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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 총 페놀 화합물과 총 플라보노이드 함량이 우수한 눈개승마의 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Aruncus dioicus var. kamtschaticus extract: EFAD)을 이용하여 in vitro 산화방지 효과 및 고당으로 야기된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 확인하였고, 더불어 장내 당 소화 효소인 알파글루코사이드가수분해효소(α-glucosidase) 작용 억제와 콜린성 시스템에서 뇌신경전달물질인 아세틸콜린에스터가수분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 활성억제를 확인하고자 한다.
- 한편, 아세틸콜린에스터가수분해효소(AChE)는 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)을 가수분해하여 콜린성 시냅스에서의 신경 전달을 종결을 시키는 효소로 아세틸콜린에스터가수분해효소의 과도한 활성은 뇌신경전달물질 유지에 영향을 주게 되어 신경 전달장애를 야기시킬 수 있으므로 천연물에서 유래된 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제제를 찾는데 관심을 가지고 있다(26). 따라서, 본 연구에서는 추가적으로 알파글루코사이드가수분해효소와 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제효과를 측정함으로써, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 혈당 상승 억제효과와 인지 저하 현상을 개선할 수 있는 건강기능식품 소재로의 활용 가능성을 추가적으로 살펴보았다. 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 알파글루코사이드가수분해효소 억제활성 측정결과는 다음과 같다(Fig.
- kamtschaticus extract: EFAD)을 이용하여 in vitro 산화방지 효과 및 고당으로 야기된 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과를 확인하였고, 더불어 장내 당 소화 효소인 알파글루코사이드가수분해효소(α-glucosidase) 작용 억제와 콜린성 시스템에서 뇌신경전달물질인 아세틸콜린에스터가수분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 활성억제를 확인하고자 한다. 또한 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 주요 물질을 동정하여 혈당 상승 억제력과 고혈당으로 발생될 수 있는 신경세포 손상에 대한 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 효과를 통해 눈개승마의 고혈당에 의한 신경질환을 예방하는 건강기능식품의 소재로서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 1주간 사육한 mouse의 뇌를 적출하여 10배의 차가운 트리스-염산 완충용액(20 mM, pH 7.4)에 균질화 시킨 후, 4oC에서 15분간 12,000×g로 원심분리 하였다.
- C18 column (250×4.6 mm, 5.0 μm, Prontosil, BISCHOFF Chromatography, Leonberg, Germany)을 사용하였고, 이동상 용매로 0.1% 폼산(A)와 메탄올(B)을 사용하였으며, B 용매의 비율 조건은 0-10분(30-40%), 10-20분(40-50%), 20-60분(50-100%)으로 총 60분간 분석을 하였다.
- DCFDA assay는 비형광 화합물인 DCF-DA가 탈에스터화 과정을 통해 세포를 통과하게 되면 세포 내 존재하는 활성산소종과 반응하여 DCF로 산화되면서 형광을 띠게 되는 원리를 이용한 실험으로(15), MC-IXC 신경세포를 1.0×104 cells/well로 분주하였고, 시료 및 양성대조군인 비타민 C (200 μM)를 MC-IXC 신경세포에 처리하였으며, 대조구(control)에는 동일양의 phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4)를 처리하였다.
- 0 mL/min이며, UV 검출 장치의 파장은 Diode Array Detector (DAD)로 372 nm에서 분석하였다. 검출 파장에 대한 UV 스펙트럼은 분석 파장에 대한 표준 물질을 library spectrum으로 지정하여 주요 peak의 지연시간(retention time, RT)과 UV 스펙트럼을 비교함으로써 유사성(similarity)을 측정하였다.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물의 주요 물질을 동정하기 위해 고성능액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC, Ultra mate 3000 series, Dionex, CA, USA)를 사용하여 분석을 하였다. 시료는 메탄올에 용해한 후, 0.
