강원도 양식 연어과 어류에서 분리된 에로모나스 종의 유전학적 동정 Genetic identification of Aeromonas species using a housekeeping gene, rpoD, in cultured salmonid fishes in Gangwon-Do원문보기
현재 양식장에서는 Aeromonad를 비롯한 다양한 병원균에 의한 전염병으로 인해 많은 경제적 손실을 겪고 있다. 연어과 어류뿐만 아니라 담수 및 해수어류에도 치명적인 감염을 야기하는 Aeromonas 종은 적어도 26종 이상이 보고되어왔으며, 전염병을 유발하는 유비쿼터스 세균이다. Aeromonas 종을 확인하기 위해 16S rDNA 및 하우스 키핑 유전자의 핵산 서열을 기반으로 한 분자생물학적 기술이 사용될 수 있다. 본 연구에서 Aeromonas 종은 강원도 16개 양식장의 연어과 어류로부터 분리되었으며 Aeromonad의 16S rDNA와 하우스 키핑 유전자의 서열, 즉 RNA polymerase sigma factor ${\sigma}^{70}$ (rpoD) 또는 DNA gyrase subunit B (gyrB)를 기반으로 계통 발생 학적으로 동정했다. 그 결과 대서양 연어 (Salmo salar), 은연어 (Oncorhynchus keta), 산천어 (Oncorhynchus masou masou), 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss)에서 96 개의 균주가 수집되었으며, 36개의 균주가 16S rDNA 분석에 의해 Aeromonas 속으로 확인되었다. 확인된 Aeromonas 속 균주는 rpoD 또는 gyrB 유전자 서열을 기반으로 추가 분석되어 Aeromonas salmonicida (24 균주), A. sobria (10 균주), A. media (1 균주) 및 A. popoffii (1 균주)로 검출되었으며, 이 것은 Aeromonas salmonicida가 강원도의 연어과 어류에서 주요 감염균임을 나타낸다. 또 하우스 키핑 유전자의 서열에 기초한 Aeromonas 종의 계통발생학적 동정은 16S rDNA 서열보다 더 정확하다는 것이 또한 증명되었다.
현재 양식장에서는 Aeromonad를 비롯한 다양한 병원균에 의한 전염병으로 인해 많은 경제적 손실을 겪고 있다. 연어과 어류뿐만 아니라 담수 및 해수어류에도 치명적인 감염을 야기하는 Aeromonas 종은 적어도 26종 이상이 보고되어왔으며, 전염병을 유발하는 유비쿼터스 세균이다. Aeromonas 종을 확인하기 위해 16S rDNA 및 하우스 키핑 유전자의 핵산 서열을 기반으로 한 분자생물학적 기술이 사용될 수 있다. 본 연구에서 Aeromonas 종은 강원도 16개 양식장의 연어과 어류로부터 분리되었으며 Aeromonad의 16S rDNA와 하우스 키핑 유전자의 서열, 즉 RNA polymerase sigma factor ${\sigma}^{70}$ (rpoD) 또는 DNA gyrase subunit B (gyrB)를 기반으로 계통 발생 학적으로 동정했다. 그 결과 대서양 연어 (Salmo salar), 은연어 (Oncorhynchus keta), 산천어 (Oncorhynchus masou masou), 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss)에서 96 개의 균주가 수집되었으며, 36개의 균주가 16S rDNA 분석에 의해 Aeromonas 속으로 확인되었다. 확인된 Aeromonas 속 균주는 rpoD 또는 gyrB 유전자 서열을 기반으로 추가 분석되어 Aeromonas salmonicida (24 균주), A. sobria (10 균주), A. media (1 균주) 및 A. popoffii (1 균주)로 검출되었으며, 이 것은 Aeromonas salmonicida가 강원도의 연어과 어류에서 주요 감염균임을 나타낸다. 또 하우스 키핑 유전자의 서열에 기초한 Aeromonas 종의 계통발생학적 동정은 16S rDNA 서열보다 더 정확하다는 것이 또한 증명되었다.
