Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 세균을 분리하기 위하여 부여군 석성면 지역의 양송이 재배농장으로부터 수확후배지를 수집하였다. 양송이 수확후배지로부터 12종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase 활성이 가장 우수한 균주 NO12를 최종 선발하였다. 분리균 NO12의 생리적 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 조사하였으며 분리균 NO12는 Bacillus subtilis와 유사한 특징을 나타내었다. 분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열도 B. subtilis와 99.2%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 NO12는 B. subtilis NO12로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 세균을 분리하기 위하여 부여군 석성면 지역의 양송이 재배농장으로부터 수확후배지를 수집하였다. 양송이 수확후배지로부터 12종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase 활성이 가장 우수한 균주 NO12를 최종 선발하였다. 분리균 NO12의 생리적 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 조사하였으며 분리균 NO12는 Bacillus subtilis와 유사한 특징을 나타내었다. 분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열도 B. subtilis와 99.2%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 NO12는 B. subtilis NO12로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
Twelve strains of bacteria with cellulase and xylanase activities were isolated from spent mushroom substrates collected from button mushroom cultivation farm, Buye, Chungcheongnam-do in Korea. Among them, one strain, designated NO12, with higher cellulase and xylanase activities was selected by aga...
Twelve strains of bacteria with cellulase and xylanase activities were isolated from spent mushroom substrates collected from button mushroom cultivation farm, Buye, Chungcheongnam-do in Korea. Among them, one strain, designated NO12, with higher cellulase and xylanase activities was selected by agar diffusion method. The strain NO12 was identified to be a Bacillus sp. by biochemical characteristics using Bacillus ID kit and MicroLog system. Comparative 16S rDNA gene sequence analysis showed that strain NO12 formed a distinct phylogenetic tree within the genus Bacillus and was most closely related to Bacillus subtilis with 16S rDNA gene sequence similarity of 99.2%. Based on its physiological properties, biochemical characteristics, and phylogenetic distinctiveness, strain NO12 was classified within the genus Bacillus, for which the name Bacillus subtilis NO12 was proposed. The cellulase and xylanase activities of B. subtilis NO12 were slightly increased according to bacterial population from exponential phase to stationary phase in the growth curve for B. subtilis NO12. The xylanase activity continuously increased from the beginning of the exponential phase and exhibited maximum activity in the middle of the exponential phase.
Twelve strains of bacteria with cellulase and xylanase activities were isolated from spent mushroom substrates collected from button mushroom cultivation farm, Buye, Chungcheongnam-do in Korea. Among them, one strain, designated NO12, with higher cellulase and xylanase activities was selected by agar diffusion method. The strain NO12 was identified to be a Bacillus sp. by biochemical characteristics using Bacillus ID kit and MicroLog system. Comparative 16S rDNA gene sequence analysis showed that strain NO12 formed a distinct phylogenetic tree within the genus Bacillus and was most closely related to Bacillus subtilis with 16S rDNA gene sequence similarity of 99.2%. Based on its physiological properties, biochemical characteristics, and phylogenetic distinctiveness, strain NO12 was classified within the genus Bacillus, for which the name Bacillus subtilis NO12 was proposed. The cellulase and xylanase activities of B. subtilis NO12 were slightly increased according to bacterial population from exponential phase to stationary phase in the growth curve for B. subtilis NO12. The xylanase activity continuously increased from the beginning of the exponential phase and exhibited maximum activity in the middle of the exponential phase.
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문제 정의
본 연구에서는 양송이 수확후배지의 퇴비화 공정에 필요한 균주를 개발할 목적으로 부여군 양송이 재배농가에서 수집한 수확후배지에서 cellulase와 xylanase를 분비하는 균주를 분리하고 분리균의 특성을 조사하였다.
제안 방법
분리균의 생육이 효소 생성에 미치는 영향은 분리균의 생육곡선과 cellulase 및 xylanase 활성의 상관관계를 비교하여 확인하였다. 0.5% CMC 또는 xylan이 기질로 첨가된 TSB 배지에 분리균을 각각 접종한 다음 48시간 동안 진탕배양하면서 3시간 간격으로 배양액을 채취하였다. 분리균의 생육곡선은 채취한 배양액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였으며 cellulase와 xylanase 활성은 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다(Miller et al, 1960).
