[논문]김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum K6의 생리적 특성 및 비만억제효과

김슬기; 임상동

doi:10.22424/jmsb.2017.35.4.221

[국내논문] 김치에서 분리한 Lactobacillus plantarum K6의 생리적 특성 및 비만억제효과
Physiological Characteristics and Anti-Obesity Effect of Lactobacillus plantarum K6 isolated from Kimchi 원문보기

Journal of milk science and biotechnology = 한국유가공학회지, v.35 no.4, 2017년, pp.221 - 231

초록
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본 연구는 김치로부터 비만 억제능력이 있는 젖산균을 분리 및 동정하고, 이 균주의 생리적 특성을 규명하여 상업적으로의 이용가능성을 검토하고자 실시하였다. 이를 위해 Modified MRS 분별배지를 사용하여 노란색 집락을 형성하는 균주를 대상으로 각각 ${\alpha}-amylase$ inhibitory activity, ${\alpha}-glucosidase$ inhibitory activity와 lipase inhibitory activity가 우수한 균주를 선발한 결과 K6 균주가 최종 선발되었다. K6 균주는 ${\alpha}-amylase$ 억제활성 $96.78{\pm}3.29%$, ${\alpha}-glucosidase$ 억제활성 $92.55{\pm}9.62%$, lipase 억제활성 $85.17{\pm}0.79%$, 지방분화 억제활성 $27.4{\pm}1.4%$로 나타났으며, 동정결과 Lactobacillus plantarum으로 판명되었고, Lactobacillus plantarum K6으로 명명하였다. L. plantarum K6은 답즙산과 산성의 pH에서 모두 우수한 생존력을 나타내었고, 효소활성은 전반적으로 낮았으나 arylamidase와 ${\beta}-galactosidase$에 대해 비교적 높은 효소 활성을 나타내었다. 항생제 내성 실험 결과 vancomycin, ampicillin, polymyxin B에 내성이 있는 반면 erythromycin에 감수성을 나타냈으며, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes와 Staphyloccous aureus에 대해 각각 51.8%, 42.4%, 61.6%와 54.9%의 억제 효과를 지니고 있는 것으로 나타났다. 또한, 아민을 생성하지 않으며, 장부착성은 대조구인 L. rhamnosus GG보다 우수하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study aimed to investigate the physiological characteristics and anti-obesity effects of a newly isolated bacterium, Lactobacillus plantarum K6. L. plantarum K6 showed good ${\alpha}-amylase$ inhibitory activity ($96.78{\pm}3.29%$), ${\alpha}-glucosidase$ inhibitory activity ($92.55{\pm}9.62%$), and lipase inhibitory activity ($85.17{\pm}0.79%$), and the strain inhibited the adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells ($27.4{\pm}1.4%$) when present at a concentration of $100{\mu}g/mL$. L. plantarum K6 was isolated from kimchi and its physiological characteristics were investigated. A comparison of the sensitivity of the isolate to 15 different antibiotics showed that L. plantarum K6 is highly sensitive to erythromycin and highly resistant to vancomycin, ampicillin, and polymyxin B. This strain also showed high arylamidase and ${\beta}-galactosidase$ activities. Moreover, it was relatively tolerant to bile acid and low pH, and displayed resistance to Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus, with rates of 51.8%, 42.4%, 61.6%, and 54.9%, respectively. No bio genic amines were produced. L. plantarum K6 also showed high adhesion activity to HT-29 cells compared to L. rhamnosus GG. These results demonstrate that Lactobacillus plantarum K6 has potential as a probiotic with anti-obesity effects.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 김치로부터 분리·선발된 Lactobacillus plantarum K6이 기능성 식품으로 적용할 수 있는지 알아보기 위해 L. plantarum K6의 비만 억제 효과와 생리적인 특성을 조사하였다.
본 연구는 김치로부터 비만 억제능력이 있는 젖산균을 분리 및 동정하고, 이 균주의 생리적 특성을 규명하여 상업적으로의 이용가능성을 검토하고자 실시하였다. 이를 위해 Modified MRS 분별배지를 사용하여 노란색 집락을 형성하는 균주를 대상으로 각각 α-amylase inhibitory activity, α-glucosidase inhibitory activity와 lipase inhibitory activity가 우수한 균주를 선발한 결과 K6 균주가 최종 선발되었다.

