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문제 정의
- 본 연구는 양어 사료 내 감귤착즙박의 합성 비타민 C와 항생제 대체제로써 이용 가능성을 조사하기 위해 저수온기의 넙치 치어를 대상으로 성장률, 사료효율, 비특이적 면역력 및 아가미와 장의 조직학적 분석을 실시하였다.
제안 방법
- 각 수조당 8마리의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(200 mg/L)으로 마취시킨 후, 일회용 주사기를 사용하여 미부정맥에서 혈액을 채혈하였다. 8 마리 중 4 마리 어류의 혈액은 헤파린을 처리하여 hematocrit, hemoglobin 및 대식세포(nitroblue tetrazolium, NBT)를 측정하였다. 분석 후, 남은 혈액은 immunoglobulin (Ig) 분석을 위해 5,000 g로 10분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하였다.
- Hematocrit은 원심분리기(Micro hematocrit VS-12000, Korea)에서 10분간 원심분리하여 측정하였고, hemoglobin 분석은 생화학분석기(SLIM, SEAC Inc, Florence, Italy)를 이용하여 분석하였다. Hematocrit과 hemoglobin은 일반적으로 어류 사육실험에 있어서 건강지표를 측정하는 분석항목으로서 사료 섭취에 따른 어류의 건강상태를 간접적으로 확인하기 위해 측정하였다.
- Hematocrit은 원심분리기(Micro hematocrit VS-12000, Korea)에서 10분간 원심분리하여 측정하였고, hemoglobin 분석은 생화학분석기(SLIM, SEAC Inc, Florence, Italy)를 이용하여 분석하였다. Hematocrit과 hemoglobin은 일반적으로 어류 사육실험에 있어서 건강지표를 측정하는 분석항목으로서 사료 섭취에 따른 어류의 건강상태를 간접적으로 확인하기 위해 측정하였다.
- 각 수조당 8마리의 어류를 무작위로 선별하여 2-phenoxyethanol 용액(200 mg/L)으로 마취시킨 후, 일회용 주사기를 사용하여 미부정맥에서 혈액을 채혈하였다. 8 마리 중 4 마리 어류의 혈액은 헤파린을 처리하여 hematocrit, hemoglobin 및 대식세포(nitroblue tetrazolium, NBT)를 측정하였다.
- 실험사료의 조성은 Table 1에 나타내었다. 단백질원으로 탈지어분(extracted fish meal)과 casein을 사용하였고 지질원으로 오징어간유를 사용하였으며, 조단백질과 조지방이 각각 48%, 13%가 되도록 조성하였다. 비타민 C를 첨가하지 않은 대조사료와 합성 비타민 C인 LAPP (L-ascorbyl-2-polyphosphate)와 CBP를 각각 30 ppm (저농도), 300 ppm (고농도)으로 첨가한 실험사료구, OTC를 0.
- 단백질원으로 탈지어분(extracted fish meal)과 casein을 사용하였고 지질원으로 오징어간유를 사용하였으며, 조단백질과 조지방이 각각 48%, 13%가 되도록 조성하였다. 비타민 C를 첨가하지 않은 대조사료와 합성 비타민 C인 LAPP (L-ascorbyl-2-polyphosphate)와 CBP를 각각 30 ppm (저농도), 300 ppm (고농도)으로 첨가한 실험사료구, OTC를 0.5% 첨가한 실험사료구로 총 6개의 실험사료를 제작하였다(Con, LAPP30, LAPP300, CBP30, CBP300 and OTC). 실험사료의 제조는 분쇄기를 이용하여 모든 사료원을 일정하게 분쇄한 후, 각 사료원을 사료조성표에 따라 혼합하였다.
- 소화기관의 조직학적 관찰은 전장부의 점막주름에 나타나는 배상세포(Goblet cell)의 수를 측정하였다. 먼저 마취가 된 어류의 장을 적출한 후, bouin’s solution을 이용하여 고정하였고, 70% ethanol로 탈수시킨 후, 파라핀으로 봉입시켜 5 µm로 절편하여 슬라이드에 부착시켰다.
- 저수온기 실험기간 동안 사육수온은 자연 수온(13-15°C)에 의존하였다. 실험사료 공급은 1일 2회(08:00, 17:00)에 나누어서 9주 동안 매일 만복공급을 실시하였다.
- 5% 첨가한 실험사료구로 총 6개의 실험사료를 제작하였다(Con, LAPP30, LAPP300, CBP30, CBP300 and OTC). 실험사료의 제조는 분쇄기를 이용하여 모든 사료원을 일정하게 분쇄한 후, 각 사료원을 사료조성표에 따라 혼합하였다. 혼합 후 사료원 총량의 약 30%에 해당하는 증류수를 첨가하여 사료혼합기(NVM-14-2P, Gyeonggido, Korea)로 혼합, 반죽하였다.
