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문제 정의
- 현재까지 황백나무 추출물과 약리성분 berberine, palmatine에 대한 생리활성 연구는 다양하게 보고되어왔으며, 특히 염증 억제 활성에 관련된 보고가 다양하게 이루어진 바 있으나, 황백 추출물과 분획물에 대한 주름 억제 효과 연구는 미비한 상태이다. 따라서 본 연구는 황백나무에 이미 알려진 염증 억제 활성과 더불어 새로운 기능성 소재로 활용하기 위한 연구의 일환으로 황백을 이용하였다. 황백을 80% methanol 추출한 뒤, ethyl acetate 용매 분획하여 염증 억제 활성을 나타내는 것으로 알려진 지표 물질 berberine 및 palmatine과 그 활성을 비교하였고 TLC를 통하여 황백 추출물과 분획물에서 지표 물질의 존재를 확인하였다.
제안 방법
- 이 추출물 분말을 증류수로 현탁시켜 용매별 극성 차이를 이용하여 용매 분획을 실시하였다. Ethyl acetate을 1 : 1 (v/v)의 비율로 혼합한 후 상하층으로 분리된 층 가운데 상층을 분리해 낸 다음 하층을 다시 분획하는 동일한 과정을 10회 이상 수행하였다. 분획하여 얻어낸 상층은 rotatory vacuum evaporator로 감압농축한 후 동결 건조하여 분말로 제조하였다.
- TLC 분석에 대조군으로 사용하기 위해 berberine과 palmatine은 methanol에 녹여 각각 1,000 ppm의 농도로 5 ㎖씩 제조하였고 활성 실험을 위해 각각 methanol에 녹여 250 µM의 농도로 2 ㎖씩 제조하였으며, 이를 1/2 씩 희석하여 농도별 시료를 제조해 본 실험에 사용하였다.
- 황백을 80% methanol 추출한 뒤, ethyl acetate 용매 분획하여 염증 억제 활성을 나타내는 것으로 알려진 지표 물질 berberine 및 palmatine과 그 활성을 비교하였고 TLC를 통하여 황백 추출물과 분획물에서 지표 물질의 존재를 확인하였다. 또한 주름 억제 관련 생리활성을 확인하기 위해 elastase 저해 활성을 분석하였으며 이러한 활성과 berberine, palmatine의 상관관계를 분석하였다.
- 마우스 대식세포인 RAW264.7에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 황백 추출물 및 분획물과 지표 물질 berberine, palmatine을 각각 농도별 (0 - 25 ㎍/㎖, 0 - 250 µM)로 처리한 후, WST assay를 수행하였다.
- 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하고 24시간 뒤에 일정 농도의 시료를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 multi-plate reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 NO 생성 억제율은 1 mM nitrite standard solution을 기준으로 하여 백분율로 표현하였다.
- 분말화된 추출물은 무게를 측정하여 이를 %로 나타내어 추출물의 수율로 표시하였다. 이 추출물 분말을 증류수로 현탁시켜 용매별 극성 차이를 이용하여 용매 분획을 실시하였다. Ethyl acetate을 1 : 1 (v/v)의 비율로 혼합한 후 상하층으로 분리된 층 가운데 상층을 분리해 낸 다음 하층을 다시 분획하는 동일한 과정을 10회 이상 수행하였다.
- 분획하여 얻어낸 상층은 rotatory vacuum evaporator로 감압농축한 후 동결 건조하여 분말로 제조하였다. 이를 각각 용매 methanol에 녹여 80% methanol 추출물과 ethyl acetate 분획물 시료를 제조하였으며 일정 농도로 희석하여 TLC 분석 및 세포독성, 항염증, 주름 억제 효과 측정을 위해 사용하였다.
- 5 ㎎/㎖ N-succinyl-(LAla)3-p-nitroanilide를 녹인 기질액 1 ㎖를 첨가하여 22℃에서 5분간 반응 후 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 410 ㎚에서 측정하였다. 이를 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율 (%)로 표시하여 elastase 활성 저해율로 나타내었으며, 대조군으로는 oleanolic acid를 사용하여 황백 추출물 및 분획물과 비교하였다. Elastase 활성 1 unit은 분당 1 µ㏖의 p-nitroanilide을 생성하는 elastase의 효소의 양으로 하였으며 저해 활성은 다음의 식으로부터 계산하였다.