제안 방법

α-Amylase 활성 저해능 측정은 Xiao 등(2006)의 방법을 변형시켜 본 실험에 이용하였다.
3T3-L1 세포배양 방법은 Hemati 등(1997)의 방법을 변형하여 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포는 미국 세포 은행 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA)을 통하여 구입하였다.
3T3-L1 지방전구세포를 분화 유도하기 위하여 세포를 6 well plate의 각 well에 1.25×105 cells/well로 분주하고 2일 후 배지를 교환하여 3~4일째에 세포가 완전히 융합상태가 되게하였다.
1% 첨가한 MRS broth를 만든 다음 18시간 배양한 Lactobacillus plantarum K6 균주 1% 접종한 뒤 5~10번 교대 배양하여, decarboxylase 효소를 활성화시켰다. Bover-Cid and Holzapfel(1999)에 의해 고안된 decarboxylase media에 효소 활성화된 균을 도말하고 37℃에서 24~48시간 배양 후 보라색으로 변함을 통하여 BA 생성균을 판별하였다.
Clark 등(1993)의 방법에 따라 37% HCl을 증류수에 섞어 pH 2, 3, 4 용액과 대조구로서 pH 6.4 용액을 제조하였고, 제조된 pH 용액 10 mL에 0.05% cysteine이 함유된 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 배양된 L. plantarum K6 균주(약 10⁹ CFU/mL)를 1 mL씩 섞은 후 37℃에서 혐기 배양하면서 0, 1, 2, 3시간 후의 생균수를 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 혐기배양한 다음 계수하였다.
Gilliland와 Walker (1990)의 방법에 따라 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 배양된 L. plantarum K6 균주를 0.05% cysteine이 함유된 MRS 액체배지에 0.3% oxgall을 첨가한 배지와 대조구로서 oxgall을 첨가하지 않은 배지에 각각 1% 접종하였다. 37℃의 incubator에서 7시간까지 혐기배양하면서 시간별로 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 혐기배양하여 계수하였다.
/95% air가 공급되는 조건의 항온기(incubator)에서 배양하였다. HT-29 세포를 배양하기 위하여 세포를 12 well plate의 각 well에 10⁶ cells/well로 분주하고, 2일에 한 번씩 배지를 교체해 주며, 실험 전날, 95%까지 세포가 찼을 때 serum free medium으로 교체하여 cell이 더 이상 차는 것을 막아주었다. 균주의 장 내 부착능을 실험하기 위해 2차 계대배양한 균주 1 mL를 취해 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하고 serum free medium을 이용해 두 번 세척하였다.
MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 배양한 L. plantarum K6 균주를 생리식염수로 희석하여 10⁵~10⁶ CFU/mL 수준의 시료를 조제한 후, API ZYM kit (API bioMerieux, Lyon, France)를 이용하여 37℃에서 5시간 배양한 다음 효소반응시켰다. 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0~5의 수치로 표시하였으며, 대조구 이외의 alkaline phosphatase, eterase(C4), esterase lipase(C8), lipase( C14), leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, trypsin, chymotrypsin, acid phosphatase, naphthol- AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, β-fucosidase 효소의 활성을 측정하였다.
Lipase 억제활성은 Lee 등(2007)의 방법에 따라 Porcine pancreatic lipase (sigma, USA)를 이용하여 측정하였다. Porcine pancreatic lipase (sigma, USA)를 이용하여 lipase 활성저해 정도를 측정하였다. 균주 배양액에 0.
각 지역의 김치 40종을 채취한 후, Modified MRS 배지를 사용하여 노란색 집락을 형성하는 167개의 단일 균락을 분리하였다.