At the present, fish farms are suffering a lot of economic losses due to infectious diseases caused by various pathogens including aeromonad. Aeromonad is ubiquitous bacteria that causes infectious diseases. At least 26 species in the genus Aeromonas have been reported to cause fatal infections not ...
At the present, fish farms are suffering a lot of economic losses due to infectious diseases caused by various pathogens including aeromonad. Aeromonad is ubiquitous bacteria that causes infectious diseases. At least 26 species in the genus Aeromonas have been reported to cause fatal infections not only in salmonid fishes, but also in other freshwater and seawater fishes. Molecular techniques based on nucleic acid sequences of 16S rDNA and housekeeping genes can be used to identify the Aeromonas species. In this study, The genus Aeromonas was isolated from salmonid fishes of sixteen fish farms in Gangwon-Do, Korea and phylogenetically identified based on the sequences of 16S rDNA and housekeeping genes for Aeromonad, i.e. RNA polymerase sigma factor ${\sigma}^{70}$ (rpoD) or DNA gyrase subunit B (gyrB). Consequently, 96 strains were collected from Atlantic salmon (Salmo salar), coho salmon (Oncorhynchus kisutch), masou salmon (Oncorhynchus masou) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), and 36 isolates were identified as the genus Aeromonas by 16S rDNA analysis. Thirty six Aeromonad isolates were further analysed based on rpoD or gyrB gene sequences and found Aeromonas salmonicida (24 isolates), A. sobria (10 isolates), A. media (1 isolates) and A. popoffii (1 isolates), indicating that A. salmonicida is a main infectious bacteria in Salmonid fishes in Gangwon-Do. It was also proved that the phylogenetic identification of Aeromonas species based on the sequences of housekeeping gene is more precise than the 16S rDNA sequence.
At the present, fish farms are suffering a lot of economic losses due to infectious diseases caused by various pathogens including aeromonad. Aeromonad is ubiquitous bacteria that causes infectious diseases. At least 26 species in the genus Aeromonas have been reported to cause fatal infections not only in salmonid fishes, but also in other freshwater and seawater fishes. Molecular techniques based on nucleic acid sequences of 16S rDNA and housekeeping genes can be used to identify the Aeromonas species. In this study, The genus Aeromonas was isolated from salmonid fishes of sixteen fish farms in Gangwon-Do, Korea and phylogenetically identified based on the sequences of 16S rDNA and housekeeping genes for Aeromonad, i.e. RNA polymerase sigma factor ${\sigma}^{70}$ (rpoD) or DNA gyrase subunit B (gyrB). Consequently, 96 strains were collected from Atlantic salmon (Salmo salar), coho salmon (Oncorhynchus kisutch), masou salmon (Oncorhynchus masou) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), and 36 isolates were identified as the genus Aeromonas by 16S rDNA analysis. Thirty six Aeromonad isolates were further analysed based on rpoD or gyrB gene sequences and found Aeromonas salmonicida (24 isolates), A. sobria (10 isolates), A. media (1 isolates) and A. popoffii (1 isolates), indicating that A. salmonicida is a main infectious bacteria in Salmonid fishes in Gangwon-Do. It was also proved that the phylogenetic identification of Aeromonas species based on the sequences of housekeeping gene is more precise than the 16S rDNA sequence.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 연어과 어류의 Aeromonas 발병 현황을 정확히 분석하기 위하여 한국의 강원도 16개 어류 양식장의 연어과 어류에서 Aeromonas를 분리하고 16S rDNA의 서열과 하우스키핑유전자인 rpoD 혹은 gyrB 유전자 서열을 기반으로 종수준에서 동정하였다
제안 방법
분리 균주의 생리학적 및 생화학적 특성 규명을 위해 Gram-stain (B1, YD, Korea)과 API 20E TEST(BioMe´rieux, France)를 실시하였다. Gram-stain은 TSA 배지에 순수 배양된 단일 콜로니를 백금이를 이용하여 슬라이드위에 올려놓고 제조사의 설명서에 따라 진행되었으며, 현미경 (CH30RF200, Olym- pus, Japan)으로 관찰하였을 때 청자색이면 그람양성균, 적색이면 그람음성균으로 판정하였다. 또 API 20E TEST는 제조사의 설명서에 따라 25±2℃에서 24～48 시간 배양하여 반응 결과를 확인하였다.
