C2C12 근관세포에서 상엽에 의한 AMPK의 불활성화와 AICAR로 유도된 근위축 억제의 연관성에 관한 연구 Ethanol Extract of Mori Folium Inhibits AICAR-induced Muscle Atrophy Through Inactivation of AMPK in C2C12 Myotubes원문보기
AMPK는 세포 내 에너지 균형을 조절하는 조절자 및 에너지 센서이며, 특히 골격근에서는 muscle-specific ubiquitin ligases의 조절을 통한 근육 단백질 분해를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 한편 상엽은 다양한 약리학적 효능을 가지는 전통약재 중 하나이지만 근위축과 관련된 효능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 C2C12 myotubes에서 AMPK 활성제인 AICAR가 유발하는 근위축 및 관련 유전자의 발현과 함께 상엽 에탄올 추출물(ethanol extracts of Mori Folium, EEMF)이 유발하는 근위축 억제 효능에 대해서 조사하였다. 먼저 C2C12 myoblasts에 AICAR를 처리하였을 경우 AMPK 활성화가 유발되었으며, 하위 단계에 있는 FoxO3a의 발현 증가와 함께 muscle-specific ubiquitin ligases인 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 증가와 muscle-specific transcription factors인 MyoD 및 myogenin의 발현 감소가 유발되었다. 또한 분화가 유발된 C2C12 myotubes에 세포독성이 없는 조건의 AICAR를 처리하였을 경우 근위축이 유발되었으며, EEMF는 AMPK 불활성화 및 FoxO3a 발현 억제를 유발함으로서 AICAR 처리에 의한 근위축을 억제하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과에서 AICAR에 의한 AMPK 활성화가 근위축을 유발한다는 것을 알 수 있었으며, EEMF는 AMPK signaling pathway를 통하여 AICAR에 의한 근위축을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
AMPK는 세포 내 에너지 균형을 조절하는 조절자 및 에너지 센서이며, 특히 골격근에서는 muscle-specific ubiquitin ligases의 조절을 통한 근육 단백질 분해를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 한편 상엽은 다양한 약리학적 효능을 가지는 전통약재 중 하나이지만 근위축과 관련된 효능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 C2C12 myotubes에서 AMPK 활성제인 AICAR가 유발하는 근위축 및 관련 유전자의 발현과 함께 상엽 에탄올 추출물(ethanol extracts of Mori Folium, EEMF)이 유발하는 근위축 억제 효능에 대해서 조사하였다. 먼저 C2C12 myoblasts에 AICAR를 처리하였을 경우 AMPK 활성화가 유발되었으며, 하위 단계에 있는 FoxO3a의 발현 증가와 함께 muscle-specific ubiquitin ligases인 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 증가와 muscle-specific transcription factors인 MyoD 및 myogenin의 발현 감소가 유발되었다. 또한 분화가 유발된 C2C12 myotubes에 세포독성이 없는 조건의 AICAR를 처리하였을 경우 근위축이 유발되었으며, EEMF는 AMPK 불활성화 및 FoxO3a 발현 억제를 유발함으로서 AICAR 처리에 의한 근위축을 억제하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과에서 AICAR에 의한 AMPK 활성화가 근위축을 유발한다는 것을 알 수 있었으며, EEMF는 AMPK signaling pathway를 통하여 AICAR에 의한 근위축을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
AMP-activated protein kinase (AMPK) functions as a metabolic master through regulating and restoring cellular energy balance. In skeletal muscle, AMPK increases myofibril protein degradation through the expression of muscle-specific ubiquitin ligases. Mori Folium, the leaf of Morus alba, is a tradit...