- 이와 같은 결과로 황백 추출물 및 분획물은 최대 25 ㎍/㎖, 지표물질 berberine 및 palmatine은 최대 250 µM의 농도까지 모든 활성 효과 실험을 진행하였다.
- , 1981). 일정 농도로 희석한 각 시료 0.5 ㎖에 50 mM의 Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 2.5 U/㎖ porcine pancrease elastase 0.5 ㎖와 50 mM의 Tris-HCl buffer에 0.5 ㎎/㎖ N-succinyl-(LAla)3-p-nitroanilide를 녹인 기질액 1 ㎖를 첨가하여 22℃에서 5분간 반응 후 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 410 ㎚에서 측정하였다. 이를 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율 (%)로 표시하여 elastase 활성 저해율로 나타내었으며, 대조군으로는 oleanolic acid를 사용하여 황백 추출물 및 분획물과 비교하였다.
- 추출 및 분획 과정에 용매 methanol, ethyl acetate(Daejung Chemicals and Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)를 사용하였고 heating mantle (MS-IM609, Misung Scientific Co., Ltd., Yangju, Korea), rotatory vacuum evaporator (400series, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하였으며, 동결 건조기 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)로 동결건조하였다. 분석을 위해 silica gel TLC plate (20 × 20 ㎝ silica gel 60 F254, Aluminium plate, Merck, Darmstadt, Germany)와 UV lamp (Vilber Lourmat, Marne-la-valee, France)를 사용하였고 세포 배양을 위해 FBS, penicillinstreptomycin, DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며, 세포실험은 lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich Co.
- Silica gel TLC plate는 형광물질이 도포되어 있어 UV 조사 시 강한 형광을 내는 제품을 사용하였다. 통상 적정 농도의 시료는 0.5 ㎕ (per spot)의 양으로 실험하였으며, 전개용매는 표준생약 품목별 해설서 (Lee, 2012)를 참고하여 nbutanol, water, acetate acid (7 : 2 : 1 v/v/v)의 조건으로 실온에서 상승법으로 전개하여 건조한 후, TLC 상에 전개된 spot의 존재 및 위치 확인에는 UV lamp로 365 ㎚의 파장에서 확인하였다. 이때 확인한 spot은 Rf 값을 계산하였다.
- 황백 추출물 및 분획물과 지표 물질 berberine, palmatine이 각각 마우스 대식세포주인 RAW264.7에서 LPS 처리에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 검토하기 위해 황백 추출물 및 분획물과 지표 물질 berberine, palmatine을 각각 농도별 (0 -25 ㎍/㎖, 0 - 250 µM)로 처리한 후, NO assay를 수행하였다.
- 따라서 본 연구는 황백나무에 이미 알려진 염증 억제 활성과 더불어 새로운 기능성 소재로 활용하기 위한 연구의 일환으로 황백을 이용하였다. 황백을 80% methanol 추출한 뒤, ethyl acetate 용매 분획하여 염증 억제 활성을 나타내는 것으로 알려진 지표 물질 berberine 및 palmatine과 그 활성을 비교하였고 TLC를 통하여 황백 추출물과 분획물에서 지표 물질의 존재를 확인하였다. 또한 주름 억제 관련 생리활성을 확인하기 위해 elastase 저해 활성을 분석하였으며 이러한 활성과 berberine, palmatine의 상관관계를 분석하였다.
대상 데이터
- Silica gel TLC plate는 형광물질이 도포되어 있어 UV 조사 시 강한 형광을 내는 제품을 사용하였다. 통상 적정 농도의 시료는 0.
