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문제 정의
- , 2011). 따라서 본 연구에서는 pronase E 젤라틴 가수분해물이 MMP-2 효소 활성화를 직접 저해할 수 있는 지 in vitro 실험을 실행하였다. 그 결과, Pronase E 가수분해물 처리를 하지 않은 대조구와 비교하였을 때, pronase E 가수분해물 처리는 MMP-2 효소의 활성을 유효하게 억제함을 확인하였다(Fig.
- 또한 고가의 치료비 때문에 모든 국가에서 항레트로바이러스제의 주기적인 투약이 가능한 것은 아니며, 사망자의 1/3 이 경제성장이 없고 빈곤이 극심한 아프리카나 동남아시아 등 저개발국가에 집중되어 있다는 점을 고려할 때 AIDS의 예방 및치료 방법이 더욱 더 다양화될 필요가 있다. 본 연구팀은 AIDS 치료제로 이용될 수 있는 무독성이면서 저가로 이용될 수 있는 후보물질을 발굴하기 위하여 수산물 유래 소재로부터 AIDS 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 물질을 검색하고 분리하여 작용기작을 규명하는 연구를 수행해 왔으며, 본 연구에서는 제품화를 위한 가공공정에서 대량으로 폐기되고 있는 명태 껍질의 젤라틴을 효소로 가수분해하여 그 가수분해물의 항 HIV-1 저해 효능을 탐색하였다.
제안 방법
- 1차 항 HIV-1 활성 평가는 사람의 T 세포 MT-4 세포에 100 TCID50의 HIV-1ⅢB 용액과 함께 각 효소 가수분해물을 농도별로 첨가하여 3일간 배양한 후 HIV-1 감염에 의해 일어나는 MT-4 세포의 병변효과를 억제하는 정도를 측정하여 결정하였다. Pronase E에 의해 가수분해된 젤라틴 가수분해물이 가장 높은 항 HIV-1 저해활성을 보여 0.
- 0×104 cells/well로 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 100 TCID50의 HIV-1ⅢB 50 µL와 시료를 농도별로 100 µL씩 넣어 37℃, 5% CO2로 유지된 배양기에서 3일간 배양하였다. 3일 후 세포 상등액 중의 HIV 양은 Lenti-X p24 rapid titer kit (Clontech, USA)를 사용하여 결정하였다.
- HIV-1 역전사효소(Reverse Transcriptase, RT) 억제활성 실험은 RT-DetectTM kit NEK-070A (Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 효소는 유전자 재조합에 의해 생산된 HIV-1 RT (10 U/µL, 100 mM potassium phosphate, pH 7.
- 즉 pronase E에 의한 명태 껍질 유래 젤라틴 가수분해물의 AIDS의 예방 및 치료제로서의 활용 가능성을 연구하기 위해서는 우선 사람의 면역세포에 대한 무독성이 확인되어야 한다. MT-4 세포에 대한 pronase E 젤라틴 가수분해물의 세포생존율을 조사하였다. 그 결과 본 연구에서 사용된 최고농도인 1 mg/mL의 pronase E 젤라틴 가수분해물은 MT-4 세포에 대해 72 시간 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig.
- MTT 시험은 MTT cell proliferation kit I (Boehringer Man- neim, Bernd Meyer, Ottweiler, Germany)을 사용하여 실행하였다. 96 well plate에 농도별로 희석된 시료와 바이러스액을 혼합하여 3일간 배양하고 세포 상층액을 100 µL씩 제거 한 후 각 well에 20 µL의 MTT 용액(final concentration 0.
- 각 효소가수분해물의 단백질 함량은 Pierce® BCA protein assay kit (Rockford, 95 IL, USA)를 사용하여 측정하였고, 단백질 정량의 표준물질은 BSA를 사용하였다.
- 파괴하고 세포 병변효과를 나타낸다. 따라서 가수분해물의 1차 항 HIV-1 활성은 HIV-1ⅢB 감염에 의한 MT-4 세포의 세포병변 억제능을 확인하여 측정하였다. MT-4 세포를 96 well plate에 1.
- 그 외의 효소가수분해물은 항 HIV-1 활성 이거의 나타나지 않았다. 따라서 단백질 함량이 높으면서 항 HIV- 1 저해활성이 나타난 pronase E 에 의한 명태 껍질 유래 젤라틴 가수분해물을 이용하여 항 HIV-1 활성을 추가 검토하였다.
- 명태 껍질 유래 젤라틴을 가수분해하기 위해 4종의 단백질분해효소(alcalase, flavourzyme, neutrase 및 pronase E)를 사용하였으며 항 HIV-1 활성이 높은 효소가수분해물을 선별하기 위하여 각 효소가수분해물의 단백질 함량 확인과 MTT법을이용한 항 HIV-1 활성을 검토하였다(Table 1). 명태 껍질 젤라틴 1 g으로부터 얻어진 총 단백질 양을 확인한 결과 alcalase와 pronase E의 경우 101.