AMP-activated protein kinase (AMPK) functions as a metabolic master through regulating and restoring cellular energy balance. In skeletal muscle, AMPK increases myofibril protein degradation through the expression of muscle-specific ubiquitin ligases. Mori Folium, the leaf of Morus alba, is a traditional medicinal herb with various pharmacological functions; however, the effects associated with muscle atrophy have not been fully identified. In this study, we confirmed the effects of AMPK activation by examining the effects of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR), an activator of AMPK, on the induction of atrophy and expression of atrophy-related genes in C2C12 myotubes. We also investigated the effects of the ethanol extract of Mori Folium (EEMF) on the recovery of AICAR-induced muscle atrophy in C2C12 myotubes. It was found that exposure to AICAR resulted in the stimulation of Forkhead box O3a (FOXO3a); an up-regulation of muscle-specific ubiquitin ligases such as Muscle Atrophy F-box (MAFbx)/atrogin-1 and muscle RING finger-1 (MuRF1), and a down-regulation of muscle-specific transcription factors, such as MyoD and myogenin; with the activation of AMPK. In addition, AICAR without cytotoxicity indicated a decrease in diameter of C2C12 myotubes. However, treatment with EEMF significantly suppressed AICAR-induced muscle atrophy of C2C12 myotubes in a dose-dependent manner as confirmed by a decrease in myotube diameter, which is associated with a reversed stimulation of FOXO3a by the inhibition of AMPK activation. These results indicate that the activation of AMPK by AICAR induces muscle atrophy, and EEMF has preeminent effects on the inhibition of AICAR-induced muscle atrophy through the AMPK signaling pathway.
AMP-activated protein kinase (AMPK) functions as a metabolic master through regulating and restoring cellular energy balance. In skeletal muscle, AMPK increases myofibril protein degradation through the expression of muscle-specific ubiquitin ligases. Mori Folium, the leaf of Morus alba, is a traditional medicinal herb with various pharmacological functions; however, the effects associated with muscle atrophy have not been fully identified. In this study, we confirmed the effects of AMPK activation by examining the effects of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR), an activator of AMPK, on the induction of atrophy and expression of atrophy-related genes in C2C12 myotubes. We also investigated the effects of the ethanol extract of Mori Folium (EEMF) on the recovery of AICAR-induced muscle atrophy in C2C12 myotubes. It was found that exposure to AICAR resulted in the stimulation of Forkhead box O3a (FOXO3a); an up-regulation of muscle-specific ubiquitin ligases such as Muscle Atrophy F-box (MAFbx)/atrogin-1 and muscle RING finger-1 (MuRF1), and a down-regulation of muscle-specific transcription factors, such as MyoD and myogenin; with the activation of AMPK. In addition, AICAR without cytotoxicity indicated a decrease in diameter of C2C12 myotubes. However, treatment with EEMF significantly suppressed AICAR-induced muscle atrophy of C2C12 myotubes in a dose-dependent manner as confirmed by a decrease in myotube diameter, which is associated with a reversed stimulation of FOXO3a by the inhibition of AMPK activation. These results indicate that the activation of AMPK by AICAR induces muscle atrophy, and EEMF has preeminent effects on the inhibition of AICAR-induced muscle atrophy through the AMPK signaling pathway.
따라서 본 연구에서는 상엽 에탄올 추출물(ethanol extracts of Mori Folium, EEMF)이 유발하는 근위축 억제 효능 및 기전 해석을 실시하였다. 이를 위하여 먼저 분화가 유발된 C2C12 myotubes에서 에너지 조절 효소인 AMPK의 약리학적 활성제로서 세포에서 AMP/ATP 비율을 증가시키고 효소 활성화에 필요한 높은 에너지 소비 조건을 모방하는 AMP 유사체인 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR)를이용한 인위적인 근위축 모델의 확립을 실시하였고, EEMF가 인위적으로 유발된 근위축 과정에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였으며, 이때 AMPK가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다.
제안 방법
근위축을 유발하기 위하여 사용된 AICAR가 C2C12 myoblasts의 생존율 및 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다양한 농도의 AICAR를 24시간 동안 처리한 후 trypan blue 염색 및 MTT assay를 이용하여 조사하였다. 먼저 trypan blue 염색을 실시한 후 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포의 수를 계수하여 비교한 결과 Fig.