- 본 실험에서 사용한 황백 (Phellodendron amurense Ruprecht)은 강원도 영월군에서 채집된 국내산 황백을 2015년 5월경에 제천한방약초에서 구매하였다. 구매한 황백은 DNA를 추출하여 ITS (internal transcribed spacer) 영역에 대해 PCR 후, 마크로젠을 통한 염기서열 분석을 하였고 NCBI (National Center for Biotechnology Information, 미국국립생물정보센터)에서 확인하였으며, 표품은 음지에서 상온 보관하며 본 실험의 재료로 사용하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW264.7은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% penicillinstreptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 황백 (Phellodendron amurense Ruprecht)은 강원도 영월군에서 채집된 국내산 황백을 2015년 5월경에 제천한방약초에서 구매하였다. 구매한 황백은 DNA를 추출하여 ITS (internal transcribed spacer) 영역에 대해 PCR 후, 마크로젠을 통한 염기서열 분석을 하였고 NCBI (National Center for Biotechnology Information, 미국국립생물정보센터)에서 확인하였으며, 표품은 음지에서 상온 보관하며 본 실험의 재료로 사용하였다.
- 분석을 위해 silica gel TLC plate (20 × 20 ㎝ silica gel 60 F254, Aluminium plate, Merck, Darmstadt, Germany)와 UV lamp (Vilber Lourmat, Marne-la-valee, France)를 사용하였고 세포 배양을 위해 FBS, penicillinstreptomycin, DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였으며, 세포실험은 lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), ez-cytox (Biomax Co., Ltd., Seoul, Korea), nitric oxide detection kit (iNtRON Biotechnology, Inc., Sungnam, Korea)을 사용하였다.
- , Sungnam, Korea)을 사용하였다. 활성 실험을 위해 pancreaticelastase, oleanolic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 multi-plate reader (Paradigm, Houston, TX, USA)를 사용하였으며, berberine chloride hydrate, palmatine chloride hydrate은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 지표물질로 사용하였다. TLC 분석에 대조군으로 사용하기 위해 berberine과 palmatine은 methanol에 녹여 각각 1,000 ppm의 농도로 5 ㎖씩 제조하였고 활성 실험을 위해 각각 methanol에 녹여 250 µM의 농도로 2 ㎖씩 제조하였으며, 이를 1/2 씩 희석하여 농도별 시료를 제조해 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (means ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS (Statistical Pakage for Social Science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Elastase 저해 활성은 Cannell 등 (1988)의 방법에 따라 측정하였다. Elastase (EC 3.
- Nitrite oxide (NO)의 농도는 Green 등 (1982)의 방법을 이용한 nitric oxide detection kit를 이용하여 측정하였다. RAW 264.
- 세포생존율은 water-soluble tetrazolium salt (WST-1) 방법을 사용하여 측정하였다 (Ranke et al., 2004). RAW264.
성능/효과
- Berberine 처리 시료의 경우 7.81 - 250 µM 농도 범위에서 NO의 생성 저해 효과가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 137.22 µM 처리 시 NO 생성을 약 50% 저해하는 것으로 나타났다 (Fig. 3C).
- Palmatine 처리 시료의 경우 250 µM 처리 시 NO 생성을 약 44.53% 저해하는 것으로 분석되어 NO 생성 억제는 berberine이 더 우수한 것으로 나타났다 (Fig. 3D).
- 3에 나타내었다. RAW264.7 세포주에 LPS 단독 처리는 NO의 생성 억제율이 낮은 것을 확인 할 수 있었으며, LPS에 의해 증가한 NO가 황백 추출물 및 분획물과 지표 물질 시료 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 추출물 처리 시료의 경우 0.
- 4C, D). 그러나, 이와 같은 결과는 황백 추출물과 분획물의 우수한 elastase 저해 효과에 비해 매우 낮은 효과로 황백의 주요 약리 성분인 berberine과 palmatine이 이 효능에 대한 주요한 원인이 아닐 것으로 판단되며, 두 지표 물질 이외에 추가적으로 elastase 저해 효능을 갖는 유효 물질이 있을 것으로 사료된다. 또한, 이 유효 물질은 ethyl acetate 분획 과정을 통해 분획되어지는 물질로 황백 ethyl acetate 분획물이 methanol 추출물보다 우수한 elatase 저해 효능을 나타내는데 기여하였을 것으로 여겨지며, 이는 황백이 주름 개선 기능성 소재로 긍정적인 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 대조 시료인 지표 물질 berberine과 palmatine은 형광 노란색–청록색을 띠는 spot으로 각각의 Rf 값은 0.61, 0.57으로 나타났으며, 이는 황백 추출물 및 분획물에서 관찰된 각 2개의 spot과 색상이 일치하고 Rf 값이 유사한 것으로 확인되었다.