1% peptone 용액에 적정농도로 희석하였다. 각 항생제가 각 농도 별로 포함된 tryptic soy 액체배지에 10⁵~10⁶ CFU/mL 수준으로 접종하고 37℃에서 48시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 생장 여부를 결정하였다. 항생제 내성 측정은 2배 희석방법을 사용하였으며, 억제된 가장 낮은 농도를 MIC(Minimal inhibitory concentration) 값으로 결정하였다.
각각 지역과 종류가 다른 김치 40종을 수거하여, 브롬크레졸 퍼플(Bromcresol purple)과 소듐아자이드(sodium azide)를 첨가한 변형 MRS 배지(Lim et al., 2011)에 0.1 mL씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하고 균락을 변형 MRS 배지에서 순수 분리한 다음 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 도말한 후, 호기 배양하여 순수분리하였다.
결과는 α-amylase만을 처리하였을 때와 시료를 혼합하여 처리하였을 때의 흡광도를 비교하여 나타내었다.
Species를 정하기 위하여 API 50 CHL kit (Bio Mereux, France)를 이용하여 49종의 당발효 시험을 실시한 결과 (Table 3), K6 균주는 L-Arabinose 등 23종으로부터 산을 생성하였다. 그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과, Lactobacillus plantarum으로 판명되었으며, 16S rRNA 유전자 부분 을 universal primer를 이용한 PCR로 증폭하여 서열 분석하였다. 분석된 염기서열을 그대로 이용하여 BLAST search한 결과, L.
분화 유도 2일 후, 배지를 시료, 10% FBS, 1% P/S, 5 μg/mL insulin이 포함된 DMEM으로 교환하였고, 분화 유도 4일 째부터는 시료와 함께 2일에 한번씩 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM으로 교환하여 세포를 분화시켜 8일간 지방을 유도한 지방세포에서 실험하였다.
증폭과정은 95℃, 15분을 한 후 95℃, 20초; 50℃, 40초; 72℃, 1분 30초를 30회 시행하였으며, 72℃, 5분으로 마무리 하였다. 서열 분석은 PCR product를 solgent PCR purification kit (SolGent, Korea)로 purify한 후 ABI 3730XL DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)로 자동 분석하였다.
선발된 K6 균주의 genus와 species를 결정하기 위하여 생리적, 생화학적 시험을 하였다. 선발된 K6 균주는 Gram 양성을 나타내었고, 현미경으로 관찰 시 rod 형태의 homo균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하였고, catalase와 운동성은 음성으로 나타났다.
1 mL씩 평면도말법으로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하고 균락을 변형 MRS 배지에서 순수 분리한 다음 노란색으로 변한 균락을 잠정적 젖산균으로 선발하였다. 선발된 균주는 전기 변형 MRS 배지에 도말한 후, 호기 배양하여 순수분리하였다. 순수 분리 후 Lactobacilli MRS broth (Difco, USA) 에서 37℃, 18시간 배양한 다음 tryptic soy agar (Difco, USA) slant에 37℃에서 18시간 배양하여 보관하였다.
균주의 장 내 부착능을 실험하기 위해 2차 계대배양한 균주 1 mL를 취해 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하고 serum free medium을 이용해 두 번 세척하였다. 세척한 균주를 RPMI 배지로 희석하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 0.5값이 나오도록 맞춘 후 0.1% peptone 용액으로 희석한 다음 BCP plate count agar에 pouring 하여 초기 균수를 측정하였다. OD 값을 맞춘 균체 100 mL를 well에 분주한 후 37℃, 5% CO₂에서 2시간 배양한 뒤 PBS를 이용해 붙지 않은 균을 5번 세척해 준다.
세포 내 생성된 지질의 축적량은 세포 내 생성된 지방구와 특이적으로 반응하는 Oil Red O (Sigma, USA)를 사용하여 측정하였다. Oil-Red O 염색 방법은 Ramirez-Zacarias 등(1992)의 방법을 약간 변형하여 사용하였다.