- HIV-1 바이러스는 H9/HIV-1ⅢB 세포의 배양 상층 액으로부터 수확하여 -80℃에 보관하고 실험직전에 37℃에 녹여 사용하였다. 바이러스 역가는 희석된 바이러스액을 MT-4 세포에 감염시키고 3일간 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 다음 생성된 p24 항원의 수를 측정하여 결정하였다.
- 반응을 마치고 microplate well에 남은 시약이나 가수분해된 RNA를 제거하기 위해 세척액(2-chloroacetamide 용액 20X)을 물로 희석하여 3회 세척하였다. 세척한 micro plate에 형광검출액(3, 3, 5, 5-tetramethylbenzidine substrate 용액) 100 µL를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 정지액 (2.2%citricacid, 1.5% HCl, 1.5% sulfuric acid and 94.8% water) 100 µL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 spectrophotom-eter로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며 억제율의 계산은 다음과 같이 하였다.
- 각 well에 100 µL DMSO (dimethyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 기형성된 짙은 청색의 결정체인 formazan을 완전히 녹인 후에 microplate reader로 흡광도(test wavelength 550 nm, refer- ence wavelength 690 nm)를 측정하였다. 시료의 항 HIV-1 활성 평가는 HIV-1ⅢB에 감염된 세포군 및 비감염 대조 세포군의 흡광도를 기준으로 억제 정도를 측정한 후 결정하였다.
- 0×104 cells/well로 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후에 시료를 농도별로 희석하여 3일간 배양하고 550/690 nm에서의 흡광도 차이에 의해 살아있는 세포를 측정하는 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시험법으로 50% 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)가 나타나는 농도(CD50)를 산출하여 세포독성을 측정하였다.
- 젤라틴 가수분해물은 분말 젤라틴(1% w/v)에 4가지 단백질가수분해 효소(alcalase, flavourzyme, neutrase 및 pronase E) 를 효소 대 기질 비를 1:50으로 첨가하고, 각 효소별 최적 온도 및 최적 pH 조건에서 12시간 동안 반응시켰으며 100℃에서 10 분간 효소의 반응을 불활성화시킨 후 pH를 7.0으로 조정해 주었다. 이후 20분간 원심분리한 뒤 상층액을 pore size 7 µm의 여과지를 사용하여 여과하고 동결건조 후 분말화하여 최종적으로 젤라틴 효소가수분해물을 얻었다.
대상 데이터
- 시료로 사용된 명태 껍질은 부산공동어시장에서 구입하여 -20℃에 저장하고 사용하였으며, 젤라틴의 가수분해물 제조를 위해 사용한 3종의 효소(alcalase, flavourzyme, neutrase)는 Novozyme Co. (Denmark)에서 그리고 pronase E는 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 항 HIV-1 활성을 in vitro 에서 검색하기 위해 MT-4와 H9/ HIV-1ⅢB 세포를 NIH AIDS Reagent Program (Germantown, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 모든 세포는 10% fetal bo- vine serum (FBS, Thermo Scientific, USA), 50 µg/mL strep- tomycin, 50 U/mL penicillin (PAA, USA)이 첨가된 RPMI- 1640 (Thermo Scientific, USA) 배지에서 계대 배양하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균±표준편차를 나타내었다. SPSS 프로그램(SPSS Inc. Ver. 12.0)을 사용하여 1-way ANOVA test를 실시하여 조사 항목들 간의 유의성 검증은 Duncan의 다중위 검정으로 P<0.05 수준에서 실시하였다.
- 실험결과의 통계처리는 각각의 시료에 대한 평균±표준편차를 나타내었다. SPSS 프로그램(SPSS Inc.
이론/모형
- MMP-2 assay kit (BIOMOL, PA, USA)의 방법에 따라서 측정하였다. 즉, 68 µL의 반응 buffer와 시료 2 µL가 담겨 있는 well에 20 µL의 MMP-2을 첨가하여 37℃에서 60분간 반응하였다.
- 0×104 cells/well로 분주하여 배양하고 각 well 에 100 TCID50의 HIV-1ⅢB을 50 µL씩 첨가한 후 시료를 농도별로 100 µL씩 넣어 37℃, 5% CO2로 유지된 배양기에서 3일간 배양하였다. 시료의 항 HIV-1 활성은 MTT 시험법으로 평가하였다.