- 이 후, MC-IXC 신경세포에 MTT stock 용액(5 mg/mL)을 처리하여 37oC에서 3시간 배양 시킨 후, 배지를 거른 well에 DMSO 100 μL를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마지막으로, 흡광도는 마이크로플레이트판독기(microplate reader, 680, bio-rad, Tokyo, Japan)에서 570 nm (determination wave)와 690 nm (reference wave)에서 측정하였다. 양성대조군은 비타민 C (200 μM)를 사용하였고, 세포 생존율은 대조구(control)에 대한 % 농도로 나타내었다.
- kamtschaticus)는 강원도 태백시에 위치한 태백쌈채마을로부터 2015년 4월에 구입하였다. 본 실험에서는 눈개승마의 어린잎과 줄기를 사용하여 냉동건조 시켰으며, 냉동건조 된 눈개승마 20 g을 80% 에탄올 1L에 혼합한 후, 40oC에서 2시간 30분 동안 환류냉각장치를 이용하여 추출하였고, 이 추출물은 No. 2 거름종이(Whatman Inc, Kent, UK)로 여과하여 농축한 후, 3차 증류수에 녹인 뒤 동일한 비율의 노말헥세인(n-hexane), 클로로폼(chloroform) 및 아세트산에틸(ethylacetate: EtOAC) 용매를 사용하여 극성에 따라 순차적으로 추출물의 성분을 분획하였다(Fig. 1). 각 분획물은 농축하여 냉동건조 시킨 후, −20oC에서 보관하며 실험에 사용하였다.
- 특히, 플라보노이드는 가장 널리 분포되어 있는 다이페닐프로판 계열의 페놀화합물로 과일, 야채에 함유되어 있으며, 심혈관계 질환의 위험을 감소시키는 것으로 알려져 있다(8). 본 실험의 시발점으로 눈개승마 분획물별(노말헥세인, 클로로폼, 아세트산에틸 및 증류수) 총 페놀화합물 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였으며, 결과는 Fig. 2와 같다. 눈개승마 분획물별 총 페놀화합물 함량은 각각 70.
- 본 연구에서는 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus)의 in vitro 산화방지활성 및 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 산화적 스트레스로부터의 뇌신경세포 손상에 대한 보호효과와 더불어 알파글루코사이드가수분해효소 및 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제효과를 확인하였으며 또한 HPLC를 이용하여 주요 물질을 분석하였다. 눈개승마 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Aruncus dioicus var.
- 그 후 7% 탄산 나트륨(Na2CO3) 수화물 10 mL을 혼합한 후, 3차 증류수로 25 mL 정용 하였다. 상온에서 2시간 방치 후, 분광광도계(UV-spectrophotometer) (Libra S32PC, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도는 갈산(gallic acid) 표준정량곡선을 이용하여 총 페놀화합물함량을 계산하였다(12).
- 시료의 주입량은 10 μL, 이동상 유속은 1.0 mL/min이며, UV 검출 장치의 파장은 Diode Array Detector (DAD)로 372 nm에서 분석하였다.
- 아세틸콜린에스터가수분해효소(AChE) 억제활성 측정은 아세틸콜린 요오드화합물(acetylcholine iodide)를 기질로 이용하여 측정하였다. 아세틸콜린에스터가수분해효소는 PC12 세포배양액을 220×g에서 6분간 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고 남은 pellet에 균질화를 위하여 세포용해완충용액(lysis buffer, 1 M NaCl, 50mM MgCl2, 1% Triton X-100, pH 7.
- 이 후, 50 μM DCF-DA를 넣어 고당 처리군은 30분간, 과산화수소 처리군은 50분간 배양하여 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co. SanJose, CA, USA)를 사용하여 485 nm (excitation wave)과 535 nm (emission wave)에서 형광강도를 측정하였다.
