[논문]혈액배양 양성검체에서 패혈증 원인균 신속동정을 위한 Vitek MS 시스템의 유용성 평가

박강균; 김상하; 최종태; 김성현; 김영권; 유영빈

doi:10.15324/kjcls.2017.49.4.407

혈액배양 양성검체에서 패혈증 원인균 신속동정을 위한 Vitek MS 시스템의 유용성 평가
An Evaluation of Vitek MS System for Rapid Identification of Bacterial Species in Positive Blood Culture 원문보기

Korean journal of clinical laboratory science : KJCLS = 대한임상검사과학회지, v.49 no.4, 2017년, pp.407 - 412

박강균 (가톨릭대학교 서울성모병원 진단검사의학과) , 김상하 (건양대학교병원 진단검사의학과) , 최종태 (경동대학교 임상병리학과) , 김성현 (부산가톨릭대학교 보건과학대학 임상병리학과) , 김영권 (건양대학교 의과학대학 임상병리학과) , 유영빈 (건양대학교 의과학대학 임상병리학과)

초록
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본 연구에서는 계대배양과 세균 동정 시험에 소요되는 시간을 단축하고, 혈류감염의 새로운 검사 방법을 모색하여 간단하고 신속 정확한 동정 결과를 도출할 목적으로 질량분석기를 이용하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 혈액배양에서 한 가지 세균만 배양된 검체는 총 254개였으며, Vitek 2에서 208주(81.8%)의 세균을 동정되었으며, 45주는 동정되지 않았다. 동정된 세균 중 그람양성 세균이 146개(57.5%), 그람음성 세균이 108개(42.5%)이었다. 전체적으로 233개는 종(species) 수준까지 동정 되었으며, 21개는 속(genus)수준까지 동정 되었다. 동정 오류는 Propionibacterium acnes를 Clostridium bifermentans로 동정 되었다. 균종별로는 enterobacteriaceae, glucose non-fermentative bacilli (GNFB), staphylococci의 정확도는 각각 81/83 (97.6%), 12/15 (80.0%), 72/85 (84.7%)로 나타났다. Vitek 2에 의한 표준법과 Vitek MS에 의한 직접법에 의한 동정의 일치율은 81.8%이었으며, 45주는 동정되지 않았다. 동정되지 않은 세균들의 대부분은 그람양성 세균(n=37)이었고, 그람양성 세균은 streptococci (14), coagulase-negative staphylococci (CNS) (11), enterococci (3), Staphylococcus aureus (2), Micrococcus spp. (2), Bacillus spp. (2) 그리고 Actinomyces odontolyticus, Finegoldia mag na, Peptostreptococcus spp.가 각각 1건씩 이었다. 결과 보고 시간은 기존의 검사 방법보다 24~72시간까지 단축되었다. 산소성 배양과 무산소성 배양 사이의 동정률의 차이는 없었으나 무산소성 배양을 사용하면 용해 과정이 필요 없어 검체 준비 시간을 단축할 수 있었다. 이상의 연구 결과로 혈액배양병에서 직접 동정하는 방법은 정확하고 결과 보고 시간이 신속하여 환자의 치료에 매우 유용할 것이라 생각된다. 향후 추가적인 연구에서는 본 연구에서 정확성이 부족했던 사슬알균(streptococci)과 혈장응고효소 음성 포도알균(CNS)을 동정하기 위한 방법을 더욱 개선할 필요가 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to shorten the time required for subculture and bacterial identification and obtain a simple and rapid identification method for new test methods for bloodstream infections. The following results were obtained using a mass