젖산균의 동정은 Hammes 등(1992)의 방법에 의하여 실시하였다. 순수 분리된 균주는 Gram 염색, 포자생성, 호기적 및 혐기적 생장, Catalase 생성, 15℃ 및 45℃에서의 생장, glucose로부터 가스 생성, arginine으로부터 ammonia 생성을 측정하였으며, 현미경 관찰과 API 20 strep kit(API bioMerieux, France)를 이용한 당 발효 실험을 실시하였다. 젖산 균의 DNA sequence 분석에는 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, solgent EF-Taq을 사용하여 PCR을 실시하였다.
아미노산 전구체(L-Tyrosine disodium salt, L-Histidine monohydrochloride monohydrate, L-Ornithine monohydrochloride, L-Lysine monohydrochloride)를 0.1% 첨가한 MRS broth를 만든 다음 18시간 배양한 Lactobacillus plantarum K6 균주 1% 접종한 뒤 5~10번 교대 배양하여, decarboxylase 효소를 활성화시켰다. Bover-Cid and Holzapfel(1999)에 의해 고안된 decarboxylase media에 효소 활성화된 균을 도말하고 37℃에서 24~48시간 배양 후 보라색으로 변함을 통하여 BA 생성균을 판별하였다.
여기에 새로운 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco, USA) 100 μL에 농도 별로 희석한 시료(10, 100, 1,000 μg/mL)를 각각 첨가하여 24시간 배양한 다음 5 mg/mL로 제조한 MTT (Sigma, USA) 용액 20 μL를 각 well에 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다.
5 mg/mL in isopropanol; working solution: 60% oil red O stock solution and 40% distilled water)으로 30분 동안 실온에서 염색하였다. 염색 후, 염색액을 제거하고 증류수를 이용해 3번 세척한 다음 증류수를 well에 채우고 현미경으로 관찰하였다. 중성지방의 정량은 증류수를 제거하고, 완전히 마른 well에 100% iso-propyl alcohol 을 2 mL 첨가하여 Oil-Red O를 다시 용출시킨 후 ELISA reader로 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
융합 상태에서 첫날에는 10% FBS와 MDI solution (0.5 mM 3-iso butyl-1-methylxanthine, 1 uM dexamethsone, 5 μg/mL insulin) (Sigma, USA)을 처리하여 분화를 유도하였고, 이때, 시료가 지방세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 시료를 농도별로 함께 처리하였다.
젖산 균의 DNA sequence 분석에는 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, solgent EF-Taq을 사용하여 PCR을 실시하였다.
젖산 균의 DNA sequence 분석에는 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, solgent EF-Taq을 사용하여 PCR을 실시하였다. 증폭과정은 95℃, 15분을 한 후 95℃, 20초; 50℃, 40초; 72℃, 1분 30초를 30회 시행하였으며, 72℃, 5분으로 마무리 하였다. 서열 분석은 PCR product를 solgent PCR purification kit (SolGent, Korea)로 purify한 후 ABI 3730XL DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)로 자동 분석하였다.
각 항생제가 각 농도 별로 포함된 tryptic soy 액체배지에 10⁵~10⁶ CFU/mL 수준으로 접종하고 37℃에서 48시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 생장 여부를 결정하였다. 항생제 내성 측정은 2배 희석방법을 사용하였으며, 억제된 가장 낮은 농도를 MIC(Minimal inhibitory concentration) 값으로 결정하였다. 항생제는 Sigma (USA)로부터 구매하여 사용하였다.
효소활성은 표준색상표를 비교하여 0~5의 수치로 표시하였으며, 대조구 이외의 alkaline phosphatase, eterase(C4), esterase lipase(C8), lipase( C14), leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, trypsin, chymotrypsin, acid phosphatase, naphthol- AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, β-fucosidase 효소의 활성을 측정하였다.