- 페놀화합물은 항균, 항염증, 항 알레르지 및 항암 등 광범위한 생물학적 효과를 나타내며, 이는 페놀화합물의 페놀릭하이드록실기 및 공명구조를 통해 이루어지는 자유 라디칼 소거와 산화방지 효과에서 기인된다(19). 이에 가장 높은 총 페놀화합물 및 총 플라보노이드 함량을 지닌 눈개승마 아세트산에틸 분획층(EFAD)을 이용하여 in vitro 산화방지 실험을 진행하였다.
- 천연물에서 기인된 산화방지제는 인체를 자유 라디칼 및 활성산소종에 의한 지방질과산화를 지연시켜 줌으로써 만성질환의 진행을 예방해주는 것으로 알려져 있다(20). 이에 본 연구에서는 ABTS 라디칼 소거 활성 및 지방질과산화물(MDA) 생성 억제효과를 통해 in vitro 산화방지 실험을 진행하였다. ABTS 라디칼소거 활성 측정방법은 과황산칼륨에 의해 인위적으로 만들어진 청록색의 ABTS 라디칼이 산화방지 물질에 의해 소거되어 탈색되는 정도를 분광광도계로 측정하는 방법으로, 실험 방법이 간단하고 높은 감도를 지녀 산화방지 측정에 널리 사용되고 있다(21).
- 체내에서는 산소의 전자 환원을 촉매하는 막 효소인 NAD(P)H oxidase와 미토콘드리아의 호흡 과정을 통해 초과산화음이온(O2−)이 발생되며 체내 산화방지 효소인 초과산화물제거효소(superoxide dismutase, SOD)에 의해 비교적 안정적 형태인 과산화수소(H2O2)로 변환되고 글루타싸이온 과산화효소(glutathione peroxidase, GSH-Px), 카탈레이스(catalase, CAT)에 의해 소거되는 산화방지 체계를 가지지만, 고혈당의 조건에서 NAD(P)H oxidase와 초과산화물 제거효소의 발현 증가와 더불어 글루타싸이온 과산화효소와 카탈레이스 발현 감소를 통해 체내의 과산화수소량이 증가된다는 연구가 있다(24). 이에 본 연구에서는 뇌신경세포의 특성을 나타내는 MC-IXC 세포에 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)를 처리하여 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 신경세포 보호효과를 DCF-DA assay와 MTT assay를 통해 확인하였다.
- 2(B)). 이에 아세트산에틸 분획물(EFAD)에서 가장 우수한 총 페놀화합물 및 총 플라보노이드 함량을 확인하였다. 페놀화합물은 항균, 항염증, 항 알레르지 및 항암 등 광범위한 생물학적 효과를 나타내며, 이는 페놀화합물의 페놀릭하이드록실기 및 공명구조를 통해 이루어지는 자유 라디칼 소거와 산화방지 효과에서 기인된다(19).
- 지방질과산화물 생성 억제 효과는 뇌 조직을 이용하여 측정되었으며, 이는 Chang 등(14)의 방법을 변형하여 실험하였다. ICRmouse (8주령, 숫컷)는 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경적응기간을 유지하였다.
- 총 플라보노이드 함량 측정 Lee 등(13)의 방법을 변형하여 실험하였다. 추출 시료 용액(1 mg/mL 농도) 1 mL에 다이에틸렌글리콜(diethylene glycol) 10 mL 및 1 N 수산화 나트륨(NaOH) 1mL을 혼합한 후, 상온에서 1시간 방치하고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도는 루틴(rutin) 표준정량곡선을 이용하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- 또한 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 뇌신경세포에서의 산화적 스트레스 및 이로 인한 뇌신경세포 사멸을 측정한 결과, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 유의적인 뇌신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 추가적으로 다당류 분해효소인 알파글루코사이드가수분해효소 억제효과 및 아세틸콜린 분해 효소인 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제효과를 살펴봄으로써 혈당 상승 억제효과와 뇌신경전달물질의 세포 내 유지 효과를 확인하였다. 마지막으로 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 주요 페놀성 물질을 확인하기 위해 HPLC분석을 한 결과 카페산으로 추정되었다.
