Objectives : The present study, to confirm the osteoblast differentiation effects of Acer tegmentosum Maxim. (AT) extract. Methods : In this experiment, cell viability, Alizarin red S assay, and Alkaline phosphatase (ALP) activity with AT extract (50, $100{\mu}g/m{\ell}$). Also, we studie...
Objectives : The present study, to confirm the osteoblast differentiation effects of Acer tegmentosum Maxim. (AT) extract. Methods : In this experiment, cell viability, Alizarin red S assay, and Alkaline phosphatase (ALP) activity with AT extract (50, $100{\mu}g/m{\ell}$). Also, we studied the expression of differentiation regulator with AT extract in primary calvarial osteoblasts cells (pOB). Results : As a result of AT treatment, we determined that AT extract stimulates ALP activity and alizarin red activities in the pOB cells for mineralization for 18 days. Moreover, these factors increasing osteogenic markers such as Runt-related transcription factor2 ($Run{\times}2$), osteocalcin (OC), osteopontin, osterix, smad1, smad5, activating transcription factor4 (ATF4) and collagen type I alpha 1. Conclusions : These results indicate that AT extract have effect on bone through the promotion of osteoblastic differentiation, suggesting that it could be used for the treatment of bone diseases.
Objectives : The present study, to confirm the osteoblast differentiation effects of Acer tegmentosum Maxim. (AT) extract. Methods : In this experiment, cell viability, Alizarin red S assay, and Alkaline phosphatase (ALP) activity with AT extract (50, $100{\mu}g/m{\ell}$). Also, we studied the expression of differentiation regulator with AT extract in primary calvarial osteoblasts cells (pOB). Results : As a result of AT treatment, we determined that AT extract stimulates ALP activity and alizarin red activities in the pOB cells for mineralization for 18 days. Moreover, these factors increasing osteogenic markers such as Runt-related transcription factor2 ($Run{\times}2$), osteocalcin (OC), osteopontin, osterix, smad1, smad5, activating transcription factor4 (ATF4) and collagen type I alpha 1. Conclusions : These results indicate that AT extract have effect on bone through the promotion of osteoblastic differentiation, suggesting that it could be used for the treatment of bone diseases.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 골다공증에 대한 효능을 알아보기 위해 산겨릅나무 물추출물을 제조하고 Primary calvarial osteoblasts cell을 이용하여 현대 약리적 방법으로 골다공증 질환에 대하여 그 효능을 확인하였으며 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
또한, 산겨릅나무의 성분으로 알려진 salidroside는 amyloid-β에 대하여 신경세포의 산화적 스트레스에 대한 보호 효과26) 및 지질과산화 억제 효능27)에 대한 연구가 보고되었다. 본 연구에서는 분화된 조골세포에 산겨릅나무 물추출물을 투여함으로써 ALP 및 골 석회화 형성에 미치는 영향, 조골세포 분화에 관련된 유전자 활성을 조사함으로써 산겨릅나무의 골다공증 질환 치료제로서 효능을 관찰해보고자 하였다.
이러한 보고들을 통해 본 연구에서는 조골세포의 분화에서는 어떠한 영향을 주는지 확인하고자 산겨릅나무 물추출물을 처리하여 조골세포 분화를 확인할 수 있는 대표적인 방법인 ALP 활성과 ARS염색을 시행하였다. 그 결과, 산겨릅나무 물추출물을 처리한 그룹에서 ALP 활성 및 ARS 염색이 증가하는 것으로 나타났다.
가설 설정
이는 골세포 분화의 표지인자로 알려져 있으며 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 발현되며 석회화가 진행되는 동안 세포분열이나 분화의 조절자로써 역할을 한다고 알려져 있다3,4). 골조직이 신체의 다른 조직과 구별되는 생화학 특징은 무기질 침착이 많으며 조직내 콜라겐 함량이 높다는 것이다. 콜라겐이 신체의 다른 부위에도 널리 분포하지만 골형성 또는 골 흡수표지자로 이용이 가능한 이유는 체내에 존재하는 콜라겐의 절반이 뼈에 존재하며 다른 조직의 콜라겐보다 대사율이 높기 때문이다5).