- 이러한 지표 물질 berberine과 palmatine의 염증 억제 효과는 Küpeli 등 (2002)에서 보고된 바 있다. 따라서 황백 추출물과 분획물을 처리했을 시 NO 생성 억제 효과가 뛰어나며, 이는 황백이 berberine과 palmatine을 주요 약리 성분으로 함유하고 있으므로 NO 생성 억제에 유효한 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 또한, 황백 분획물이 추출물보다 NO 생성 억제 효과가 뛰어난 것은 berberine이나 palmatine과 같은 유효 물질이 용매 ethyl acetate을 이용한 분획 과정을 통해 분획물에 더욱 높은 함량으로 포함되어 있기 때문으로 사료되며, 이러한 연구보고와 본 실험의 결과를 바탕으로 황백의 항염증 기능성 소재 개발의 가능성을 확인 할 수 있었다.
- 그러나, 이와 같은 결과는 황백 추출물과 분획물의 우수한 elastase 저해 효과에 비해 매우 낮은 효과로 황백의 주요 약리 성분인 berberine과 palmatine이 이 효능에 대한 주요한 원인이 아닐 것으로 판단되며, 두 지표 물질 이외에 추가적으로 elastase 저해 효능을 갖는 유효 물질이 있을 것으로 사료된다. 또한, 이 유효 물질은 ethyl acetate 분획 과정을 통해 분획되어지는 물질로 황백 ethyl acetate 분획물이 methanol 추출물보다 우수한 elatase 저해 효능을 나타내는데 기여하였을 것으로 여겨지며, 이는 황백이 주름 개선 기능성 소재로 긍정적인 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 따라서 황백 추출물과 분획물을 처리했을 시 NO 생성 억제 효과가 뛰어나며, 이는 황백이 berberine과 palmatine을 주요 약리 성분으로 함유하고 있으므로 NO 생성 억제에 유효한 효과를 나타낸 것으로 판단된다. 또한, 황백 분획물이 추출물보다 NO 생성 억제 효과가 뛰어난 것은 berberine이나 palmatine과 같은 유효 물질이 용매 ethyl acetate을 이용한 분획 과정을 통해 분획물에 더욱 높은 함량으로 포함되어 있기 때문으로 사료되며, 이러한 연구보고와 본 실험의 결과를 바탕으로 황백의 항염증 기능성 소재 개발의 가능성을 확인 할 수 있었다.
- 3A). 분획물 처리 시료의 경우 0.78 - 25 ㎍/㎖의 농도 범위에서 NO의 생성 저해 효과가 농도가 증가함에 따라 상승하는 것을 확인할 수 있었으며, 1.04 ㎍/㎖ 처리 시 NO 생성을 약 50% 저해하는 것으로 나타났다 (Fig 3B). 이는 분획물의 NO 생성저해 효과가 추출물보다 약 17배 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
- 7%로 나타났다. 이 중 ethyl acetate로 분획하여 얻은 분획물의 동결 건조 분말 중량은 46.0 g으로 9.2%의 수율을 나타내었다(Table. 1).
- 04 ㎍/㎖ 처리 시 NO 생성을 약 50% 저해하는 것으로 나타났다 (Fig 3B). 이는 분획물의 NO 생성저해 효과가 추출물보다 약 17배 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. Berberine 처리 시료의 경우 7.
- 57으로 나타났으며, 이는 황백 추출물 및 분획물에서 관찰된 각 2개의 spot과 색상이 일치하고 Rf 값이 유사한 것으로 확인되었다. 이를 통해 황백 추출물 및 분획물에서 지표 물질 berberine과 palmatine이 모두 함유되어 있음을 확인하였으며, 두 지표 물질은 용매 methanol과 ethyl acetate에 의해 용출 가능한 물질임이 확인되었다 (Table. 2).