0) 250 ul를 혼합하여 100oC에서 10분 동안 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도를 측정하여 unit로 나타내었다. Xylanase 활성은 CMC 대신에 xylan 을 기질로 사용하여 CMCase와 동일한 방법으로 측정하 였다. 1 unit는 효소 활성을 나타내는 단위로써 CMC 또는 xylan으로부터 1분 동안 1 umol의 glucose 또는 Dxylose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 나타내었고 glucose와 D-xylose가 cellulase와 xylanase 활성 측정을 위한 표준시료로 사용되었다(Fig.
2%의 상동성을 나타 내었으며 분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열은 GeneBank database에 MG396985로 등록되었다. 분리균 NO12와 Bacillus 속 균주의 계통학적 유연관계는 분리균 NO12와 GeneBank database에 등록된 Bacillus 속 균주 들의 16S rDNA 염기서열을 비교분석한 다음 DNAMan analysis system (Lynnon Biosoft, Canada)을 이용하여 계통도로 나타내었다(Fig. 2). Bacillus 속은 다양한 환경에서 포자를 생성하여 생존할 수 있기 때문에 환경에 따라종 다양성이 큰 세균으로 16S rDNA 염기서열에서 100% 의 상동성을 나타내더라도 서로 다른 종으로 분류될 수 있는 균주이지만(Seki et al, 1978) 분리균 NO12는 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용한 생리적·생화학적 특성 분석과 16S rDNA 염기서열 분석에서 B.
분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열은 중합효소연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 얻은 산물중 1.5 kb에 해당하는 단편을 PCR purification kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제한 다음 Macrogen (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열은 B.
양송이 수확후배지로부터 12종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase 활성이 가장 우수한 균주 NO12를 최종 선발하였다. 분리균 NO12의 생리적·생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 조사하였으며 분리균 NO12는 Bacillus subtilis와 유사한 특징을 나타내었다.
Louis, MO, USA)이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 확인하였다. 분리균의 cellulase 분비능이 우수한 균주는 분리균을 0.5% CMC와 1% trypan blue가 첨가된 TSA 배지에 접종한 다음 40oC에서 48시간 동안 배양한 후 코로니 주변에 형성된 cellulose 분해환의 크기를 측정하여 선발하였으며 xylanase 분비능이 우수한 균주는 0.5% xylan이 기질로 첨가된 TSA 배지에 분리균을 접종한 다음 40oC에서 48 시간 동안 배양한 후 iodine으로 염색하여 코로니 주변에 형성된 xylan 분해환의 크기를 측정하여 선발하였다. 분리균 중 cellulose 또는 xylan이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 분해환의 크기가 가장 큰 균주 NO12가 cellulase와 xylanase 분비능이 가장 우수한 균주로 최종 선발하였다.
양송이 수확후배지에 우점하는 균주는 수집한 배지 1g을 멸균수에 희석한 후 trypticase soy agar (TSA) 배지에 도말한 다음 40 oC에서 48시간 동안 배양하여 분리하였으며 12개의 균주가 분리되었다. 분리균의 cellulase와 xylanase 활성은 carboxy methyl cellulose (CMC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 xylan (Xylan from oat spelts, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 확인하였다. 분리균의 cellulase 분비능이 우수한 균주는 분리균을 0.
분리균의 생육이 효소 생성에 미치는 영향은 분리균의 생육곡선과 cellulase 및 xylanase 활성의 상관관계를 비교하여 확인하였다. 0.
대상 데이터
Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 세균을 분리하기 위하여 부여군 석성면 지역의 양송이 재배농장으로부터수확후배지를 수집하였다. 양송이 수확후배지로부터 12종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase 활성이 가장 우수한 균주 NO12를 최종 선발하였다.
수확후배지에 우점하는 균주 중 CMCase와 xylanase 활성이 우수한 균주를 분리하기 위하여 충남 부여군 석성면 지역의 양송이 재배농가에서 수확후배지를 수집하였다. 양송이 수확후배지에 우점하는 균주는 수집한 배지 1g을 멸균수에 희석한 후 trypticase soy agar (TSA) 배지에 도말한 다음 40 oC에서 48시간 동안 배양하여 분리하였으며 12개의 균주가 분리되었다.