제안 방법
약물에 의한 세포독성을 알아보기 위하여 분화 된 C2C12 세포에 CCK-8 assay를 수행하였다. 먼저 96 well plate에 세포(1.5×104 cells/well) 분주하여 24시간 배양한 후 serum free media (SFM)에 여러 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖)로 희석한 산겨릅나무 물추출물을 처리하였다. 배양 종료 후 CCK-8 시약을 10 ㎕/well씩 넣은 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 암실상태를 유지하면서 반응시키고 MicroplateReader에서 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
배양한 pOB 세포를 각 well에 2×10⁴cells/500 ㎕ 으로 조정하여 plate에 배양한 후 석회와 유도를 위하여 분화유도 배지(50 ㎍/㎖의 ascorbic acid, 10 mM의 β-glycerophosphate (Sigma, USA), 10-7 M의 dexamethasone (Sigma, USA))와 산겨릅나무 물추출물을 농도별로 첨가하여 배지를 3일마다 교환하면서 14일 또는 18일 배양하였다. 배지를 제거한 후 PBS로 세척한 다음 3% formalin PBS solution 500㎕를 첨가하여 10분 동안 실온에서 고정시켰다.
이 세포의 증식을 위해 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 섞은 Dulbecco’smodified Eagles medium (DMEM, Gibco BRL)에서 배양하였다. 이차 계대 배양한 세포를 이용하여 실험을 진행하였으며, 조골세포 분화를 유도하기 위해 세포가 배양접시에 가득 차면 조골세포 분화배지로 교체하였다. 분화배지의 조성은 기존에 잘 알려진 10% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 50 μg/ml ascorbic acid를 포함한 α-minimum essential medium(α-MEM, Cambrex, Walkersville, MD, USA), 20 mMN-acetyl-Lcysteine (SIGMA, Steinheim, Germany)을 추가하여 사용하였다.
조골세포의 분화 마커와 관련된 유전자들의 발현을 확인하기 위하여 산겨릅나무 물추출물을 50, 100 ㎍/㎖로 처리하고 18일 동안 배양 한 후 qPCR을 통하여 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과(Fig.
대상 데이터
본 실험에서 사용된 산겨릅나무는 한국 강원도 에서 생산된 산겨릅나무(Acer tegmentosum. Maxim, AT)로서, 규격품으로 품질검사필한 절단생약을 제약회사로부터 구입하여 관능검사 후 제조한 물추출물을 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 GraphPad prism 5.0 통계 프로그램(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차(mean±SD)로 계산하였으며 각 그룹 간 비교를 위해 one-way ANOVA를 실시하여 p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 평가하였다
이론/모형
약물에 의한 세포독성을 알아보기 위하여 분화 된 C2C12 세포에 CCK-8 assay를 수행하였다. 먼저 96 well plate에 세포(1.
성능/효과
1. 산겨릅나무 물추출물은 C2C12에서 200 ㎍/㎖의 농도까지 독성을 보이지 않았다.
2. ALP의 활성을 측정한 결과 산겨릅나무 물추출물 50 및 100 ㎍/㎖의 농도에서 유의하게 증가 하였다.
3. 산겨릅나무 물추출물의 석회화 형성도를 측정한 결과, Alizarin red의 농도는 14일 처리한 그룹에서는 100 ㎍/㎖의 농도에서 증가를 하였지만, 18일 처리한 그룹에서는 (50, 100 ㎍/㎖) 유의하게 증가하였다.
그 결과(Fig. 4), 조골세포 분화의 대표적인 마커인 Runx2, Osterix, Osteocalcin의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 또한 전사인자 발현에 중요한 역할을 하는 Smad1, Smad5 및 ATF4의 발현도 증가함을 알 수 있었으며, 조골세포 분화의 표지인자인 osteopontin 및 Collagen type Ⅰalpha 1의 발현이 증가함을 확인 할 수 있었다.
4. 산겨릅나무 물추출물의 조골세포 분화와 관련된 유전자들의 발현을 확인한 결과 전사인자(Osteocalcin, Runx2, osterix, smad1, smad5, osteopontin, ATF4, Collagen type Ⅰ)가 유의적으로 증가하였다.
결국 활성화된 Smad는 homeobox transcription factor인 Dlx5의발현을 촉진하게 되며, 결국 조골세포 분화의 핵심전사인자라 할 수 있는 Runx227) 또는 Osterix29)의 발현을 각각 촉진 하게 된다. 결과적으로 이는 조골세포 분화의 표지인자인 bone sialoprotein30), ALP31) 및 osteocalcin32) 등의 발현을 증가 시키면서 석회화에 이르게 한다. 또한 세포막에는 당단백 효소인 ALP가 존재하고 있으며, 이는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내고 세포의 외막과 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포분열이나 분화의 조절자로써 역할을 하는 골세포 분화의 표지인자로 알려져 있다4).