spectrometer. In Vitek 2, 208 (81.8%) cases were well-identified and 45 isolates were not identified in blood cultures. Among 208 cases, 146 (57.5%) were Gram positive bacteria and 108 (42.5%) were Gram negative bacteria. In total, 233 were identified to the species level and 21 were identified to the genus level. The identification error was found to be Propionibacterium acnes as Clostridium bifermentans. The accuracy of Enterobacteriaceae, glucose non-fermentative bacilli (GNFB), and staphylococci were 81/83 (97.6%), 12/15 (80.0%), and 72/85 (84.7%), respectively. The concordance rate of Vitek 2 and Vitek MS by the direct method was 81.8% and 45 isolates were not identified. Most of the unidentified bacteria were Gram positive bacteria (N=37). The Gram positive bacteria were streptococci (14), coagulase-negative staphylococci (CNS) (11), enterococci (3), Staphylococcus aureus (2), Micrococcus spp. (2), Bacillus spp. (2) and Actinomyces odontolyticus, Finegoldia magna, and Peptostreptococcus spp. The results reporting time was reduced to 24~72 hours compared to the conventional method. The rate of identification of the aerobic and anaerobic cultures was similar, but the use of an anaerobic culture did not require a dissolution process, which could shorten the sample preparation time. These results suggest that the method of direct identification in blood cultures is very useful for the treatment of patients. In further studies, it might be necessary to further improve the method for identifying streptococci and CNS, which were lacking in accuracy in this study.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 실험에서는 세균의 생존에 전혀 영향을 주지 않으면서 가격이 저렴하고 신속하게 혈액의 세포 성분을 파괴하여 제거할 수 있는 두 가지 성분인 염화암모늄 용액과 사포닌 용액을 혼합하여 빠르고 신속하게 용해되는 용해액의 농도와 적절한 반응 시간을 찾고자 하였다. 첫째, 사포닌 농도에 따른 시간별 적혈구, 백혈구의 용해 여부를 확인하였다.
이전의 방법들은 에탄올, 포름산, 아세토니트릴[9] 또는 노동 집약적 용해 여과법[6]을 사용하거나 그람음성 막대균만을 평가하는 제한점을 갖고 있었다[10]. 질량분석기를 이용하여 혈액배양 양성 검체에서 계대배양 없이 세균을 직접 동정하고자 하는 연구들이 시도되었지만[11] 본 연구에서는 혈액배양 양성 검체에서 계대배양 없이 세균의 직접 동정을 시도하고 이 연구에 사용된 방법이 기존의 표준방법과 비교하여 신속도, 신뢰도와 정확도를 비교 평가하고자 하였다.