대상 데이터

3T3-L1 세포배양 방법은 Hemati 등(1997)의 방법을 변형하여 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포는 미국 세포 은행 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA)을 통하여 구입하였다. 실험에 사용한 3T3-L1 지방전구세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)과 1% penicillin-streptomycin (P/S; Gibco, USA)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂/95% air가 공급되는 조건의 항온기(incubator)에서 배양하였다.
Gilliland와 Speck(1977)의 방법에 따라 항균력 측정에 사용한 지시균인 Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus는 한국식품연구원으로부터 분양받았으며, 지시균의 증식배지로서 Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphyloccous aureus는 nutriunt 액체배지에서 호기적으로 37℃, 24시간 배양하였다. 혼합배양 및 대조군에 사용된 배지는 MRS 액체배지 로서 젖산균과 지시균을 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
분리·선정된 K6 균주는 MRS 액체배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다.
3T3-L1 지방전구세포는 미국 세포 은행 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA)을 통하여 구입하였다. 실험에 사용한 3T3-L1 지방전구세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)과 1% penicillin-streptomycin (P/S; Gibco, USA)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂/95% air가 공급되는 조건의 항온기(incubator)에서 배양하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 분화 유도하기 위하여 세포를 6 well plate의 각 well에 1.
실험에 사용한 HT-29 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)을 통하여 구입하였고, Kim 등(2008)의 방법에 따라 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)과 1% penicillin-streptomycin (P/S; Gibco, USA)이 첨가된 RPMI 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂/95% air가 공급되는 조건의 항온기(incubator)에서 배양하였다. HT-29 세포를 배양하기 위하여 세포를 12 well plate의 각 well에 10⁶ cells/well로 분주하고, 2일에 한 번씩 배지를 교체해 주며, 실험 전날, 95%까지 세포가 찼을 때 serum free medium으로 교체하여 cell이 더 이상 차는 것을 막아주었다.
항생제는 Sigma (USA)로부터 구매하여 사용하였다. 항생제는 Amikacin, Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin, Penicillin- G, Oxacillin, Bacitracin, Polymyxin B, Ciprofloxacin, Tetracycline, Clindamycin, Erythromycin, Rifampicin, Vancomycin 및 Chloramphenicol을 시험에 사용하였다.
항생제 내성 측정은 2배 희석방법을 사용하였으며, 억제된 가장 낮은 농도를 MIC(Minimal inhibitory concentration) 값으로 결정하였다. 항생제는 Sigma (USA)로부터 구매하여 사용하였다. 항생제는 Amikacin, Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin, Penicillin- G, Oxacillin, Bacitracin, Polymyxin B, Ciprofloxacin, Tetracycline, Clindamycin, Erythromycin, Rifampicin, Vancomycin 및 Chloramphenicol을 시험에 사용하였다.

데이터처리

결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내고, 통계분석은 Statistical Package for Social Sciences (SPSS, SPSS Inc., USA)로 실시하였다.
유의차는 one-way ANOVA로 통계처리하였고, Duncan’s multiple range tests를 사용하여 유의성 5% 수준에서 검정하였다.

이론/모형

α-Glucosidase 활성억제 효과 측정은 p-NPG (p-nitrophenyl α-Glucopyranoside)을 기질로 사용하는 Si 등(2010)의 방법을 이용하였다.
Lipase 억제활성은 Lee 등(2007)의 방법에 따라 Porcine pancreatic lipase (sigma, USA)를 이용하여 측정하였다. Porcine pancreatic lipase (sigma, USA)를 이용하여 lipase 활성저해 정도를 측정하였다.
시료에 대한 세포 생존율은 Mosmann (1983)의 방법에 따라 MTT {3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte trazolium bromide} assay 방법으로 실험하였다. 세포는 16×10⁴ cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양 후 배지를 제거하였다.
분리·선정된 K6 균주는 MRS 액체배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다. 젖산균의 동정은 Hammes 등(1992)의 방법에 의하여 실시하였다. 순수 분리된 균주는 Gram 염색, 포자생성, 호기적 및 혐기적 생장, Catalase 생성, 15℃ 및 45℃에서의 생장, glucose로부터 가스 생성, arginine으로부터 ammonia 생성을 측정하였으며, 현미경 관찰과 API 20 strep kit(API bioMerieux, France)를 이용한 당 발효 실험을 실시하였다.