UV transilluminator 상에서 특이적인 밴드가 확인된 샘플을 회수 및 정제하기 위해 Expin™ com- bo kit (GeneAll, Korea)를 사용하여 Gel purification을 진행하였다.
해수에서 분리된 균주는 1% sodium chloride (Usb, USA)가 첨가된 TSA 배지에 배양하였다. 그리고 단일 균주를 순수분리하기 위해 다시 멸균된 백금이를 이용하여 TSA 배지에계대 배양하여 최종적으로 순수 분리된 균주를 얻었다. 그리고 콜로니 성상과 색소생성 유무를 면밀히 관찰하여 기록하였다.
그리고 단일 균주를 순수분리하기 위해 다시 멸균된 백금이를 이용하여 TSA 배지에계대 배양하여 최종적으로 순수 분리된 균주를 얻었다. 그리고 콜로니 성상과 색소생성 유무를 면밀히 관찰하여 기록하였다. 모든 균은 tryptic soy broth (TSB) 배지에서 24 시간 배양한 뒤 20% glyc- erol (GLY001.
또 API 20E TEST는 제조사의 설명서에 따라 25±2℃에서 24～48 시간 배양하여 반응 결과를 확인하였다.
본 연구에서는 16S rDNA 분석에 의해 Aeromonas 속으로 판명된 균주의 종간 구분을 위해 rpoD 를기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 동정하였으며 rpoD 유전자 서열에 의하여 정확한 종의 동정이 안 되는 한 개의 균주에 대해서만 다시 gyrB유전자를 이용하여 종 동정을 실시하였다. 최초rpoD 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR을 실시한 결과 rpoD의 F1과 R1 프라이머 조합의 산물은 약 118 bp로 나타났고, F1와 R2는 약 331bp, F2와 R1의 프라이머 조합은 약 547 bp으로 나타나 기대했던 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었다 (Fig.
2). 본 연구에서는 A. salmonicida와 A. so- bria 종이 집중적으로 분리되어 이후 실험에서는 집약적으로 나타나는 종의 분리와 PCR 상의 명확하게 단편을 형성하는 F2와 F1 조합의 프라이머를 사용하였다.
분리 균주의 생리학적 및 생화학적 특성 규명을 위해 Gram-stain (B1, YD, Korea)과 API 20E TEST(BioMe´rieux, France)를 실시하였다.
염기서열분석결과를 BioEdit version 7.2.5 를 이용하여 증폭된 염기서열이 정확한 Peak를 형성하는지 확인하였다. MEGA7 프로그램의 CLUSTALW방법으로 multiple sequence alignment 를 진행했고 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 blast search (Megablast)을 통해 Gen- Bank에 등록되어 있는 균주들의 염기서열과 비교하여 동정을 실시하였다.
중합연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR) 혼합물은 멸균증류수 7.5 ㎕와 prime Taq DNA Polymerase 1.25 unit, 2X reaction buffer, 4 mMMgCl2, enzyme stabilizer, sediment, loading dye, 0.5mM each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP가 포함된 Premix 12.5 μl (Genetbio, Korea)와 foward와 reverse primer (10 pmol)를 각 1 ㎕ 씩 첨가한 혼합액에 sin- gle colony를 첨가하였고, 멸균증류수를 첨가하여 최종 볼륨은 25 ㎕로 조정하고, 혼합한 뒤 thermal cycler (Model 2720, Applied Biosystems, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다.
