본 연구에서는 소나무(Pinus densiflora)와 아로니아(Aronia melanocarpa)의 잎을 채취하여 표면살균한 후 내생균을 분리하였다. 분리한 균주는 형태적 특징과 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 ${\beta}-tubulin$ 유전자의 염기서열을 이용하여 계통분석을 통해 동정하였다. 소나무에서 분리한 두 종의 균주인 Pestalotia lawsoniae와 Zasmidium fructicola, 그리고 아로니아에서 분리한 세 종의 균주인 Pestalotiopsis chamaeropis, Pestalotiopsis jesteri, Stagonosporopsis cucurbitacearum는 국내 미기록 진균으로 보고하고자 한다.
본 연구에서는 소나무(Pinus densiflora)와 아로니아(Aronia melanocarpa)의 잎을 채취하여 표면살균한 후 내생균을 분리하였다. 분리한 균주는 형태적 특징과 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 ${\beta}-tubulin$ 유전자의 염기서열을 이용하여 계통분석을 통해 동정하였다. 소나무에서 분리한 두 종의 균주인 Pestalotia lawsoniae와 Zasmidium fructicola, 그리고 아로니아에서 분리한 세 종의 균주인 Pestalotiopsis chamaeropis, Pestalotiopsis jesteri, Stagonosporopsis cucurbitacearum는 국내 미기록 진균으로 보고하고자 한다.
The leaves of two woody plant species, Pinus densiflora and Aronia melanocarpa, were collected in Korea, and endophytic fungi were isolated from these surface-sterilized leaves. The fungal isolates were identified based on their morphological characteristics and the results of the phylogenetic analy...
The leaves of two woody plant species, Pinus densiflora and Aronia melanocarpa, were collected in Korea, and endophytic fungi were isolated from these surface-sterilized leaves. The fungal isolates were identified based on their morphological characteristics and the results of the phylogenetic analysis involving nucleotide sequences of the internal transcribed spacer region (ITS), including 5.8S rDNA, D1/D2 regions of 28S rDNA, and ${\beta}-tubulin$ genes. Pestalotia lawsoniae and Zasmidium fructicola were isolated from Pinus densiflora, and three species, Pestalotiopsis chamaeropis, Pestalotiopsis jesteri, and Stagonosporopsis cucurbitacearum were isolated from Aronia melanocarpa. To the best of our knowledge, these species have not been previously reported in Korea.
The leaves of two woody plant species, Pinus densiflora and Aronia melanocarpa, were collected in Korea, and endophytic fungi were isolated from these surface-sterilized leaves. The fungal isolates were identified based on their morphological characteristics and the results of the phylogenetic analysis involving nucleotide sequences of the internal transcribed spacer region (ITS), including 5.8S rDNA, D1/D2 regions of 28S rDNA, and ${\beta}-tubulin$ genes. Pestalotia lawsoniae and Zasmidium fructicola were isolated from Pinus densiflora, and three species, Pestalotiopsis chamaeropis, Pestalotiopsis jesteri, and Stagonosporopsis cucurbitacearum were isolated from Aronia melanocarpa. To the best of our knowledge, these species have not been previously reported in Korea.
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문제 정의
최근에는 내생균들이 잎 조직 내에서 분비하는 이러한 물질들이 다른 미생물 병원체에 대한 항생 효과 또한 낼 수 있다는 사례들이 연구되면서[4, 5], 식물의 잎에서 분리된 내생균에 대한 연구와 균주 확보의 중요성이 점차 높아지고 있다. 본 연구에서는 우리나라의 다양한 식물의 잎에서 내생균을 분리하여 다양성을 조사하는 연구를 진행하던 과정에서 충북 단양의 아로니아(Aronia melanocarpa)와 전북 부안의 소나무(Pinus densiflora)의 잎에서 5종의 국내 미기록 내생균을 분리하여 그 균의 형태적 특징과 계통 분석 결과를 보고하고자 한다.
