhi’ mandarine in 3 different ripening stages used for investigation of gene expression in this study.
- 따라서 본 연구에서는 감귤 생육기의 기온 상승에 따른 과실 성숙 불량의 원인 구명과 전사체 수준에서의 유전자 발현 분석에 요구되는 정보를 제공하기 위하여, ‘하례조생’과 ‘부지화’ 과실을 성숙기에 따라 3단계로 구분하여 고온에 노출 시킨 후 성숙과 관련된 유전자들의 발현 양상을 분석하고자 하였다.
제안 방법
- ‘부지화’ 감귤 과실을 성숙 단계별로 고온에 유지하여 flavonoid 생합성 관련 및 STS 유전자의 따른 발현 양상을 조사하였다(Fig. 5).
- Quantitative real-time PCR 반응은 SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa Bio Inc., Japan) 제조사의 방법대로 20μL 반응액을 조제하고, C1000TM Thermal Cycler(CFX96TM Real-Time System, BioRad, USA)를 이용하였으며, 사용한 7개의 primerset은 Table 1에 나타내었다.
- RNA 분리는 Chang et al.(1993)의 소나무 RNA 추출 방법에서 1, 2차 추출 단계의 원심분리 조건을 3,200rpm, 30분으로 바꾸고, 2-mercaptoethanol의 넣는 양을 수정하여 사용하였다. 분리한 RNA(500ng)는 GoScriptTM Reverse Transcription System (Promega, USA)을 이용 하여 1st cDNA를 합성하고 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다.
- The fruits harvested at 3 stages, 120, 150, and 180 days after full blooming (DAF) in ‘Haryejosaeng’, and 150, 180, and 210 DAF in ‘Shiranuhi’ mandarin were exposed to high temperatures (White scale bars represent 1 cm).
- 가용성 고형물 함량은 과육의 손상 없이 껍질을 벗기고 착즙하여 거즈로 거른 후 굴절당도계(Digital Refractometer PAL-1, Atago, Japan)로 측정하였고, 과피의 색도는 색차계(Chroma Meter CR-300, Minolta, Japan)를 이용하여 ‘하례조생’과 ‘부지화’ 과실을 적도 부위 4군데로 나누어 Hunter L, a 및 b 값을 각각 측정하였다.
- 감귤 과실의 발달 단계별 flavonoid 생합성 및 stilbene 합성 관련 유전자들의 온도 처리에 따른 발현 양상을 분석하였다(Fig. 3). Phenylalanine ammonia-lyase(PAL) 유전자는 1단계에서는 모든 온도 처리에서 발현이 서서히 유도되는 양상이었으나, 25°C에 비해 35°C에서 억제되었다.
- 감귤(‘하례조생’) 과실을 성숙 3단계로 나누어 수확하여 온도에서 유지하면서 quantitative real-time PCR을 이용하여 beta-amylase(BMY), polygalacturonase(PG), malate dehydrogenase(MDH) 유전자의 발현양상을 분석하였다(Fig. 2).
- 반응 조건은 95°C에서 30초 후, 95°C에서 5초, 60°C에서 30초 반응을 40회 반복하였다. 발현 분석은 증폭량에 따른 형광 강도를 각 cycle 마다 측정하였고, 실험에 이용한 primer는 Table 2에 나타내었으며, 각각의 primer에 의한 발현값은 감귤 actin 유전자의 발현값에 비례하여 상대적으로 계산하였다.
- 본 연구에서는 ‘하례조생’과 ‘부지화’ 과실을 성숙 단계별로 구분하고 고온 스트레스에 노출시켜 여러 유전자들의 발현양상을 분석하였다.
- 성숙 단계에 따라 3단계로 구분하여 수확한 ‘부지화’ 과실을 이용하여 온도에 대한 성숙과 관련된 유전자의 발현 양상을 분석하였다(Figs. 4 and 5).
- 온도처리를 위한 생장상의 온도 조건은 25 ± 1°C, 30 ± 1°C, 35 ± 1°C, 상대습도 60±10%, 광조건은 16시간/8시간(광/암)이 유지되도록 하였으며, 처리 0, 6, 12, 24, 48시간 후에 각각 과실을 채취하였다.
- 온도처리를 위한 생장상의 온도 조건은 25 ± 1°C, 30 ± 1°C, 35 ± 1°C, 상대습도 60±10%, 광조건은 16시간/8시간(광/암)이 유지되도록 하였으며, 처리 0, 6, 12, 24, 48시간 후에 각각 과실을 채취하였다. 채취한 과실은 바로 8-16조각으로 자르고 고루 섞어 초저온 냉동고에 보관하고, 유전자 발현을 분석하기 위한 RNA 추출에 사용하였으며, 각 처리는 3반복으로 실시하였다.
대상 데이터
- 농촌진흥청 국립특작원예과학원 감귤연구소 시험포장에 재식 된 조생 온주밀감(C. unshiu)인 ‘하례조생’ 8년생과 만숙종 만다린 잡종인 ‘부지화’(C. reticulata) 8년생의 성목에서 과실을 각각 2014년 10월과 11월 중순에 수확하였고, 가용성 고형물 함량과 색도를 측정한 후(Table 1), 성숙단계를 3단계로 구분하여 실험에 사용하였다(Fig. 1).