프라이머의 조합에 따라 생기는 단편의 길이에 맞춰서 신장 시간을 조정하였다. 증폭된 생성물을 확인하기 위해 ethidium bromide가 0.5 ㎕/ mL 농도로 첨가된 1.5% agarose gel에서 0.5 X TAE Buffer (20 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH8.0)를 완충액으로 하여 100V에서 25~30 분간 전기영동한 후 Gel Logic 100 Image system (Kodak,USA)에서 Molecular Imaging Soft version 4.0(Kodak, USA)으로 최종 산물을 확인하였다. PCR에 사용된 프라이머는 Table 1에 표시하였다
그 후, 72℃에서 7 분간 최종 신장 단계를 거쳤다. 프라이머의 조합에 따라 생기는 단편의 길이에 맞춰서 신장 시간을 조정하였다. 증폭된 생성물을 확인하기 위해 ethidium bromide가 0.
대상 데이터
Aeromonas 균주를 얻기 위하여 2017년 1월에서 9월 사이에 강원도에 위치한 총 16개의 양식장으로부터 무지개송어, 대서양연어, 은연어, 산천어(Oncorhynchus masou masou)로부터 세균성 질병 증상을 나타내는 어체를 샘플링한 후 아가미, 간, 비장, 전신, 궤양부분을 채취하여 tryptic soy agar(TSA) 배지 (236950, BD, USA) 에 도말한 뒤, 25℃에서 24 시간 배양하였다. 해수에서 분리된 균주는 1% sodium chloride (Usb, USA)가 첨가된 TSA 배지에 배양하였다.
36개의 Aeromonas 속의 균주는 그람 염색결과 그람음성간균임을 확인했으며, 25℃에서 24 시간 배양하였을 때 TSA 배지에서의 콜로니 형상을 관찰할 수 있었다. 앞서 언급한 것처럼 배지에서 갈색색소는 A. salmonicida를 쉽게 판별할 수 있는 방법인데 동일하게 본 연구에서 분리된 24개의 A.salmonicida균주 중 23개는 티로신이 첨가된 배지에서 갈색색소를 형성하였다. 그러나 예외로 1개의 균주에서는 이전 연구와 마찬가지로 비정형 A.
데이터처리
5 를 이용하여 증폭된 염기서열이 정확한 Peak를 형성하는지 확인하였다. MEGA7 프로그램의 CLUSTALW방법으로 multiple sequence alignment 를 진행했고 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 blast search (Megablast)을 통해 Gen- Bank에 등록되어 있는 균주들의 염기서열과 비교하여 동정을 실시하였다.
성능/효과
36개의 Aeromonas 속의 균주는 그람 염색결과 그람음성간균임을 확인했으며, 25℃에서 24 시간 배양하였을 때 TSA 배지에서의 콜로니 형상을 관찰할 수 있었다. 앞서 언급한 것처럼 배지에서 갈색색소는 A.
, 2005에 따르면 Vibrio 종들의 보다 명확하게 계통발생학적 분석을 위해 rpoA, recA,pyrH 등의 유전자를 고려해야 된다고 보고하고 있다. 그 외 토양 같은 자연환경에 널리 분포하고 있는 Acinetobacter속, Arthrobacter속 균주가 4개와 3개의 균주로 각각 분리되었고, 장내세균인 Citro- bacter속 4개 균주가 분리되었다.