분리한 균주는 형태적 특징과 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 β-tubulin 유전자의 염기서열을 이용하여 계통분석을 통해 동정하였다. 소나무에서 분리한 두 종의 균주인 Pestalotia lawsoniae와 Zasmidium fructicola, 그리고 아로니아에서 분리한 세 종의 균주인 Pestalotiopsis chamaeropis, Pestalotiopsis jesteri, Stagonosporopsis cucurbitacearum는 국내 미기록 진균으로 보고하고자 한다.
제안 방법
DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 Genomic DNA를 추출하였으며, 이 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 모든 균주의 DNA는 균 특이적 primer인 ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal transcribed spacer (ITS) 지역을 증폭하였고[6], primer LR0R과 LR16을 이용하여 ribosomal DNA의 large subunit (LSU) 지역을[7], 그리고 primer Bt2a과 Bt2b를 이용하여 β-tubulin (TUB) 영역을 증폭하였다[8].
PCR 조건 중 annealing 온도는 ITS 지역은 50°C, LSU rDNA 지역은 44°C, β-tubulin 영역은 58°C로 설정하여 수행하였으며, PCR 최종 산물은 1.5% agarose gel에서 20분 간 전기영동을 실시하였고, 예상되는 크기의 DNA band를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea).
본 연구에서는 소나무(Pinus densiflora)와 아로니아(Aronia melanocarpa)의 잎을 채취하여 표면살균한 후 내생균을 분리하였다. 분리한 균주는 형태적 특징과 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 β-tubulin 유전자의 염기서열을 이용하여 계통분석을 통해 동정하였다.
분리한 균주는 형태적 특징과 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 β-tubulin 유전자의 염기서열을 이용하여 계통분석을 통해 동정하였다.
5% agarose gel에서 20분 간 전기영동을 실시하였고, 예상되는 크기의 DNA band를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). 분석된 염기서열은 NCBI상에서 BLAST를 이용하여 유사도를 확인한 후 각 종들 간의 계통 분석을 통한 유연 관계를 확인하기 위해 MEGA6를 이용하여[9], neighbor joining 계통수를 작성하였다(Table 1, Figs. 2~5). 분리된 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, 염기서열은 GenBank에 제출하였다(Table 2).
표면살균 후 잎을 potato dextrose agar (PDA) 배지에 4조각씩 치상하였고 25°C 암소에서 배양한 후 균사가 뻗어 나오면 새로운 PDA 배지에 계대배양하였다. 순수 분리된 균주는 PDA 배지와 malt extract agar (MEA) 배지에서 7일간 배양하여 형태학적 특징을 관찰하였다(Fig. 1).
2")에서 채집되었다. 채집된 시료는 지퍼백에 담아 24시간 내에 실험실로 운반하여 외관상 병증이 없는 잎 시료를 선별하여 증류수로 세척 후 30% H2O2로 30초~1분간 처리하여 표면을 살균하였다. 표면 살균 시간은 잎의 면적에 따라 다르게 수행하였다.
표면살균 후 잎을 potato dextrose agar (PDA) 배지에 4조각씩 치상하였고 25°C 암소에서 배양한 후 균사가 뻗어 나오면 새로운 PDA 배지에 계대배양하였다.
대상 데이터
2~5). 분리된 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, 염기서열은 GenBank에 제출하였다(Table 2).
아로니아는 충청북도 단양군 적성면 현곡리의 아로니아 재배 농경지(N36°57'05.5", E128°18'01.3")에서 채집되었고, 소나무는 전북 부안군 주산리 사산면의 산림(N35°39'23.3", E126°40'59.2")에서 채집되었다.
성능/효과
1L). ITS 지역의 염기서열은 KM199380과 98.0%, LSU 지역은 KM116281와 99.0%, TUB 지역은 KM199468과 98.0%의 유사도를 나타냈다. 이 종은 파푸아뉴기니의 용담과(Gentianaceae) 식물의 줄기에서 처음으로 분리되었다[14].