성능/효과
- ‘하례조생’과 ‘부지화’의 온도처리에 의한 유전자 발현 양상을 비교해 볼 때, 유전자의 발현양은 ‘하례조생’에서 더 크게 나타났으며, 1, 2단계에서 유전자의 발현 양상은 대체적으로 비슷한 경향이었는데, ‘부지화’ 과실에서 3단계의 유전자 발현은 ‘하례조생’과는 다르게 감소하는 경향을 나타내었다.
- 1단계의 과실에서는 25°C보다 30-35°C에서 유전자의 발현이 감소하였으나, 유전자의 발현 양상은 비슷하였으며 성숙이 진행됨에 따라 25°C에 비해 고온(30-35°C)에서 유전자의 발현이 증가하는 경향이었다.
- 25°C에 비교하여 30°C에서는 발현양의 차이가 없었으나 35°C에서는 발현이 증가하였다. 3단계에서는 모든 온도 처리구에서 STS 유전자의 발현이 모두 저하되었으나, 고온에서는 시간이 경과할수록 발현이 증가하였다.
- 3단계의 과실에서는 30-35°C에서 모두 발현이 저하되었지만, 25°C에 비해 발현은 많은 것으로 나타났다.
- 2). BMY 유전자는 모든 단계에서 발현이 유도되었으며, 성숙 3단계에서는 1-2단계에 비해 모든 온도 처리에서 6시간이 경과한 후의 유전자 발현이 더 많이 유도되었다. 그러나, 25°C에 비해 30-35°C에서는 발현량이 증가하는 경향이었다.
- 그러나, 2단계의 과실에서는 25°C에 비해 고온에서 유전자의 발현은 증가하였고, 성숙 3단계에서는 온도에 따른 유전자 발현의 일정한 경향은 나타나지 않았다. CHS 유전자는 모든 온도에서 1-2단계에서는 계속 증가하는 경향이었고, 3단계에서는 초반에 감소하였다가 다시 증가하는 경향을 나타내었으나, 1-2단계의 과실에서는 고온에서 발현이 증가하였다. F3H 유전자는 25°C 처리구의 1단계에서는 초반에 감소하였다가 증가하고, 2단계에서는 처음부터 서서히 증가하는 경향이었다.
- MDH 유전자는 초기 성숙단계인 1-2단계의 과실에서는 35°C에서 발현이 억제되었으며, 성숙이 진행되면서 3단계에서는 25°C에 비해 30-35°C에서 48시간이 경과한 후 현저히 감소하였다.
- PG 유전자는 1단계에서는 시간이 경과할수록 30-35°C에서 발현이 감소하는 경향이었으며, 2단계에서는 12시간이 경과한 후 발현이 저하되고 3단계에서는 25°C에 비해 30-35°C에서 발현이 억제되었으며, 특히 35°C에서는 발현이 현저하게 억제되었다.
- Phenylalanine ammonia-lyase(PAL) 유전자는 1단계에서는 모든 온도 처리에서 발현이 서서히 유도되는 양상이었으나, 25°C에 비해 35°C에서 억제되었다.
- 과실의 성숙이 진행되면서 고온에서 유전자의 발현이 억제되었으며 3단계에서는 고온인 35°C에서 발현이 크게 억제되었다.
- 또 CHS 유전자의 경우에는 3개의 온도 조건에서 유전자의 발현이 유도 되는 경향이었으나 성숙 2단계의 ‘부지화’에서는 CHS 유전자의 발현이 감소하였다가 증가하는 경향을 보였다.
- 본 실험에서 ‘하례조생’에서는 PAL 유전자는 35°C(2, 3단계)에서, ‘부지화’에서는 30°C(2단계)에서 발현이 크게 유도되는 경향을 보였다.
- 본 연구에서 MDH 유전자는 1단계에서는 ‘하례조생’과 ‘부지화’에서 증가하는 경향이었으나, 성숙이 진행되면서 2, 3단계에서 두 품종에서 서로 다른 반응을 나타내었다.
- 본 연구의 결과에서 ‘하례조생’과 ‘부지화’의 BMY 유전자는 애기장대의 BAM1 유전자와 비슷하게 30-35°C 처리구에서 발현이 유도되는 경향을 나타내었다.
- 성숙 1단계의 과실에서는 25°C에 비해 고온에서 유전자의 발현이 증가하였고, 35°C에서는 높은 수준의 발현이 유지되었으나, 30°C에서는 24시간이 경과하면서 발현이 현저히 감소하였다.
- 성숙 3단계에서는 30°C에서는 12시간까지 발현이 증가하였다가 24시간에 감소하고, 48시간에 다시 증가하는 경향을 나타내었고, 35°C 처리구는 6시간과 24시간에서 2개의 정점을 보이고 48시간에서 발현이 크게 감소하였다.
- 이러한 보고와 유사하게 본 연구에서도 PG 유전자의 발현은 두 품종 모두에서 전체적으로 감소되는 경향이었고, 시간이 경과할수록 25-30°C에서 보다 35°C의 고온에서 크게 감소하였다.
후속연구
- 본 연구에서는 ‘하례조생’과 ‘부지화’ 과실을 성숙 단계별로 구분하고 고온 스트레스에 노출시켜 여러 유전자들의 발현양상을 분석하였다. 이러한 연구 결과는 고온 스트레스와 관련된 다양한 생리현상을 전사체 분석을 통한 유전자 발현 수준에서 구명하고, 전사체 기반의 유용 유전자들을 대량 발굴하여 분자생물학적 연구에 도입함으로써 기후변화에 대응할 수 있는 재배법을 확립하고 고온에 내성인 신품종을 육성하는 데 중요한 자료로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
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