이러한 보고들을 통해 본 연구에서는 조골세포의 분화에서는 어떠한 영향을 주는지 확인하고자 산겨릅나무 물추출물을 처리하여 조골세포 분화를 확인할 수 있는 대표적인 방법인 ALP 활성과 ARS염색을 시행하였다. 그 결과, 산겨릅나무 물추출물을 처리한 그룹에서 ALP 활성 및 ARS 염색이 증가하는 것으로 나타났다.
조골세포 분화의 표지인자인 염기성 인산분해 효소(ALP)는 모든 조직에 분포하고 있으며, 특히 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다. 따라서 본 연구에서도 조골세포에서 산겨릅나무 물추출물에 대하여 ALP의 활성에 대한 효능을 확인한 결과(Fig. 2), 대조군과 비교하여 유의적으로 증가함을 확인 하였다.
본 연구에서도 조골세포 분화 마커 유전자들의 발현을 qPCR을 통하여 확인 하였고 그 결과 Runx2,Osterix의 발현이 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 또한 전사인자 발현에 중요한 역할을 하는 Smad1 및 Smad5의 발현도 증가함을 알 수 있었으며, 조골세포 분화의 표지인자인 osteocalcin, osteopontin 및 Collagen type Ⅰ alpha 1 의 발현이 증가함을 확인 할 수 있었다.
본 연구에서도 조골세포 분화 마커 유전자들의 발현을 qPCR을 통하여 확인 하였고 그 결과 Runx2,Osterix의 발현이 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 또한 전사인자 발현에 중요한 역할을 하는 Smad1 및 Smad5의 발현도 증가함을 알 수 있었으며, 조골세포 분화의 표지인자인 osteocalcin, osteopontin 및 Collagen type Ⅰ alpha 1 의 발현이 증가함을 확인 할 수 있었다.
이상의 결과로부터 산겨릅나무 물추출물은 조골세포의 활성화를 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
이상의 실험결과에서 산겨릅나무 물추출물이 조골세포의 활성에 효능이 있다는 것을 확인하였다. 특히 골 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 100㎍/㎖의 농도에서 유의있게 증가함을 알 수가 있었다.
이상의 실험결과에서 산겨릅나무 물추출물이 조골세포의 활성에 효능이 있다는 것을 확인하였다. 특히 골 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 100㎍/㎖의 농도에서 유의있게 증가함을 알 수가 있었다. 조골세포를 활성화하여 골 생성을 촉진하는 것이 확인되었으며, 그에 대한 구체적인 기작 연구와 in vivo 연구가 병행된다면 골다공증 치료 및 예방에 새로운 치료제로 개발이 가능하리라 사료된다.
3A). 하지만, 18일 배양을 하였을 때 AT50 및 100 ㎍/㎖에서 농도 의존적으로 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, Alizarin red S(ARS)염색을 통하여 현미경상에서도 석회화 결절인지 재확인을 하였으며, 그 결과 산겨릅나무 물추출물 처리군 모두에서 관찰되었으며, 특히 고농도 처리군에서 결절화된 정도가 강력하게 증가한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3B, C).
후속연구
특히 골 석회화 형성에 미치는 영향을 검토한 결과, 100㎍/㎖의 농도에서 유의있게 증가함을 알 수가 있었다. 조골세포를 활성화하여 골 생성을 촉진하는 것이 확인되었으며, 그에 대한 구체적인 기작 연구와 in vivo 연구가 병행된다면 골다공증 치료 및 예방에 새로운 치료제로 개발이 가능하리라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
ALP는 인체에서 어떠한 역할을 하는가?
세포막에는 alkaline phsophatase (ALP) 라고 불리는 당단백 효소가 존재하고 있으며, 이는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타낸다. 이는 골세포 분화의 표지인자로 알려져 있으며 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 발현되며 석회화가 진행되는 동안 세포분열이나 분화의 조절자로써 역할을 한다고 알려져 있다3,4). 골조직이 신체의 다른 조직과 구별되는 생화학 특징은 무기질 침착이 많으며 조직내 콜라겐 함량이 높다는 것이다.
산천목이란 무엇인가?