- 총 플라보노이드 함량 측정 Lee 등(13)의 방법을 변형하여 실험하였다. 추출 시료 용액(1 mg/mL 농도) 1 mL에 다이에틸렌글리콜(diethylene glycol) 10 mL 및 1 N 수산화 나트륨(NaOH) 1mL을 혼합한 후, 상온에서 1시간 방치하고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도는 루틴(rutin) 표준정량곡선을 이용하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- 2) 2 mL을 첨가하여 14,000×g에서 30분간 원심분리 한 상층액으로부터 확보하여 효소실험에 사용하였다. 추출한 효소액의 단백질 함량은 Quant-ITTM 단백질분석키트(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 효소액 10 μL와 시료용액 10 μL를 혼합하여 37oC에서 15분간 방치한 후, 50 mM 인산 나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH 8.
대상 데이터
- 지방질과산화물 생성 억제 효과는 뇌 조직을 이용하여 측정되었으며, 이는 Chang 등(14)의 방법을 변형하여 실험하였다. ICRmouse (8주령, 숫컷)는 실험동물 공급업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하여 7일간의 환경적응기간을 유지하였다. 1주간 사육한 mouse의 뇌를 적출하여 10배의 차가운 트리스-염산 완충용액(20 mM, pH 7.
- 본 실험에 사용한 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus)는 강원도 태백시에 위치한 태백쌈채마을로부터 2015년 4월에 구입하였다. 본 실험에서는 눈개승마의 어린잎과 줄기를 사용하여 냉동건조 시켰으며, 냉동건조 된 눈개승마 20 g을 80% 에탄올 1L에 혼합한 후, 40oC에서 2시간 30분 동안 환류냉각장치를 이용하여 추출하였고, 이 추출물은 No.
- 본 실험에서 사용한 MC-IXC 세포(CRL-2270, ATCC, Manassas, VA, USA)는 뇌신경세포의 특성을 나타내는, 인간의 뇌조직으로부터 유래된 세포로 MC-IXC 신경세포를 10% fetal bovine serum, 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지에 접종하여 37oC, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
- 사용된 시약으로 폴린-시오칼토 페놀시약(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent), 갈산(gallic acid), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazdine6sulfonic-acid) (ABTS), 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid), 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), 과산화수소(H2O2), 테트라졸륨브로민화물(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetazolium bormide, MTT) assay kit 및 알파글루코사이드가수분해효소(α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae)는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다.
- 양성대조군은 비타민 C (200 μM)를 사용하였고, 세포 생존율은 대조구(control)에 대한 % 농도로 나타내었다.
- (GrandIsland, NY, USA)에서 구입하였으며, 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin) 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich Co. 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험데이터는 3회 반복 실시하여 mean±SD로 나타냈으며, SAS software (version 9.1, SAS institute, Cary, NC, USA) 이용한 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 실시를 통해 각 평균값에 대한 검증이 이루어졌으며, Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 각 시료간의 유의적차를 5% 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 조건의 배양기에서 배양하였다. 고당/과산화수소로 유도된 MC-IXC 신경세포 내 산화스트레스 생성량은 DCF-DA assay로 측정하였다. DCFDA assay는 비형광 화합물인 DCF-DA가 탈에스터화 과정을 통해 세포를 통과하게 되면 세포 내 존재하는 활성산소종과 반응하여 DCF로 산화되면서 형광을 띠게 되는 원리를 이용한 실험으로(15), MC-IXC 신경세포를 1.
- 과산화수소에 의해 유도된 MC-IXC 신경세포 사멸에 대한 보호효과는 미토콘드리아에서 숙신산 탈수소 효소 작용에 의해 노란색의 수용성 기질을 진청색의 비수용성의 포마잔을 측정하는 MTT assay(16)로 측정하였다. MTT assay는 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD) 및 양성대조군인 비타민 C (200 μM)를 MCIXC 신경세포에 24시간동안 전 배양한 후, 이후로는 DCF-DA assay와 동일한 단계가 이루어졌다.