제안 방법

배양된 세균들을 Vitek 2를 사용하는 표준방법으로 시행하였을 때, 233 검체는 종(species) 수준까지 확인되었고, 21 검체는 속(genus) 수준까지 동정 되었다. MALDI-TOF MS를 이용한 혈액배양 직접 동정 결과와 Vitek 2를 사용하여 표준방법으로 검사한 균주의 동정 결과를 비교하였다(Table 1, Table 2).
건조한 표적슬라이드에 1 µL의 CHCA matrix 용액(α-cyano-4-hydroxycinn amic acid solution, bioMerieux)을 점적하고 실온에서 건조하였다. 건조 시킨 표적슬라이드를 질량분석기인 Vitek MS를 이용하여 동정하였다. 산소성/소아용 배지는 적혈구와 백혈구를 용해하기 위하여 용해 단계인 염화암모늄 용액 1 mL, 5% 사포닌 용액 5 mL를 침사와 섞은 후 10분 방치가 추가 되었다.
적혈구, 백혈구 측정은 Neubauer chamber로 시행하였다. 둘째, 각 농도별 세균의 생존 여부를 확인하였다. 두 가지 실험을 바탕으로 본 연구에서는 9.
혈액배양 용기가 BACTEC FX (Becton Dickinson, USA) 시스템에 의해 양성으로 확인 되 었을 때, 배양용기에서 검체를 채취하여 그람염색과 계대배양을 실시한 후 혈액우무배지(Asan BAP I; Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)와 맥컨키우무배지(Asan Mac II; Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)에 각각 100 µL씩 접종하여 계대배양하였다. 배양 후 고형배지에 형성된 세균 집락들은 Vitek 2 시스템의 Gram Positive card (GP card; bioMerieux), Gram Negative card (GN card; bioMerieux), Anaerobic card (ANC card; bioMerieux) 그리고 Neisseria, Haemophilus card (NH card bioMerieux)를 사용하여 동정하였다.
본 연구에서는 사슬알균(streptococci)과 혈장응고효소 음성 포도알균(CNS)의 동정 정확도가 그람음성 세균보다 낮았고, 세포벽이 두꺼운 효모양 진균에 대해서는 검사를 진행하지 않았다. 향후 검사에 사용되는 검체량을 줄이고, 그람양성 세균과 효모양 진균에 대한 동정의 정확도를 높일 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
이에 본 연구에서는 혈액배양에서 신속한 세균 동정 결과를 얻기 위해 혈액배양 양성에서 계대배양 없이 세균을 Vitek MS 시스템과 Vitek 2 시스템에 직접 접종하였고, 도출된 결과를 표준법과 비교하여 신뢰도와 정확도를 평가하였다. 본 연구에서 Enterobacteriaceae, GNFB 및 staphylococci에 대한 정확한 동정에 대한 비율은 각각 97.
첫째, 사포닌 농도에 따른 시간별 적혈구, 백혈구의 용해 여부를 확인하였다. 적혈구, 백혈구 측정은 Neubauer chamber로 시행하였다. 둘째, 각 농도별 세균의 생존 여부를 확인하였다.
본 실험에서는 세균의 생존에 전혀 영향을 주지 않으면서 가격이 저렴하고 신속하게 혈액의 세포 성분을 파괴하여 제거할 수 있는 두 가지 성분인 염화암모늄 용액과 사포닌 용액을 혼합하여 빠르고 신속하게 용해되는 용해액의 농도와 적절한 반응 시간을 찾고자 하였다. 첫째, 사포닌 농도에 따른 시간별 적혈구, 백혈구의 용해 여부를 확인하였다. 적혈구, 백혈구 측정은 Neubauer chamber로 시행하였다.
표적 슬라이드에 점적한 검체의 상태가 좋지 않아 Vitek MS 시스템의 스펙트럼 피크가 충분히 나오지 않을 땐 "bad-spectrum" 또는 "peaks not enough"이라는 경고 메시지가 나오면 "no identification"으로 하였다.
필터 처리한 현탁액은 4,500 ×g에서 3분간 원심분리하고 침사는 0.45% NaCl에 재부유하였다.
혈액배양 용기가 BACTEC FX (Becton Dickinson, USA) 시스템에 의해 양성으로 확인 되 었을 때, 배양용기에서 검체를 채취하여 그람염색과 계대배양을 실시한 후 혈액우무배지(Asan BAP I; Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)와 맥컨키우무배지(Asan Mac II; Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)에 각각 100 µL씩 접종하여 계대배양하였다.
혈액배양액에서 채취한 시료는 Vitek 2를 이용한 표준방법으로 세균 동정을 진행하였으며, 혈액배양액에서 직접 Vitek MS (bioMerieux, Marcy L’Etoile, France)시스템으로 세균을 동정하여 그 유용성을 평가하였다.

대상 데이터

둘째, 각 농도별 세균의 생존 여부를 확인하였다. 두 가지 실험을 바탕으로 본 연구에서는 9.26% 염화암모늄 용액(0.1 mL)과 2% 사포닌 용액을 혼합하여 사용하였다.
연구에 사용된 검체는 서울 소재 1300병상 규모의 C 종합병원에 입원한 환자의 혈액배양 검체 중 양성으로 확인된 254개의 혈액 배양액을 대상으로 하였다. 혈액배양액에서 채취한 시료는 Vitek 2를 이용한 표준방법으로 세균 동정을 진행하였으며, 혈액배양액에서 직접 Vitek MS (bioMerieux, Marcy L’Etoile, France)시스템으로 세균을 동정하여 그 유용성을 평가하였다.