최근 골다공증 질환 증가와 더불어 치료약물 발굴에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 골다공증 질환에서 한방임상처방 및 한약을 사용하여 다양한 면역조절작용에 대한 보고도 많이 이루어지고 있다. 산천목(植防風)은 무환자나무과(無患者나무科: A. tegmentosum)단풍나무속(Aceraceae)에 속하는 산겨릅나무 Acertegmentosum. Maxim 의 줄기로 산청목 및 벌나무라고도 불리며, 중국에서는 줄기를 청해척이라 하여 소종과 외상출혈에 치료목적으로, 한국에서는 잎과 목부를 간염, 간경화, 간암 등의 간질환 치료제 및 백혈병, 당뇨병, 신장염이나 부종의 치료에 사용하며 음주시 산겨릅나무의 목부 추출물을 복용하면 주독을 예방 하며 잎은 넓고 어린 줄기는 연한 녹색이며 줄기가 매우 연하여 잘 부러지며 껍질이 두껍고 재질은 희고 가벼우며, 독성이 어떠한 체질에도 부작용이 거의 없는 약제이며, 맛이 담백하여 청혈제와 이수제로 사용하고 있다9,10). 최근 산겨릅나무 줄기 추출물의 항당뇨, 알콜대사 효소 및 간보호 활성 효과11) 및 항산화, 항염증 효과12), 지방간 개선효과13)가 보고되어 있으며, quercetin, catechin 등과 같은 페놀계 화합물을 포함하고 있다14).
산천목은 중국과 한국에서 어떠한 질환에 사용하였는가?
tegmentosum)단풍나무속(Aceraceae)에 속하는 산겨릅나무 Acertegmentosum. Maxim 의 줄기로 산청목 및 벌나무라고도 불리며, 중국에서는 줄기를 청해척이라 하여 소종과 외상출혈에 치료목적으로, 한국에서는 잎과 목부를 간염, 간경화, 간암 등의 간질환 치료제 및 백혈병, 당뇨병, 신장염이나 부종의 치료에 사용하며 음주시 산겨릅나무의 목부 추출물을 복용하면 주독을 예방 하며 잎은 넓고 어린 줄기는 연한 녹색이며 줄기가 매우 연하여 잘 부러지며 껍질이 두껍고 재질은 희고 가벼우며, 독성이 어떠한 체질에도 부작용이 거의 없는 약제이며, 맛이 담백하여 청혈제와 이수제로 사용하고 있다9,10). 최근 산겨릅나무 줄기 추출물의 항당뇨, 알콜대사 효소 및 간보호 활성 효과11) 및 항산화, 항염증 효과12), 지방간 개선효과13)가 보고되어 있으며, quercetin, catechin 등과 같은 페놀계 화합물을 포함하고 있다14).
참고문헌 (35)
Takayanagi H., Osteoimmunology: shared mechanisms and crosstalk between the immune and bone systems., Nat Rew immunol. 2007 ; 7(4): 292-304.
Dragsted, L. O., M. Strube, and J. C. Larsen. Cancer-protective factor in fruits and vegetables. Biocheminal and biological background. Pharmacol. Toxicol. 1993 ; 72: 116-35.
Newmark, H. L. Plant phemolics as potential cancer prevention agents. Adv. Exp. Med. Biol. 1996 ; 401 : 25-34.
Manolagas, S. C. Basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Birth and death of bone cells. Endocr. Rev. 2000 ; 21 : 115-37.
Mone, Z. Skeletal remodeling in health and disease. Nat. Med. 2007. ; 13 : 791-801.
Kang SK, Park YB, Ahn HS. The bibliographical studies in the acupuncture treatment of the osteoporosis. J Korean Acupun & Moxibu Medicin Soc. 1998 ; 15(2) : 437-54.
Cho, H.S. Research on menorralgia in the questionnaire of oriental gynecology. Unpublished master's thesis. Dong-Eui University, 2002.
Lee GB. Korean Plant Illustrations. Hang Mun-sa. Seoul. 1993 ; 552.
So BG. Chinese main book illustrations. 3 vol. Yeogangchulpan-sa, Seoul. 1994 ; 193.
Cho EK, Jung KI and Young Ju Choi. Anti-Diabetic, Alcohol Metabolizing Enzyme, and Hepatoprotective Activity of Acer tegmentosum Maxim. Stem Extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015 ; 44(12) : 1785-92
Lee CE, Jeong HH, Cho IA and Sun Yung Ly. In Vitro and In Vivo Anti-Oxidative and Anti-Inflammatory Activities of Acer tegmentosum Maxim Extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2017 ; 46(1) : 1-9.
Seo YH, Lee SH, Hwang HS and Choi SY. Effects of Non-Alcoholic Fatty Liver in Rats by Acer tagmentosum Maxim. Extract. Korean J. Food & Nutr. 2016 ; 29(3) : 307-12.
Lee, J. W. and I. S. Lee. Effects of Rubus coreanus miquel extracts on the activity and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cell. J. Life Sci. 2004 ; 14 : 967-74.