성능/효과
- 50 mg GAE/g이며(Fig. 2(A)), 총 플라보노이드 함량은 각각 149.25, 30.85, 511.72 및 10.98 mg RE/g로 측정되었다(Fig. 2(B)).
- 7(A)). 372 nm의 파장에서 18.92분에 나타난 peak이 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 주요 물질로 확인되었으며, 표준 물질 카페산(caffeic acid)의 지연시간(RT) 및 UV 스펙트럼을 비교하였을 때, 유사율(similarity)이 0.9841로 나타났다(Fig. 7(B)).
- 13%의 활성산소종 생성량을 나타냄에 따라(Fig. 4(B)), 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)이 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)에 의해 야기된 뇌신경세포 내의 활성산소종을 효과적으로 감소시켜 줌을 확인하였다.
- 50 μg/mL 농도에서 73.20%의 지방질과산화물 억제활성을 나타냈으며, 이는 양성대조군인 카테킨의 100 μg/mL과 유사한 억제활성을 보이며, 그 이상의 농도에서는 상대적으로 더 우수한 지방질과산화물 억제활성을 확인하였다.
- 50 mM 고당(intensive glucose)을 처리한 그룹에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 92.89%의 세포 생존율을 나타냈고, 고당과 함께 200 μM 비타민 C를 처리한 양성대조군에서는 131%의 세포 생존율을 나타냈다.
- 고당(intensive glucose)만 처리한 군(121%)은 아무런 처리를 하지 않은 대조군(100%)과 비교하였을 때, 활성산소종 생성량이 20.99% 증가 하였으며, 200 μM 비타민 C를 처리한 양성대조군은 24.07%의 활성산소종 생성량을 나타냈다.
- 2와 같다. 눈개승마 분획물별 총 페놀화합물 함량은 각각 70.42, 44.67, 430.08 및 55.50 mg GAE/g이며(Fig. 2(A)), 총 플라보노이드 함량은 각각 149.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)은 100 μg/mL 농도에서 36.07%의 유의적으로 낮은 활성산소종 생성량을 나타내었다(Fig.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 1,000 g/mL에서 82.35%의 매우 우수한 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제활성을 나타냈으며, 이는 양성대조군인 타크린(tacrine)의 1 μM 농도에서의 억제활성에 상응하는 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제활성을 지닌 것을 확인하였다.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 200 μg/mL 농도에서 ABTS 라디칼 소거 활성은 74.88%로 측정되었고, 그 이상의 농도에서 양성대조군 비타민 C(500 μg/mL)만큼의 유효한 라디칼 소거 활성을 통해, 매우 뛰어난 ABTS 라디칼 소거 활성을 확인하였다.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 500 μg/mL에서 87.83%의 매우 우수한 알파글루코사이드가수분해효소 억제활성을 확인하였고, 이는 양성대조군인 아카보스(acarbose)의 250 μg/mL 농도에서의 억제활성보다 우수한 효과를 나타냈다.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 half maximal inhibitory concentration(IC50)값은 344.69 μg/mL로 측정되었으며, 눈개승마 아세트산에틸분획물(EFAD)은 유의적인 억제력을 통해 천연물 유래 알파글루코사이드가수분해효소 억제제로서의 가능성을 확인하였다.
- 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)이 가지는 매우 우수한 in vitro 산화방지력과 뇌신경세포 보호효과는 높은 함량의 총 페놀화합물과 총 플라보노이드에서 기인된 것으로 판단된다. 주요 물질을 분석을 위해 HPLC 분석을 실시한 결과는 다음과 같다(Fig.