,2011). 그러나 rpoD 유전자는 A. allosaccharophila와 A. veronii, A. lusitana와 A. tecta를 명확히 구별하지 못하는 것으로 나타났다
sobria 의 경우 16S rDNA 결과와 하우스키핑유전자를 이용하였을 때 결과가 일치하였고, 이는 Soler 등 (2004)의 보고와도 일치하지만 본 연구에서는 오직 1종에서만 분리하였기 때문에 지속적인 확인이 필요하다. 따라서 연어과어류에 감염되는 Aeromonas 속의 정확한 종 동정은rpoD와 gyrB 유전자의 서열을 기반으로 한 Aero- monas 종간 구분은 16S rDNA 서열보다 정확한 것으로 나타났다.
rivipollensis 중 정확하게 확정을 할 수 없었는데 이는 이 두 종의 rpoD유전자 염기서열이 매우 유사하기 때문이었다. 따라서 추가적으로 gyrB 유전자 염기서열분석을 실시한 결과 A. media로 확정되었다 (Table 3). 외국문헌에 의하면 다양한 Aeromonas 종들이 보고되고 있으나(Beaz-Hidalgo et al.
3). 또 계통발생학적 관계는 A.salmonicida와 A. popoffii 과의 종간 유연성이 가장 높았으며, 다음 A. media 과 A. popoffi 순으로 나타났다. 이러한 결과는 Beaz-Hidalgo 등 (2009)의 이전 연구와 일치한다.
sobria 가 10개 균주로서 동정되어 뒤를 이었다 (Table 3). 또 본연구에서는 1개의 균주는 rpoD 유전자를 이용한 종 감별에서 A. media와 A. rivipollensis 중 정확하게 확정을 할 수 없었는데 이는 이 두 종의 rpoD유전자 염기서열이 매우 유사하기 때문이었다. 따라서 추가적으로 gyrB 유전자 염기서열분석을 실시한 결과 A.
bestia- rum인 것으로 나타나 구별할 수 없었으며 이는 이들 종간의 16S rDNA 염기서열의 높은 유사성의 시사한다. 또한 A. media와 A. popoffii도 16S rDNA유전자 분석에서 다양한 Aeromonas 종과 일치하는 결과를 나타내어 정확한 종을 동정하는 것은 어려웠다. 그러나 A.
이러한 결과는 Beaz-Hidalgo 등 (2009)의 이전 연구와 일치한다. 본 연구에서 gyrB와 rpoD 유전자를 사용하여 확인된 Aeromonas 균주는 계통발생학적으로 분리되지 않는 균주는 없었다. 또한 Aeromonas 종간 구분을 위해 dnaJ, recA, dnaX, gyrA 등의 하우스키핑유전자가 고려될 수 있으며, 이들 유전자의 종간의 계통발생학적 차이는 각각 다르다고 알려져 있다 (Martinez-Murcia et al.
본 연구에서 증폭된 rpoD-gyrB 유전자 염기서열을 바탕으로 계통수 분석을 실시한 결과, A. salo- monicida, A. sobria, A. media 그리고 A. popoffi는각종 간에 명확한 차이를 나타내고 분리 군집을 형성하였다 (Fig. 3). 또 계통발생학적 관계는 A.
본 연구에서는 16S rDNA 분석을 통해 Aeromonas 속으로 확인된 36개 균주를 rpoD 유전자 염기서열을 분석하여 동정한 결과 A. salmonicida가 24 균주로 67%에 달하였으며, 그 뒤로는 A. sobria 가 10개 균주로서 동정되어 뒤를 이었다 (Table 3). 또 본연구에서는 1개의 균주는 rpoD 유전자를 이용한 종 감별에서 A.
본 연구에서는 강원도의 16개 어류 양식장의 연어과 어류인 무지개송어, 대서양연어, 은연어, 산천어에서 순수 분리된 균주들의 동정을 위해 16SrDNA 유전자를 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과 약 1300 bp의 유전자 단편을 확인하였으며 (Fig. 1) 그 결과 분리된 96 균주 중 36 균주가 Aeromonas 속의 균주였으며 그 다음으로 Pseudomonas 속이 17 균주로 가장 많이 분리되었다 (Table 2). 그 외 비병원성 유산균인 Carno- bacterium sp.