- 실험종료 후 성장률, 사료전환효율, 일간성장률, 단백질전환 효율 및 생존율을 계산하였다: 성장률(WG, %)=100×(final mean body weight–initial mean body weight)/initial mean body weight; 사료전환효율(FCR)=dry feed fed/wet weight gain; 일간성장률(SGR, %)=[(loge final body weight–loge initial body weight)/days]×100; 단백질전환효율(PER)=wet weight gain/total protein given.
- 혼합반죽물은 소형 펠렛제조기(SMC-12, Korea)를 이용하여 직경 3 mm 크기로 펠렛 성형하였다. 제작된 펠렛 실험사료는 동결건조기에서 건조시켜 적당한 크기로 가공한 후 사료공급실험에 사용하였다.
- 먼저 마취가 된 어류의 장을 적출한 후, bouin’s solution을 이용하여 고정하였고, 70% ethanol로 탈수시킨 후, 파라핀으로 봉입시켜 5 µm로 절편하여 슬라이드에 부착시켰다. 조직이 부착된 슬라이드는 일반적인 조직학적 관찰을 위해 harris hematoxylin과 0.5% eosin으로 염색하였고, 배상세포를 관찰하기 위하여 pH 2.5인 alcian blue (AB)와 periodic acid-Schiff (PAS)로 염색한 후 광학현미경(Olympus CKX41, Tokyo, Japan)으로 표본을 관찰하였다. 장의 직경(intestinal diameter), 융모 길이(villus length), enterocyte height의 형태학적 분석을 위해 Image J 1.
- 조직형태학적 분석을 위해 각 수조당 실험어류 3 마리를 무작 위로 선별하여 2-phenoxyethanol (200 mg/L) 용액으로 마취 시킨 후, 각 어류의 전장, 체중, 간중량 및 장 중량을 측정하여 다음의 항목을 계산하였다: Hepatosomatic index=100×(liver weight/body weight); Relative intestine length=100×(intestine length/total length); Viscerasomatic index=100×(viscera weight/body weight); Condition factor=100×fish weight (g)/ fish length3(cm).
대상 데이터
- 넙치 치어( 초기평균무게: 44.6±0.32 g)는 총 18개의 150 L 원형 폴리프로필렌 수조에 각 수조당 30마리씩 무작위로 배치하였다.
- 실험어(넙치 치어)는 제주도에 위치한 종묘배양장에서 구입하여 제주대학교 소속 해양과학연구소로 이송하였다. 이송된 치어는 약 3주 동안 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에 적응할 수 있도록 순치시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 데이터 값의 유의차는 Tukey's HSD (P<0.05)로 비교하였다.
- 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었다.
- 데이터는 평균값±표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 백분율데이터는 arcsine 변형 값으로 통계분석 하였다.
- 실험사료의 배치는 완전확률계획법(Completely randomized design)을 실시하였고, 결과는 SPSS (Version 12.0) 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA로 통계 분석되었다. 데이터 값의 유의차는 Tukey's HSD (P<0.
이론/모형
- 혈장 내 Ig 분석은 Siwicki and Anderson (1993)의 분석방법으로, 혈청 내 MPO 활성은 Quade and Roth (1997)의 방법으로 분석하였다. NBT는 Anderson and Siwicki (1995)의 방법을 기초로 분석하였다.
- (1957)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치를 이용하여 분석하였다. 실험사료의 비타민 C 분석은 Lee and Dabrowski (2004)의 방법으로 분석하였다.
- 실험사료의 일반성분 분석은 AOAC (1995) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(125°C, 3시간), 조회분은 직접회화법 (550°C, 6시간), 단백질은 자동조단백질 분석기로 분석하였으며, 조지방은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 Soxhlet 추출장치를 이용하여 분석하였다.
- (1980)의 방법으로, SOD 활성은 Superoxide dismutase kit (Cayman, Ann Arbor, USA)를 이용하여 분석하였다. 혈장 내 Ig 분석은 Siwicki and Anderson (1993)의 분석방법으로, 혈청 내 MPO 활성은 Quade and Roth (1997)의 방법으로 분석하였다. NBT는 Anderson and Siwicki (1995)의 방법을 기초로 분석하였다.
- 혈청 내 lysozyme activity는 Hultmark et al. (1980)의 방법으로, SOD 활성은 Superoxide dismutase kit (Cayman, Ann Arbor, USA)를 이용하여 분석하였다. 혈장 내 Ig 분석은 Siwicki and Anderson (1993)의 분석방법으로, 혈청 내 MPO 활성은 Quade and Roth (1997)의 방법으로 분석하였다.