- 지표 물질 berberine과 palmatine은 각 7.81 - 250 µM의 농도 범위에서 elastase 저해 활성 실험을 진행하였으나, berberine의 경우 250 µM의 농도에서 14.61%의 저해 효과로 매우 낮은 효과를 보였으며, palmatine의 경우 250 µM의 농도에서 44.53%의 elastase 저해 효과를 나타내어 berberine보다는 비교적 높은 효과임이 확인되었다 (Fig. 4C, D).
- 지표 물질 berberine을 처리한 경우 125 µM의 농도까지 세포 독성이 없었고 250 µM의 농도에서 91.64%의 세포 생존율을 보임으로써 세포생존율의 소폭의 감소가 관찰되었다.
- 7 세포주에 LPS 단독 처리는 NO의 생성 억제율이 낮은 것을 확인 할 수 있었으며, LPS에 의해 증가한 NO가 황백 추출물 및 분획물과 지표 물질 시료 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 추출물 처리 시료의 경우 0.78 - 50 ㎍/㎖의 농도 범위에서 NO의 생성 저해 효과가 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 17.88 ㎍/㎖ 처리 시 NO 생성을 약 50% 저해하는 것으로 나타났다 (Fig. 3A). 분획물 처리 시료의 경우 0.
- 추출물과 분획물 모두 형광 노란색–청록색의 spot이 관찰되었고, 추출물의 경우 2개 spot의 Rf 값은 각 0.61과 0.57이었으며, 분획물의 경우 형광 노란색–청록색을 띠는 2 개 spot의 Rf 값은 각 0.61과 0.56으로 확인되었다.
- 4B). 특히, 대조군 oleanolic acid를 9.93 ㎍/㎖ 처리했을 때 약 50% 저해하는 효과보다 분획물의 저해 효과가 약 9배 높은 것으로 확인되었다 (Fig. 4E). 지표 물질 berberine과 palmatine은 각 7.
- , 2014). 황백 ethyl acetate 분획물의 경우 0.78 -25 ㎍/㎖의 농도 범위에서 elastase 저해 활성이 증가하는 것이 확인되었고 1.06 ㎍/㎖ 처리 시 약 50% 저해하는 것으로 나타났으며, 이는 추출물보다 약 16배 우수한 저해 효과로 확인되었다 (Fig. 4B). 특히, 대조군 oleanolic acid를 9.
- 4와 Table 3과 같다. 황백 methanol 추출물의 경우 0.78 - 25 ㎍/㎖의 농도 범위에서 elastase 저해 활성이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 17.09 ㎍/㎖ 처리 시 약 50% 저해하는 것으로 나타났다 (Fig. 4A). 노화 억제 관련 생리활성 물질을 탐색한 연구에서도 황백 methanol 추출물의 elastase 저해 효과가 보고된 바 있으며 (Yu et al.
- 7에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 황백 추출물 및 분획물과 지표 물질 berberine, palmatine을 각각 농도별 (0 - 25 ㎍/㎖, 0 - 250 µM)로 처리한 후, WST assay를 수행하였다. 황백 추출물을 처리한 경우 25 ㎍/㎖의 농도에서 103.25%의 세포 생존율을 보임으로써 세포독성이 없는 것으로 확인되었고 (Fig. 2A), 분획물을 처리한 경우 25 ㎍/㎖의 농도에서 100.11%의 세포 생존율을 보였다 (Fig. 2B). 지표 물질 berberine을 처리한 경우 125 µM의 농도까지 세포 독성이 없었고 250 µM의 농도에서 91.
- 황백을 80% methanol을 이용하여 가열 추출한 결과, 황백 500 g 기준 동결 건조 분말 중량은 83.6 g이었고 수율 16.7%로 나타났다. 이 중 ethyl acetate로 분획하여 얻은 분획물의 동결 건조 분말 중량은 46.
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