연구결과 rpoD 유전자 분석법에 의해 A. salmo- nicida로 최종 판별된 24개의 균주는 16S rDNA 분석에서 A. salmonicida 혹은 A. hydrophila, A. bestia- rum인 것으로 나타나 구별할 수 없었으며 이는 이들 종간의 16S rDNA 염기서열의 높은 유사성의 시사한다. 또한 A.
마지막으로 EB buffer 20 ㎕ (12000 ×g, 2 min)를 넣고 원심 분리하여 순수하고 정제된 DNA 조각을 수득하게 된다. 정제된 DNA 는 전문회사에 보내 염기서열분석을 요청하였는데, Ter- minator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, USA)와 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)를 사용하여 PCR 반응을 진행한 후 반응에 참여하지 않은 dNTP와 반응물을 제거하고 ABI 3730xl DNA Analyzer (AppliedBiosystems, USA)에서 시퀀싱 결과를 얻었다 (Ma- crogen, Korea).
본 연구에서는 16S rDNA 분석에 의해 Aeromonas 속으로 판명된 균주의 종간 구분을 위해 rpoD 를기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 동정하였으며 rpoD 유전자 서열에 의하여 정확한 종의 동정이 안 되는 한 개의 균주에 대해서만 다시 gyrB유전자를 이용하여 종 동정을 실시하였다. 최초rpoD 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR을 실시한 결과 rpoD의 F1과 R1 프라이머 조합의 산물은 약 118 bp로 나타났고, F1와 R2는 약 331bp, F2와 R1의 프라이머 조합은 약 547 bp으로 나타나 기대했던 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 본 연구에서는 A.
후속연구
popoffii도 16S rDNA유전자 분석에서 다양한 Aeromonas 종과 일치하는 결과를 나타내어 정확한 종을 동정하는 것은 어려웠다. 그러나 A. sobria 의 경우 16S rDNA 결과와 하우스키핑유전자를 이용하였을 때 결과가 일치하였고, 이는 Soler 등 (2004)의 보고와도 일치하지만 본 연구에서는 오직 1종에서만 분리하였기 때문에 지속적인 확인이 필요하다. 따라서 연어과어류에 감염되는 Aeromonas 속의 정확한 종 동정은rpoD와 gyrB 유전자의 서열을 기반으로 한 Aero- monas 종간 구분은 16S rDNA 서열보다 정확한 것으로 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
강원도 지역의 주요 양식 어종은?
현재 양식현장에서는 어류의 다양한 병원체에 의한 감염성 질병으로 인하여 많은 경제적 손실이 발생하고 있다. 특히 강원도 지역은 무지개송어(Oncorhynchus mykiss), 대서양연어 (Salmo salar) 등을 비롯한 연어과 어류가 주요 양식어종이다. 최근 강원도 각 지자체에서 행해지는 송어축제 등 다방면으로 수요가 급증하고 있어 예전에 비하여 송어의 가격이 매우 상승하였다.
최근 송어의 가격이 매우 상승한 이유는?
특히 강원도 지역은 무지개송어(Oncorhynchus mykiss), 대서양연어 (Salmo salar) 등을 비롯한 연어과 어류가 주요 양식어종이다. 최근 강원도 각 지자체에서 행해지는 송어축제 등 다방면으로 수요가 급증하고 있어 예전에 비하여 송어의 가격이 매우 상승하였다. 또 동해 STF 등의 산업체에서는 대서양 연어와 은연어 (Oncorhynchusketa) 등을 새로운 양식어종으로 담수 및 해수 양식을 시도하고 있다.
Aeromonas 속이 포함하고 있는 것은?
, 2011). 또한 운동성, 비운동성 그리고중온성 및 냉수성 종을 포함하고 있으며 일반적으로 옥시다제, 카탈라아제 그리고 글루코즈에서 양성 반응을 일으킨다 (Martinez-Murcia et al., 2011).
참고문헌 (21)
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