성능/효과
- 2006). Pronase E에 의한 명태 껍질 유래 젤라틴 가수분해물의 HIV-1역전사효소 억제 활성 능력을 조사하였으며 그 결과 pronase E) 젤라틴 가수분해물은 농도 의존적으로 HIV-1 역전사효소활성을 억제하여 IC50 값은 0.54±0.07 mg/mL으로 확인되었다(Fig. 2A). 또한 HIV-1에 감염되어 생산되는 바이러스양ep24 항원의 양으로 측정하였으며, Fig.
- Pronase E에 의해 가수분해된 젤라틴 가수분해물이 가장 높은 항 HIV-1 저해활성을 보여 0.57±0.16 mg/mL의 IC50 값을 가졌으며 alcalase 가수분해 효소물은 0.92±0.74 mg/mL의 IC50 값을 가졌다. 그 외의 효소가수분해물은 항 HIV-1 활성 이거의 나타나지 않았다.
- 84 mg/mL로 측정되었다. 결과적으로 HIV-1ⅢB 감염에 의한 MT-4 세포의 병변효과, 역전사효소 활성화 그리고 p24 항원 생성을 pronase E 젤라틴 가수분해물은 농도 의존적으로 억제할 수 있음이 확인되었다.
- MT-4 세포에 대한 pronase E 젤라틴 가수분해물의 세포생존율을 조사하였다. 그 결과 본 연구에서 사용된 최고농도인 1 mg/mL의 pronase E 젤라틴 가수분해물은 MT-4 세포에 대해 72 시간 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1).
- 따라서 본 연구에서는 pronase E 젤라틴 가수분해물이 MMP-2 효소 활성화를 직접 저해할 수 있는 지 in vitro 실험을 실행하였다. 그 결과, Pronase E 가수분해물 처리를 하지 않은 대조구와 비교하였을 때, pronase E 가수분해물 처리는 MMP-2 효소의 활성을 유효하게 억제함을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 명태 껍질 유래 젤라틴 효소가수분해물이 면역세포 내에서도 MMP-2 효소 활성화를 저해하고 기저막의 콜라겐 재생을 유도함으로써 HIV-1 감염 억제 효과를 나타낼 수 있었을 것으로 생각되며 명확한 메커니즘 규명을 위해서는 pro- nase E 가수분해물 처리 이후의 세포 내 MMP-2 단백질 발현 및 활성 변화와 콜라겐의 생성량의 변화 등에 관한 후속 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 2A). 또한 HIV-1에 감염되어 생산되는 바이러스양ep24 항원의 양으로 측정하였으며, Fig. 2B의 결과는 HIV-1 감염에 의해 생성되는 p24 항원이 pronase E 젤라틴 가수분해물의 농도에 의존하여 감소함을 나타내어 IC50 값은 0.59±0.84 mg/mL로 측정되었다. 결과적으로 HIV-1ⅢB 감염에 의한 MT-4 세포의 병변효과, 역전사효소 활성화 그리고 p24 항원 생성을 pronase E 젤라틴 가수분해물은 농도 의존적으로 억제할 수 있음이 확인되었다.
- 항 HIV-1 활성을 검토하였다(Table 1). 명태 껍질 젤라틴 1 g으로부터 얻어진 총 단백질 양을 확인한 결과 alcalase와 pronase E의 경우 101.42±8.12 mg과 89.71±4.46 mg의 단백질 양으로 다른 효소가수분해물 보다 높은 단백질 함량을 가지고 있는 것이 확인되었다.
후속연구
- 판단된다. 또한 젤라틴 효소가수분해물의 경우 체내 흡수율이 높아 관련 감염 저항성 식품소재와 천연 의약소재 등으로도 이용될 수도 있을 것으로 사료된다
- 3). 이러한 결과는 명태 껍질 유래 젤라틴 효소가수분해물이 면역세포 내에서도 MMP-2 효소 활성화를 저해하고 기저막의 콜라겐 재생을 유도함으로써 HIV-1 감염 억제 효과를 나타낼 수 있었을 것으로 생각되며 명확한 메커니즘 규명을 위해서는 pro- nase E 가수분해물 처리 이후의 세포 내 MMP-2 단백질 발현 및 활성 변화와 콜라겐의 생성량의 변화 등에 관한 후속 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 요약해 보면, 명태 껍질 유래 젤라틴의 pronase E 가수분해물은 사람면역 T 세포에 대해 무독성이며 HIV-1 감염에 대해 상당한 저항적 효과가 있어 향후 가수분해물을 정제하고 분리하여 항 HIV-1 활성이 더욱 더 높은 펩타이드를 얻음으로써 AIDS 예방 및 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 젤라틴 효소가수분해물의 경우 체내 흡수율이 높아 관련 감염 저항성 식품소재와 천연 의약소재 등으로도 이용될 수도 있을 것으로 사료된다
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