1N). ITS 지역의 염기서열은 KM489071과 98.0%, LSU 지역은 EU167563과 100%, TUB 지역은 KY930337과 97.0%의 일치도를 확인하였다. 본 균주는 아로니아의 잎에서 분리되었으며, 원 기재문 내에 Stagonosporopsis에 해당하는 종들이 타원형 혹은 구형의 두 가지 형태의 분생자를 형성한다고 기록되어 있는데[19], 본 연구에서도 두 가지 형태의 분생자를 확인할 수 있었다.
1O). ITS 지역의 염기서열은 KP896053와 99.0%, LSU 지역은 KP895915와 99.0%, TUB 지역은 KP896138과 99.0%의 일치도를 확인하였다. Zasmidium속은 Mycosphaerellaceae에 속하는 균류로, conidium은 격벽이 구분되지 않으며 표면에 치아 형태의 중심축이 자리잡고 있는 것이 특징이다[24].
1K). ITS 지역의 염기서열은 KR259104와 99.0%, LSU 지역은 KM116217과 99.0%, 그리고 TUB 지역은 KR259103과 98.0%의 유사도를 나타냈다. Pestalotiopsis속은 1949년 Steyaert [11]에 의해 최초로 명명된 속으로, 검은 색의 분생포자 층(acervulus)이 불규칙하게 혹은 균열이 있는 상태로 종방향으로 길게 뻗어 나가며, 유리질의 격막으로 분리된 갈색의 분생자를 형성하는 것이 특징이다.
1F). NCBI 상에서 ITS 지역의 분석결과 P. lawsoniae AY687872와 100.0%의 일치도를 확인하였고, LSU 지역의 분석결과 HM535714와 98.0%의 유사도를, TUB 지역의 분석결과 DQ333577과 97.0%의 유사도를 확인하였다. Pestalotia속은 1841년 De Notaris에 의해 명명되었으며[10], Pestalotiopsis와 같이 Amphisphaeriaceae에 속한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
소나무와 아로니아의 잎을 채취하여 표면 살균한 후 내생균을 분리하여 ITS rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 β-tubulin 유전자의 염기서열로 계통 분석한 결과는 어떠한가?
분리한 균주는 형태적 특징과 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 지역과 28S rDNA 지역 그리고 β-tubulin 유전자의 염기서열을 이용하여 계통분석을 통해 동정하였다. 소나무에서 분리한 두 종의 균주인 Pestalotia lawsoniae와 Zasmidium fructicola, 그리고 아로니아에서 분리한 세 종의 균주인 Pestalotiopsis chamaeropis, Pestalotiopsis jesteri, Stagonosporopsis cucurbitacearum는 국내 미기록 진균으로 보고하고자 한다.
내생균란 무엇인가?
내생균(endophytic fungi)은 살아 있는 식물의 식물체에서 병증을 유발하지 않으며 공생하는 균류를 의미하는데[1], 식물체의 잎과 뿌리, 줄기 등 모든 조직 내에 서식하고 있다. 특히 식물의 잎에 서식하는 내생균은 병원체로 작용하는 미생물의 잎 조직으로의 침투를 제한하는 역할을 하기도 하고[2], 식물의 포식자에게 독소가 될 수 있는 alkaloid 형태의 2차 대사산물을 분비하기도 한다[3].
식물의 잎에 서식하는 내생균은 어떤 역할을 하는가?
내생균(endophytic fungi)은 살아 있는 식물의 식물체에서 병증을 유발하지 않으며 공생하는 균류를 의미하는데[1], 식물체의 잎과 뿌리, 줄기 등 모든 조직 내에 서식하고 있다. 특히 식물의 잎에 서식하는 내생균은 병원체로 작용하는 미생물의 잎 조직으로의 침투를 제한하는 역할을 하기도 하고[2], 식물의 포식자에게 독소가 될 수 있는 alkaloid 형태의 2차 대사산물을 분비하기도 한다[3]. 최근에는 내생균들이 잎 조직 내에서 분비하는 이러한 물질들이 다른 미생물 병원체에 대한 항생 효과 또한 낼 수 있다는 사례들이 연구되면서[4, 5], 식물의 잎에서 분리된 내생균에 대한 연구와 균주 확보의 중요성이 점차 높아지고 있다.
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