Mok, S. K. and H. S. Shin. The effects of prostaglandine and dibytyryl cAMP on osteoblasic cell activity and osteoclast generation. J. Wonkwang Dental Res. Ins. 1996 ; 6 : 43-62.
Solt, D. B. The pathogenesis, oral manifestations, and implications for dentistry of metabolic bone disease. Curr. Opin. Dent. 1991 ; 1 : 783-91.
Parfitt, A. M. Osteonal and hemi-osteonal remodeling: The spatial and temporal framework for signal traffic in adult human bone. J. Cell Biochem. 1994 ; 55 : 273-86.
Bureau of Statistics. The statistics of mortality factors, Meta Data Base. 2006 ; 9
Tung NH , Yan D , Kim SK , Bae KH , Kim YH. Total peroxyl radicalscavenging capacity of the chemical components from the stems of Acer tegmentosum Maxim , J Agric Food Chem, 2008 ; 56 : 10510-4.
Yu T, Lee J, Lee YG, Byeon SE, Kim MH, Sohn EH, Lee YJ, Lee SG, Cho JY. In vitro and in vivo anti-inflammatory effects of ethanol extract from Acer tegmentosum. J Ethnopharmacol. 2010 ; 128(1) : 139-47.
Kim EC, Kim SH, Piao SJ, Kim TJ, Bae K, Kim HS, Hong SS, Lee BI, Nam M. Antiangiogenic Activity of Acer tegmentosum Maxim Water Extract in Vitro and in Vivo. J Korean Med Sci. 2015 ; 30(7) : 979-87.
Ha H, Shim KS, Kim T, An H, Lee CJ, Lee KJ, Ma JY. Water extract of Acer tegmentosum reduces bone destruction by inhibiting osteoclast differentiation and function. Molecules. 2014 ; 19(4): 3940-54.
Shin, I.C., J.H. Sa, T.H. Shim and J.H. Lee. The physical and chemical properties and cytotoxic effects of Acer tegmentosum Maxim. extracts. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 2006 ; 49 : 322-7.
Jang, S.I., H.O. Pae, B.M. Choi, G.H. Oh, S. Jeong, H.J. Lee, H.Y. Kim, K.H. Kang, Y.G. Yun, Y.C. Kim and H.T. Chung. Salidroside from Rhodiola sachalinesis protects neuronal PC 12 cells against cytotoxicity induced by amyloid- ${\beta}$ . Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2003 ; 25 : 295- 304.
Zhang, Y. and Y. Liu. Study on effect of salidroside on lipid peroxidation in oxidative stress in rat hepatic stellate cells. Zhong Yao Cai. 2005 ; 28 : 794-6.
Soltanoff CS, Yang S, Chen W, Li YP. Signaling networks that control the lineage commitment and differentiation of bone cells. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2009 ; 19 :1-46.
Lee MH, Kwon TG, Park HS, Wozney JM, Kim HJ, Ryoo HM: BMP-2-induced Osterix expression is mediated by Dlx5 but is independent of Runx2. Biochem Biophys Res Commun. 2003 ; 309(3) : 689-94.
Roca H, Phimphilai M, Gopalakrishnan R, Xiao G, Franceschi RT: Cooperative interactions between RUNX2 and homeodomain protein-binding sites are critical for the osteoblast-specific expression of the bone sialoprotein gene. J Biol Chem. 2005 ; 280 : 30845-55.
Kim YJ, Lee MH, Wozney JM, Cho JY, Ryoo HM: Bone morphogenetic protein-2-induced alkaline phosphatase expression is stimulated by Dlx5 and repressed by Msx2. J Biol Chem. 2004 ; 279 : 50773-80.
Harding HP, Zhang Y, Zeng H, NovoaI, Lu PD, Calfon M, Sadri N, Yun C, Popko B, Paules R, Stojdl DF, Bell JC, Hettmann T, Leiden JM, Ron D. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell,. 2003 ; 11 : 619-33.
Yang X, Matsuda K, Bialek P, Jacquot S, Masuoka HC, Schinke T, Li L, Brancorsini S, Sassone-Corsi P, Townes TM, Hanauer A, Karsenty G. ATF4 is a substrate of RSK2 and an essential regulator of osteoblast biology; implication for Coffin-Lowry Syndrome. Cell. 2004 ; 117 : 387-98.
Jiang D, Franceschi RT, Boules H, Xiao G. Parathyroid hormone induction of the osteocalcin gene. Requirement for an osteoblast-specific element 1 sequence in the promoter and involvement of multiple-signaling pathways. J Biol Chem. 2004 ; 279 : 5329-37.
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