Cellulase와 xylanase 분비능이 우수한 세균을 분리하기 위하여 부여군 석성면 지역의 양송이 재배농장으로부터수확후배지를 수집하였다. 양송이 수확후배지로부터 12종의 균주를 분리하였으며 이 중 cellulase와 xylanase 활성이 가장 우수한 균주 NO12를 최종 선발하였다. 분리균 NO12의 생리적·생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 조사하였으며 분리균 NO12는 Bacillus subtilis와 유사한 특징을 나타내었다.
이론/모형
Phylogenetic relationships of the isolate NO12 and other closely related bacteria based on the partial 16S rDNA gene sequence. The branching pattern was generated by the neighbor-joining method. Bootstrap values(expressed as percentages of 10,000 replications) are shown at major branching points.
5% CMC 또는 xylan이 기질로 첨가된 TSB 배지에 분리균을 각각 접종한 다음 48시간 동안 진탕배양하면서 3시간 간격으로 배양액을 채취하였다. 분리균의 생육곡선은 채취한 배양액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였으며 cellulase와 xylanase 활성은 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다(Miller et al, 1960). Cellulase 활성은 3시간 간격으로 채취한 분리균 배양액을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액만 회수한 다음 상등액 250 ul와 0.
성능/효과
Bacillus ID kit와 MicroLog system에 의한 분리균 NO12의 생화학적인 특성을 종합하면 Table 1과 같이 arbutin, cellobiose, dextrin, D-fructose, D-galactose, gentiobiose, D-glucose, maltose, mannan, D-manitol, 3-methylglucose, D-psicose, D-raffinose, D-sorbitol, sucrose, D-trehalose, α-hydroxybutyric acid, ρ-hydroxyphenyl acetic acid, Llactic acid, pyruvic acid 등에 대해 양성반응을 보였다.
3). Cellulase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 초반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수 증식기 중반부터 지속적으로 증가하여 정지기 초반에 최대활성을 나타내었다. 이 결과는 Bacillus 속이 분비하는 탄수화물 분해효소의 활성이 세포의 생장과 더불어 지속 적으로 증가하고 정지기에 도달하면 최대활성을 나타낸다는 이전의 보고와 일치하는 것이었다(Kim et al, 1995; Kim et al, 2004; Shin and Cho, 2011).
subtilis NO12로 동정되었다. 분리 균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열도 B. subtilis와 99.2%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 NO12는 B.
5 kb에 해당하는 단편을 PCR purification kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제한 다음 Macrogen (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열은 B. subtilis와 99.2%의 상동성을 나타 내었으며 분리균 NO12의 16S rDNA 염기서열은 GeneBank database에 MG396985로 등록되었다. 분리균 NO12와 Bacillus 속 균주의 계통학적 유연관계는 분리균 NO12와 GeneBank database에 등록된 Bacillus 속 균주 들의 16S rDNA 염기서열을 비교분석한 다음 DNAMan analysis system (Lynnon Biosoft, Canada)을 이용하여 계통도로 나타내었다(Fig.
분리균 NO12의 생리적·생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 계통학적 유연관계를 종합하여 분리균 NO12는 Bacillus subtilis NO12로 명명되었다.
분리균 NO12의 형태적 특징은 분리균을 TSA 배지에서 48시간 동안 배양한 후 현미경으로 관찰하였으며 그 결과 분리균 NO12는 Gram양성 간균이었다. 분리균 NO12의 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 분석하였으며 Bacillus ID kit로 분석한 결과 분리균은 B. subtilis와 99.2%의 probability을 나타내었으며 MicroLog system에 의한 분석결과에서도 B. subtilis와 유사한 생화학적 특성을 나타내었다. Bacillus ID kit와 MicroLog system에 의한 분리균 NO12의 생화학적인 특성을 종합하면 Table 1과 같이 arbutin, cellobiose, dextrin, D-fructose, D-galactose, gentiobiose, D-glucose, maltose, mannan, D-manitol, 3-methylglucose, D-psicose, D-raffinose, D-sorbitol, sucrose, D-trehalose, α-hydroxybutyric acid, ρ-hydroxyphenyl acetic acid, Llactic acid, pyruvic acid 등에 대해 양성반응을 보였다.
분리균 NO12의 형태적 특징은 분리균을 TSA 배지에서 48시간 동안 배양한 후 현미경으로 관찰하였으며 그 결과 분리균 NO12는 Gram양성 간균이었다. 분리균 NO12의 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 분석하였으며 Bacillus ID kit로 분석한 결과 분리균은 B.