성능/효과

K6 균주가 3T3-L1 세포에 세포독성을 나타내는지 측정하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 100 μg/mL 농도 수준 이하에서 세포의 생존력에 영향을 주지 않아 세포독성이 없는 것으로 나타났다(데이터 생략).
K6 균주는 α-amylase 억제활성 96.78±3.29%, α-glucosidase 억제활성 92.55±9.62%, lipase 억제활성 85.17± 0.79%, 지방분화 억제활성 27.4±1.4%로 나타났으며, 동정결과 Lactobacillus plantarum으로 판명되었고, Lactobacillus plantarum K6으로 명명하였다.
, 1984). L. plantarum K6 균주의 담즙 내성 결과는 Fig. 2에서 보는 바와 같이 7시간 동안 배양 후 생균수를 비교해 보았을 때, 0.3% oxgall을 첨가하지 않았을 때의 생균수는 log 9.45 CFU/mL, 0.3% oxgall을 첨가하였을 때의 생균수는 log 8.84 CFU/mL로 약간 억제를 받기는 하였으나, 담즙 내성이 있는 것으로 나타났다.
plantarum K6가 식중독균에 대해 어느 정도 억제하는지를 측정하기 위해 혼합배양을 실시한 결과는 Table 6과 같다. L. plantarum K6은 Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphyloccous aureus에 대해 각각 51.8%, 42.4%, 61.6%, 54.9%로서 Listeria monocytogenes에 대해 가장 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 배양 후 pH의 변화를 보았을 때 대조구인 식중독균은 pH 5.
L. plantarum K6은 답즙산과 산성의 pH에서 모두 우수한 생존력을 나타내었고, 효소활성은 전반적으로 낮았으나 arylamidase와 β-galactosidase에 대해 비교적 높은 효소 활성을 나타내었다.
Leucine arylamidase와 β-galactosidase가 공히 3을 나타내 효소활성이 다른 효소들에 비해 높게 나타났으나, 전반적으로 효소활성이 높지 않은 것으로 나타났다.
45℃와 15℃에서는 생장하지 않았으며, glucose와 arginine으로부터 각각 gas와 암모니아를 생성하지 않아 genus Lactobacillus에 속하였다 (Table 2). Species를 정하기 위하여 API 50 CHL kit (Bio Mereux, France)를 이용하여 49종의 당발효 시험을 실시한 결과 (Table 3), K6 균주는 L-Arabinose 등 23종으로부터 산을 생성하였다. 그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과, Lactobacillus plantarum으로 판명되었으며, 16S rRNA 유전자 부분 을 universal primer를 이용한 PCR로 증폭하여 서열 분석하였다.
그 결과, vancomycin에 대한 항생제 내성의 MIC 농도가 2,048 μg/mL로서 가장 내성이 높았고, ampicillin, polymyxin B 순이었다.
3에서 보는 바와 같다. 대조구인 pH 6.4에서의 균수와 비교한 결과, L. plantarum K6 균주는 pH 3과 pH 4에서 생존율 감소를 보이지 않았을 뿐만 아니라 pH 2에서 0시간에는 생존율이 100%이던 것이 3시간 이후에도 100%로 변함이 없었다. Pennacchia 등(2004)의 실험에서 젖산균을 pH 2.
, 2001). 따라서 L. plantarum K6 균주는 상피세포 표면에 부착능이 우수한 것으로 나타났다.
9%의 억제 효과를 지니고 있는 것으로 나타났다. 또한, 아민을 생성하지 않으며, 장부착성은 대조구인 L. rhamnosus GG보다 우수하였다.
반면, erythromycin에 대한 MIC 농도는 0.125 μg/mL로서 가장 감수성이 높았고, clindamycin, rifampicin 등도 감수성이 높은 것으로 나타났다.
Daeschel(1989)과 Havinaar 등 (1992)은 pH 강하, 산화 환원 전위의 감소, 유해균과의 경쟁적 영양 성분 소비, 과산화수소의 생성, 젖산균이 생산하는 유기산과 박테리오신의 살균 작용과 강한 항균 활성 물질 분비에 의해 젖산균의 항균 효과가 나타낸다고 보고하였다. 본 실험에서 L. plantarum K6에 의한 Escherichia coli 와 Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Staphyloccous aureus의 생육 억제는 이러한 억제 요소들의 작용에 기안하는 것으로 사료된다.
분리된 젖산균을 대상으로 α-amylase 억제활성, α-glucosidase 억제활성, lipase 억제활성을 측정한 결과 K6 균주가 각각 96.78±3.29%, 92.55±9.62%, 85.17±0.79%로서 가장 높은 억제 활성을 나타내었다(Table 1).