- kamtschaticus)의 in vitro 산화방지활성 및 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 산화적 스트레스로부터의 뇌신경세포 손상에 대한 보호효과와 더불어 알파글루코사이드가수분해효소 및 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제효과를 확인하였으며 또한 HPLC를 이용하여 주요 물질을 분석하였다. 눈개승마 아세트산에틸 분획물(ethylacetate fraction from Aruncus dioicus var. kamtschaticus: EFAD)은 매우 우수한 총 페놀화합물 함량(430.08 mg GAE/g)과 총 플라보노이드 함량(511.72 mg RE/g)을 나타냈으며, 높은 ABTS 라디칼 소거 활성과 과산화지방질생성물의 억제력을 확인하였다. 또한 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 뇌신경세포에서의 산화적 스트레스 및 이로 인한 뇌신경세포 사멸을 측정한 결과, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 유의적인 뇌신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다.
- 특히, 카페산은 뇌신경세포에서의 아세틸콜린에스터가수분해효소 활성을 억제시키며 지방질과산화를 억제함으로써 뇌신경세포를 보호해준다는 연구가 있다(28). 따라서 카페산이 가지는 생리활성이 본 연구에서 확인한 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 in vitro 산화방지효과와 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 산화 스트레스에 대한 뇌신경세포 보호효과 및 아세틸콜린에스터가수분해효소 활성 억제에 기여하였을 것이라 사료된다. 다만 본 연구에서의 효과를 보다 명확하게 증명하기 위해 HPLC 분석으로 동정 되지 못한 기타 주요 성분들의 분석 연구가 필요하다고 판단되며, 향후 Q-TOF UPLC/MS/MS system 등을 통해 구체적인 활성성분 연구를 진행해야 할 것이다.
- 반면 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)은 우수한 산화방지력을 통해 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 산화적 스트레스에 대한 세포내 활성산소종을 감소시켰고, 이는 점진적인 세포사멸 경로의 진행을 억제시켜 뇌신경세포 생존율을 높인 것으로 판단된다. 따라서, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 뇌신경세포 보호효과는 나아가 고혈당에 의한 퇴행성 뇌신경질환을 예방할 수 있을 것이라 판단된다.
- 자유 라디칼 연쇄 반응은 지방질과산화의 일반적인 메커니즘으로 라디칼 소거제는 퍼옥사이드(peroxide)와 직접 반응하여 자유 라디칼 연쇄반응을 종결 시킬 수 있다(20). 따라서, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 우수한 ABTS 라디칼 소거 활성을 통한 라디칼 소거능은 자유 라디칼 연쇄반응을 종결 시킬 수 있어 지방질과산화물인 말론다이알데하이드(malondialdehyde, MDA) 생성을 억제한 것으로 사료된다. 지방질과산화물은 생체막에서 단백질과의 부가적인 반응으로 세포막의 구조적 변화를 통한 유동성의 감소를 야기시켜 신경세포의 기능장애 및 사멸을 초래할 수 있다(22).
- 또한 200 μM 과산화수소(H2O2)를 처리한 그룹에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 65.72%의 세포 생존율을 나타냈으며, 과산화수소와 200 μM 비타민 C를 함께 처리한 양성대조군에서는 144%의 세포 생존율을 나타냈다.
- 72 mg RE/g)을 나타냈으며, 높은 ABTS 라디칼 소거 활성과 과산화지방질생성물의 억제력을 확인하였다. 또한 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 뇌신경세포에서의 산화적 스트레스 및 이로 인한 뇌신경세포 사멸을 측정한 결과, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 유의적인 뇌신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 추가적으로 다당류 분해효소인 알파글루코사이드가수분해효소 억제효과 및 아세틸콜린 분해 효소인 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제효과를 살펴봄으로써 혈당 상승 억제효과와 뇌신경전달물질의 세포 내 유지 효과를 확인하였다.
- 또한 과산화수소(H2O2)만 처리한 군(134%)에서는 아무런 처리를 하지 않은 대조군(100%)과 비교하였을 때, 활성산소종 생성량이 34.33% 증가한 것을 확인하였으며, 반면 200 μM 비타민 C를 처리한 양성대조군은 활성산소종생성량이 42.67%로 과산화수소로 야기된 세포 내의 활성산소종생성량이 감소함을 알 수 있었고, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 100 μg/mL 농도에서 43.13%의 활성산소종 생성량을 나타냄에 따라(Fig.