데이터처리

산소성/소아용 배지는 적혈구와 백혈구를 용해하기 위하여 용해 단계인 염화암모늄 용액 1 mL, 5% 사포닌 용액 5 mL를 침사와 섞은 후 10분 방치가 추가 되었다. 스펙트럼 분석을 위해 Vitek MS IVD system v2.0을 사용하였고 결과는 제조자가 제공한 라이브러리 v2.0과 비교하였다. 스펙트럼은 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739)을 사용하여 정도 관리를 시행하였다.
혈액배양병에 따른 평가는 산소성/무산소성병의 성능을 통계적으로 비교하기 위해 Chi-square test 또는 Fisher's exact test를 사용하였다.

이론/모형

0과 비교하였다. 스펙트럼은 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739)을 사용하여 정도 관리를 시행하였다. Vitek MS에서 표적슬라이드의 결과 값이 90% 이상의 신뢰 수준을 보였을 경우 유효한 결과로 사용하였다.

성능/효과

Vitek MS 시스템의 세균 동정 시 "no identification"결과를 제외하고 직접법과 표준방법의 일치 기준은 매우 신뢰할 만하며(99.5%, 207/208), "no identification" 결과의 대부분은 표적슬라이드에 점적한 검체 상태가 좋지 않은 것으로 Vitek MS 시스템에서는 "bad spectrum" 또는 "not enough peaks"라는 경고 메시지가 나타났다.
스펙트럼은 대장균(Escherichia coli, ATCC 8739)을 사용하여 정도 관리를 시행하였다. Vitek MS에서 표적슬라이드의 결과 값이 90% 이상의 신뢰 수준을 보였을 경우 유효한 결과로 사용하였다.
균종별 정확도는 Enterobacteriaceae, glucose nonfermentative bacilli (GNFB), staphylococci의 정확도는 각각 81/83 (97.6%), 12/15 (80.0%), 72/85 (84.7%)로 나타났다. Vitek MS에서는 45주가 동정되지 않았고, 그 중 29주는 "bad spectrum"경고 메시지로 인해 동정되지 않았으며, 9주는 "not-identified"으로 하였으며, 7주는 "not enough peaks"라는 경고 메시지가 표시되고 동정되지 않았다.
2%)주는 종 수준까지 동정되었고, 12주는 속 수준까지 동정되었다. 그람염색 결과에 따르면 그람양성 세균에서는 108 (73.9%)주, 그람음성 세균에서는 100 (92.6%)주가 동정되었다.
이에 본 연구에서는 혈액배양에서 신속한 세균 동정 결과를 얻기 위해 혈액배양 양성에서 계대배양 없이 세균을 Vitek MS 시스템과 Vitek 2 시스템에 직접 접종하였고, 도출된 결과를 표준법과 비교하여 신뢰도와 정확도를 평가하였다. 본 연구에서 Enterobacteriaceae, GNFB 및 staphylococci에 대한 정확한 동정에 대한 비율은 각각 97.6%, 80.0% 및 84.7%였다. 그람양성 균주는 MALDI-TOF MS 시스템으로 다른 검체를 직접법으로 시행한 방법에서도 상대적으로 낮은 동정률을 보였다[13].
4. 통계 분석