5% xylan이 기질로 첨가된 TSA 배지에 분리균을 접종한 다음 40oC에서 48 시간 동안 배양한 후 iodine으로 염색하여 코로니 주변에 형성된 xylan 분해환의 크기를 측정하여 선발하였다. 분리균 중 cellulose 또는 xylan이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 분해환의 크기가 가장 큰 균주 NO12가 cellulase와 xylanase 분비능이 가장 우수한 균주로 최종 선발하였다.
2%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 NO12는 B. subtilis NO12로 동정되었다. 분리 균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
버섯수확후배지란 무엇인가?
최근 우리나라는 소득증대와 웰빙(well-being)문화의 정착으로 건강에 대한 관심이 증가하면서 버섯 소비도 지속적인 증가추세를 보이고 있으며 버섯 소비가 증가함에 따라 버섯 수확 후 남겨진 부산물인 버섯수확후배지의 발생 량도 증가하고 있다. 버섯수확후배지는 버섯의 종류와 재배 방식에 따라 다양하지만 대부분 톱밥과 곡물이 주원료 이며 버섯 재배과정 중 배지 영양분의 15-25% 정도만 버섯에 의해 이용되고 나머지는 버섯수확후배지에 남아 있을 뿐만 아니라 버섯 균사체가 분비하는 다양한 생리활성 물질과 버섯 균사체 등이 잔존해 있기 때문에 활용가치가 높은 부산물이다 (Shin and Cho, 2011). 현재 큰느타리, 느타리, 팽이 등의 병재배용 버섯수확후배지는 유기농 퇴비, 가축사료용 첨가제, 버섯재배용 배지, 바이오매스 고형원료, 곤충 사육용 배지, 환경복원용 복토 등으로 활용 되고 있다.
현재 큰느타리, 느타리, 팽이 등의 병재배용 버섯수확후배지는 어떻게 활용되고 있는가?
버섯수확후배지는 버섯의 종류와 재배 방식에 따라 다양하지만 대부분 톱밥과 곡물이 주원료 이며 버섯 재배과정 중 배지 영양분의 15-25% 정도만 버섯에 의해 이용되고 나머지는 버섯수확후배지에 남아 있을 뿐만 아니라 버섯 균사체가 분비하는 다양한 생리활성 물질과 버섯 균사체 등이 잔존해 있기 때문에 활용가치가 높은 부산물이다 (Shin and Cho, 2011). 현재 큰느타리, 느타리, 팽이 등의 병재배용 버섯수확후배지는 유기농 퇴비, 가축사료용 첨가제, 버섯재배용 배지, 바이오매스 고형원료, 곤충 사육용 배지, 환경복원용 복토 등으로 활용 되고 있다. 그러나 양송이 수확후배지는 유기물 함량이 낮고 버섯 배지 위에 복토를 깔아서 버섯을 배양하기 때문에 활용가치가 낮아 대부분 재배사 근처에 방치되고 있어서 환경오염이 우려되고 있다.
B. subtilis NO12의 cellulase와 xylanase 활성은 어떻게 나타나는가?
subtilis NO12로 동정되었다. 분리균이 분비하는 cellulase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
참고문헌 (9)
Jung YP, Kyung KC, Jang KY, Yoon MH. 2011. Isolation and characterization of plant growth promoting rhizobacteria from waste mushroom bed from Agaricus bisporus. Kor J Soil Sci Fert. 44:866-871
Kim DJ, Shin HJ, Min BH, Yoon KH. 1995. Isolation of a Thermophilic Bacillus sp. producing the thermostable cellulase-free xylanase, and properties of the enzyme. Kor J Appl Microb Biotech. 23: 304-310.
Kim JY, Heo SH, Hong JH. 2004. Isolation and characterization of an alkaline cellulase produced by alkalophilic Bacillus sp. HSH-810. Kor J Appl Microb Biotech. 40:139-146.
Lee JH, Choi SH. 2006. Xylanase production by Bacillus sp. A-6 isolated from rice bran. J Microbiol Biotechnol. 16:1856-1861.
Williams BC, McMullan JT, McCahey S. 2001. An initial assessment of spent mushroom compost as apotential energy feedstock. Bioresour Technol. 79:227-230.
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