AMPK가 활성화되면 FoxO3a를 경유하여 골격근에서 특이적으로 발현 되는 muscle-specific ubiquitin ligases로서 F-box type E3 ligase인 MAFbx/atrogin-1 및 Ring Finger 유형의 E3 ligase인 MuRF1의 증가를 통한 ubiquitin-proteasome 경로의 활성화를 유발함으로서 myogenic differentiation에 관여하는 muscle-specific transcription factors인 MyoD 및 myogenin의 분해를 촉진하여 근위축을 유발시키는 것으로 보고되고 있다[1, 7, 13]. 따라서 C2C12 myoblasts에서 AICAR 처리에 따른 AMPK 및 근위축 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 먼저 Fig.
상엽은 많은 종류의 flavonoid 성분을 함유하고 있으므로 다양한 약리학적 효능을 가지는 기능성 물질이라고 보고되고 있을 뿐 만 아니라 AMPK의 활성을 조절한다고 알려져 있으므로 근위축을 억제할 수 있을 것으로 예상되지만 근위축 억제와 관련된 효능 및 기전에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 C2C12 myotubes에서 AMPK 활성제인 AICAR에 의하여 유발되는 근위축 과정에서 상엽 에탄올 추출물인 EEMF 가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다. 먼저 Fig.
대상 데이터
실험에 사용된 상엽(전북, 임실)은 대한생약식품(주)에서 구입하였으며, 상엽 에탄올 추출물(ethanol extract of Mori Folium, EEMF)을 얻기 위하여 상엽 100 g 당 100% 에탄올 1 l를 첨가하여 60℃, 150 rpm으로 3일간 교반한 후 이를 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 분리된 상층액을 Whatman 필터(No.
실험에 사용된 세포주인 C2C12 myoblasts는 American Type Culture Collection (Manassa, VA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 90% DMEM, 10% FBS 및 100 unit/ml PS가포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건 하에서 배양하였다. C2C12 myoblasts를 myotubes로 분화시키기 위하여 100% confluent 상태의 세포를 대상으로 90% DMEM, 2% HS 및 100 unit/ml PS가 포함된 분화배지를 매 2일마다 교체하였으며, 근위축 유도를 위하여 적정농도의 AICAR를 24시간 동안 처리하였다.
데이터처리
모든 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests를 실시하였으며, 그 결과는 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다.
이론/모형
05% trypsin-ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이렇게 모인 세포를 대상으로 각각 1 ml의 PBS와 0.5% trypan blue solution (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가하여 2분간 염색을 실시하고 hemocytometer에 적용시킨 다음 도립 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다.
성능/효과
7B에서 나타난 바와 같이 AICAR 처리에 의하여 증가된 AMPK 및 ACC의 인산화가 EEMF에 의하여 억제되는 것으로 나타났으며, FoxO3a의 발현도 억제하는 것으로 조사되었다. 또한 EEMF는 AICAR 처리에 의하여 증가된 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현을 감소시켰으며, 감소된 MyoD 및 myogenin
의 발현을 회복시키는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 AICAR 처리에 의하여 유발된 근위축을 EEMF가 억제한다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 현상은 AMPK 활성 억제를 통한 전사인자인 FoxO3a를 억제함으로서 유발되는 ubiquitin-proteasome 경로의 차단이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
의 발현을 회복시키는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 AICAR 처리에 의하여 유발된 근위축을 EEMF가 억제한다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 현상은 AMPK 활성 억제를 통한 전사인자인 FoxO3a를 억제함으로서 유발되는 ubiquitin-proteasome 경로의 차단이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 본 연구 결과는 상엽이 근위축에 따른 근기능 퇴화를 제어할 수 있는 식의약 소재로 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 자료로서 가치가 매우 높을 것으로 생각되지만 추가적으로 상엽에 포함되어 있는 유효성분에 대한 분석과 함께 에너지 대사 및 신호전달계 등과 연관된 기전 연구가 필요할 것으로 판단된다.