그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과, Lactobacillus plantarum으로 판명되었으며, 16S rRNA 유전자 부분 을 universal primer를 이용한 PCR로 증폭하여 서열 분석하였다. 분석된 염기서열을 그대로 이용하여 BLAST search한 결과, L. plantarum (I.D. 99%)으로 동정되었고, Lactobacillus plantarum K6으로 명명하였다.
따라서 분화 과정에서 3T3-L1 세포 에 100 μg/mL 농도로 K6 균주를 첨가하였다. 분화가 끝난 후, 세포 내에 생성된 지방구를 Oil-Red O 염색액으로 염색하여 현미경으로 관찰한 결과, 분화배지만 처리한 군에 비해서 균주를 처리한 군의 염색된 지방구 수가 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 용출하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 결과 각각 대조군 대비 22.
선발된 K6 균주의 genus와 species를 결정하기 위하여 생리적, 생화학적 시험을 하였다. 선발된 K6 균주는 Gram 양성을 나타내었고, 현미경으로 관찰 시 rod 형태의 homo균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하였고, catalase와 운동성은 음성으로 나타났다. 45℃와 15℃에서는 생장하지 않았으며, glucose와 arginine으로부터 각각 gas와 암모니아를 생성하지 않아 genus Lactobacillus에 속하였다 (Table 2).
유당을 glucose와 galactose로 분해시키는 유당분해효소인 β-galactosidase는 3을 나타내어 유당 불내증 해소에 약간 도움이 될 것이라고 보여진다.
분화가 끝난 후, 세포 내에 생성된 지방구를 Oil-Red O 염색액으로 염색하여 현미경으로 관찰한 결과, 분화배지만 처리한 군에 비해서 균주를 처리한 군의 염색된 지방구 수가 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 용출하여 520 nm에서 흡광도를 측정한 결과 각각 대조군 대비 22.3%의 지방 분화 억제율을 보였다(Fig. 1).
이를 위해 Modified MRS 분별배지를 사용하여 노란색 집락을 형성하는 균주를 대상으로 각각 α-amylase inhibitory activity, α-glucosidase inhibitory activity와 lipase inhibitory activity가 우수한 균주를 선발한 결과 K6 균주가 최종 선발되었다.
plantarum K6은 답즙산과 산성의 pH에서 모두 우수한 생존력을 나타내었고, 효소활성은 전반적으로 낮았으나 arylamidase와 β-galactosidase에 대해 비교적 높은 효소 활성을 나타내었다. 항생제 내성 실험 결과 vancomycin, ampicillin, polymyxin B에 내성이 있는 반면 erythromycin에 감수성을 나타냈으며, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes와 Staphyloccous aureus에 대 해 각각 51.8%, 42.4%, 61.6%와 54.9%의 억제 효과를 지니고 있는 것으로 나타났다. 또한, 아민을 생성하지 않으며, 장부착성은 대조구인 L.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Probiotics는 어떤 장점이 있는가?	Probiotics는 숙주동물의 건강에 매우 유익한 효과를 주는 살아있는 유익한 미생물로, 고혈압 조절, 혈중 콜레스테롤 저하, 과민성 대장증후군 같은 위장관 질환의 개선 효과, 암 예방, 면역체계 조절, 지질대사 개선 등의 연구 결과가 보고되고 있다(Bhathena et al., 2009; Lye et al.
	우리나라는 비만을 개선하기 위해 어떤 방법이 효과가 있을까?	실제로 이 효소는 탄수화물 소화를 지연하고 탄수화물 소화 시간을 연장케 한다(Chiasson, 2006; Chen et al., 2006) 특히, 우리나라 식습관은 탄수화물 위주의 식사를 하므로 비만을 개선하기 위해 기존의 지방흡수 억제뿐만 아니라 탄수화물 흡수억제를 동시에 하는 방법이 효과가 있을 것으로 보인다(Kim et al., 2003).
	L. plantarum K6은 무엇이 우수하여 선발된 균주인가?	본 연구는 김치로부터 비만 억제능력이 있는 젖산균을 분리 및 동정하고, 이 균주의 생리적 특성을 규명하여 상업적으로의 이용가능성을 검토하고자 실시하였다. 이를 위해 Modified MRS 분별배지를 사용하여 노란색 집락을 형성하는 균주를 대상으로 각각 α-amylase inhibitory activity, α-glucosidase inhibitory activity와 lipase inhibitory activity가 우수한 균주를 선발한 결과 K6 균주가 최종 선발되었다. K6 균주는 α-amylase 억제활성 96.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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