- 추가적으로 다당류 분해효소인 알파글루코사이드가수분해효소 억제효과 및 아세틸콜린 분해 효소인 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제효과를 살펴봄으로써 혈당 상승 억제효과와 뇌신경전달물질의 세포 내 유지 효과를 확인하였다. 마지막으로 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 주요 페놀성 물질을 확인하기 위해 HPLC분석을 한 결과 카페산으로 추정되었다. 본 연구 결과들을 고려할 때, 눈개승마는 고혈당 지연 또는 개선을 통한 고혈당 예방 소재로서의 가능성뿐만 아니라 이로 인해 야기되는 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호함으로써 고혈당에 의한 대사성 뇌신경질환 예방 소재로도 활용 가능성이 있을 것이라 판단된다.
- 이에 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)를 처리한 군에서는 100 μg/mL 농도에서 135%의 우수한 뇌신경세포 생존율을 나타냈다(Fig.
- 이에 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 IC50을 측정한 결과 59.20 μg/mL로 확인되었고 유의적인 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제활성을 통해 뇌신경전달물질의 유지를 통한 인지기능 개선 가능성을 확인하였다.
후속연구
- 20 μg/mL로 확인되었고 유의적인 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제활성을 통해 뇌신경전달물질의 유지를 통한 인지기능 개선 가능성을 확인하였다. 결국, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)은 혈당 상승을 지연시켜 줌으로써 고혈당으로 인해 발생되는 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있으며, 더불어 산화적 스트레스로 인해 발생될 수 있는 뇌신경 전달 경로 장애를 개선함으로써, 고혈당 및 이로 인한 인지기능 개선 관련 건강기능식품 소재로 개발될 수 있는 가능성을 확인시켜 준 것으로 판단된다.
- 지방질과산화물은 생체막에서 단백질과의 부가적인 반응으로 세포막의 구조적 변화를 통한 유동성의 감소를 야기시켜 신경세포의 기능장애 및 사멸을 초래할 수 있다(22). 결국, 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 우수한 라디칼 소거능을 통한 지방질과산화물 생성 억제효과는 나아가 뇌신경세포 보호효과를 기대할 수 있을 것이라 판단된다.
- 타크린은 높은 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제활성을 지니고 있어 알츠하이머병의 초기 치료제로 사용되었으나 인체에 발생되는 부작용으로 인해 사용이 제한되고 있다(26). 그러므로 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)이 지니는 아세틸콜린에스터가수분해효소 억제활성은 인지기능 저하 예방소재로서 연구될 수 있을 것이라 판단된다. 이에 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 IC50을 측정한 결과 59.
- 따라서 카페산이 가지는 생리활성이 본 연구에서 확인한 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 in vitro 산화방지효과와 고당(intensive glucose)과 과산화수소(H2O2)로 야기된 산화 스트레스에 대한 뇌신경세포 보호효과 및 아세틸콜린에스터가수분해효소 활성 억제에 기여하였을 것이라 사료된다. 다만 본 연구에서의 효과를 보다 명확하게 증명하기 위해 HPLC 분석으로 동정 되지 못한 기타 주요 성분들의 분석 연구가 필요하다고 판단되며, 향후 Q-TOF UPLC/MS/MS system 등을 통해 구체적인 활성성분 연구를 진행해야 할 것이다.
- 마지막으로 눈개승마 아세트산에틸 분획물(EFAD)의 주요 페놀성 물질을 확인하기 위해 HPLC분석을 한 결과 카페산으로 추정되었다. 본 연구 결과들을 고려할 때, 눈개승마는 고혈당 지연 또는 개선을 통한 고혈당 예방 소재로서의 가능성뿐만 아니라 이로 인해 야기되는 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호함으로써 고혈당에 의한 대사성 뇌신경질환 예방 소재로도 활용 가능성이 있을 것이라 판단된다.
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