결과에서 볼 수 있듯이 myoblasts에서 myotubes로 분화를 유발한 후 AICAR를 처리하였을 경우 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 증가와 함께 MyoD 및 myogenin의 발현 감소가 유발되었다. 이상의 결과에서 AMPK 활성제인 AICAR는 C2C12 myotubes의 근위축을 유발한다는 것을 알 수 있었으므로 근위축 유도인자로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
이상의 결과를 살펴볼 때 AICAR 처리에 의하여 유발된 근위축을 EEMF가 억제한다는 것을 알 수 있었으며, 이러한 현상은 AMPK 활성 억제를 통한 전사인자인 FoxO3a를 억제함으로서 유발되는 ubiquitin-proteasome 경로의 차단이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 본 연구 결과는 상엽이 근위축에 따른 근기능 퇴화를 제어할 수 있는 식의약 소재로 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 자료로서 가치가 매우 높을 것으로 생각되지만 추가적으로 상엽에 포함되어 있는 유효성분에 대한 분석과 함께 에너지 대사 및 신호전달계 등과 연관된 기전 연구가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
AMP-activated protein kinase (AMPK)는 무엇인가?
AMP-activated protein kinase (AMPK)는 serine–threonine heterotrimeric kinase로서 에너지 균형을 조절하는 중요한 조절자 및 에너지 센서이다[6, 8]. AMPK는 AMP/ATP ratio 증가에 따른 Thr172 인산화에 의하여 활성화되면 에너지 소비 과정을 억제할 뿐 만 아니라 glucose uptake 및 fatty acid oxidation을 유발함으로서 포도당 및 지질 대사를 조절하는 것으로 알려져 있다[9, 18, 25].
AMPK가 근위축에 직접 관여하는 기전은 무엇인가?
AMPK는 AMP/ATP ratio 증가에 따른 Thr172 인산화에 의하여 활성화되면 에너지 소비 과정을 억제할 뿐 만 아니라 glucose uptake 및 fatty acid oxidation을 유발함으로서 포도당 및 지질 대사를 조절하는 것으로 알려져 있다[9, 18, 25]. 최근 연구에서 AMPK가 활성화 되면 전사인자인 forkhead box O3a (FoxO3a)를 경유하여 muscle-specific ubiquitin ligases인 muscle atrophy F-box (MAFbx)/atrogin-1 및 muscle RING finger-1 (MuRF1)의 증가를 통한 ubiquitin-proteasome 경로의 활성화를 유발함으로서 근육 단백질 분해에 의한 근위축에 직접적으로 관여하는 것으로 보고되고 있다[13, 22, 26, 28]. 또한 근위축이 유발되면 myogenic differentiation에 관여하는 muscle-specific transcription factors인 MyoD 및 myogenin의 발현이 감소하는 것으로 알려져 있다[11, 27].
C2C12 myoblasts에서 AICAR를 처리하였을 시 나타나는 현상은 무엇인가?
3A 및 Fig. 3B에서 나타난 바와 같이 AICAR는 AMPK 및 AMPK의 하위단계에서 작용하는 ACC의 인산화를 농도의존적으로 증가시키는 것으로 확인되었으며, FoxO3a의 발현도 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 muscle-specific ubiquitin ligases인 MAFbx/atrogin-1 및 MuRF1의 발현 증가와 함께 muscle-specific transcription factors인 MyoD 및 myogenin의 발현 감소를 유발하였다. 이상의 결과에서 AICAR는 AMPK 및 FoxO3a를 경유한 근위축 관련 유전자의 발현을 조절함으 로서 근위축에 관여한다는 것을 예상할 수 있었다.
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