분리 세균의 동정은 고형배지에서 계대배양하여 Vitek 2 시스템을 사용한 표준방법과 Vitek MS 시스템을 사용한 혈액배양 직접법이 동일한 결과를 얻으면 식별이 정확하다고 간주하였다. Vitek MS 시스템을 사용한 혈액배양 직접법의 결과와 표준 방법의 결과와 다른 결과를 보이는 경우, 동정은 부정확(misidentification)한 것으로 간주하였다.
960). 산소성 및 무산소성 그람음성 세균의 정확한 동정률은 각각 88.8% 및 97.3%이었다(p=0.783). 33/182개의 산소성 배양병과 17/145개의 무산소성 배양병에서는 세균이 동정되지 않았다 (p=0.
742). 산소성 및 무산소성 배양병에서의 그람양성 세균의 정확한 동정률은 각각 76.2% 및 77.4%이었다(p=0.960). 산소성 및 무산소성 그람음성 세균의 정확한 동정률은 각각 88.
전체적으로 Vitek 2는 208주(81.8%)의 세균을 정확히 동정하였고, 45주는 동정되지 않았다. 동정 오류 검체는 Propionibacterium acnes를 Clostridium bifermentans로 잘못 동정한 한 건이 발생하였다.
직접 MALDI-TOF MS 방법으로 세균 동정 검사를 시도한 다른 프로토콜의 검사 결과와 비교해 보았을 때 CNS는 유사한 결과(63.3∼83.5%)를 보였다.
그람양성 균주는 MALDI-TOF MS 시스템으로 다른 검체를 직접법으로 시행한 방법에서도 상대적으로 낮은 동정률을 보였다[13]. 표준 방법과 비교하여, 직접법은 특히 그람음성 그룹에서 빠르고 신뢰성 있는 결과를 나타냈다. 이 실험 결과는 그람양성 균주(64.

후속연구

Monteiro J, Marinach-Patrice C 등은 streptococci와 staphylococci에 의한 MALDI-TOF MS 결과의 낮은 동정률은 종간의 관련성과 세균 세포벽 조성에 기인한다고 주장했다[14,15]. MALDI-TOF MS에서 다른 균으로 잘못 동정된 P. acnes에 대해서는 추후 연구가 되어야 할 것으로 사료된다. 특히 이 세균은 집락에서 직접 검사 시에도 잘못 동정된 경우가 있는 것으로 보고되었다[16].
본 연구에서는 사슬알균(streptococci)과 혈장응고효소 음성 포도알균(CNS)의 동정 정확도가 그람음성 세균보다 낮았고, 세포벽이 두꺼운 효모양 진균에 대해서는 검사를 진행하지 않았다. 향후 검사에 사용되는 검체량을 줄이고, 그람양성 세균과 효모양 진균에 대한 동정의 정확도를 높일 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 19개의 소아배양 중 Staphylococcus epidermidis (5), Staphylococcus aureus (1), Staphylococcus saprophyticus (1), Escherichia coli (1), Pseudomonas aeruginosa (1), Neisseria spp.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	패혈 쇼크란 무엇인가?	중증 패혈증은 패혈증과 함께 저혈압, 장기부전, 조직 관류 저하가 동반되는 상황으로 정의된다[1]. 패혈 쇼크는 적절한 수액 치료에도 수축기 혈압 90 mmHg 이하 혹은 평균 동맥압 65 mmHg 이하를 동반하는 경우를 말한다[1,3]. 최근의 한 연구에 따르면 중증패혈증 환자들의 성별 사망률은 남성과 여성이 각각 66.
	중증 패혈증이란 무엇인가?	중증 패혈증은 패혈증과 함께 저혈압, 장기부전, 조직 관류 저하가 동반되는 상황으로 정의된다[1]. 패혈 쇼크는 적절한 수액 치료에도 수축기 혈압 90 mmHg 이하 혹은 평균 동맥압 65 mmHg 이하를 동반하는 경우를 말한다[1,3].
	미국에서 패혈증은 어떠한 특징을 가지는가?	패혈증은 다양한 감염증을 동반할 수 있고, 여러 종류의 세균이 원인이 되어 나타나기 때문에 그 원인균을 규명하기 위해 혈액배양이 필수적이다[1]. 미국의 경우 매일 2천명 이상의 새로운 환자가 발생하며 사망률이 30∼50%로 매우 높은 질환이다[2].

참고문헌 (16)

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Coltella L, Mancinelli L, Onori M, Lucignano B, Menichella D, Sorge R, et al. Advancem ent in the routine identification of anaerobic bacteria by MALDI-TOF mass spectrom etry. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2013;32(9):1183-1192.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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