성능/효과
- 일간성장률은 CBP30, CBP300 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 높았으며, LAPP와 OTC실험구를 비교할 경우 OTC 실험구가 높은 경향을 보였다. CBP30 실험구가 나머지 모든 실험구와 비교하여 유의적으로 높은 단백질전환효율을 보였다. 일일섭이량은 유의적인 차이가 없었으며 0.
- 특히, 비타민 C와 같은 수용성 영양소의 경우 융모의 상피세포로부터 가장 먼저 흡수 된다(Wilson, 2005). Enterocyte 길이를 측정한 결과, 대조구가 CBP30실험구에 비해 유의 적으로 낮은 결과를 보였는데, 이는 비타민 C의 결핍에 의한 결과라 사료된다.
- 결론적으로, 사료 내 감귤착즙박의 첨가는 성장률, 사료효율, 생존율, 비특이적 면역력과 조직학적 변화에서 아무런 문제가 없을 것으로 사료된다. 감귤착즙박의 다량 사용에 대한 추가적인 연구가 필요하지만 비타민 C와 항생제 대체제로써 사료 내 약 1% 내외의 소량 사용에는 전혀 문제가 없을 것으로 판단된다.
- , 2013)에서는 감귤착즙박과 발효감귤착즙박을 사료에 각각 4%, 8% 농도로 첨가하여 9주간 공급한 후 lysozyme 활성을 측정하였다. 그 결과, 비타민 C 요구량을 충족시킨 대조구에 비해 발효감귤착즙박을 4% 첨가한 실험구가 유의적으로 높은 lysozyme 활성을 보였으며, 일반 감귤착즙박을 첨가한 실험구에서는 유의적인 차이는 없었지만 대조구에 비해 높은 경향을 보였다. 본 연구에서는 lysozyme 활성 결과, CBP30이 LAPP300보다 유의적으로 높았으며, 대조구와 비교하여 높은 경향을 보였다.
- , 2005). 배상세포의 수 변화를 관찰한 결과, 대조구가 다른 첨가 실험구에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보였다. 특히, LAPP 실험구와 CBP30실험구에서 높은 수의 배상세포 수를 보였는데 이는 비타민 C 첨가가 점액분비를 유도하여 병원균으로부터 장내를 보호하는데 관여한 것으로 사료된다.
- 그 결과, 비타민 C 요구량을 충족시킨 대조구에 비해 발효감귤착즙박을 4% 첨가한 실험구가 유의적으로 높은 lysozyme 활성을 보였으며, 일반 감귤착즙박을 첨가한 실험구에서는 유의적인 차이는 없었지만 대조구에 비해 높은 경향을 보였다. 본 연구에서는 lysozyme 활성 결과, CBP30이 LAPP300보다 유의적으로 높았으며, 대조구와 비교하여 높은 경향을 보였다. 유자와 탱자의 과피추출물에 대한 쥐의 면역활성 효과를 비교한 실험에서는 비장세포 자극을 통한 T 세포와 B세포의 증진이 촉진되었다(Park et al.
- Lim and Lovell (1978)은 채널메기를 대상으로 12주간 비타민 C 결핍 실험을 실시한 결과, 비타민 C가 결핍된 사료를 섭취한 어류의 아가미에서 새엽의 변형과 연골세포의 괴사로 인한 지지 연골의 변형이 관찰되었다고 보고하였다. 본 연구에서도 비타민C가 결핍된 대조사료를 급이한 넙치의 아가미에서 비정상적인 조직변화가 관찰되었고, LAPP와 CBP가 첨가된 실험사료를 급이한 넙치에서는 아가미조직의 변형이 발견되지 않음으로써 CBP 내에 다량 존재하는 비타민 C의 효능이 충분히 입증 되었다고 생각된다.
- , 2010; El-Bakary and ElGammal, 2010), enterocyte 길이와 수에 따라 그 흡수 능력이 결정된다고 알려져 있다(Brandão, 1998). 본 연구에서의 장 직경 측정 결과, 모든 실험구에서 유의적인 차이는 없었다. 하지만, LAPP300과 CBP30을 첨가한 실험구가 OTC첨가 실험구보다 유의적으로 높은 융모 길이를 보였다.
- 하지만, 본 연구 결과로는 알 수 없는 CBP 내 생리활성 물질 효과의 메커니즘에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 사료전환효율에서는 CBP 실험구가 LAPP실험구에 비해 높은 효율을 보였다. 이는 합성 비타민 C인 LAPP 첨가에 비해 CBP에 다량 포함되어 있는 천연 비타민 C의 첨가가 어류의 성장과 사료효율에 더 유리할 것이라는 가설을 증명한 결과라 사료된다.
- 성장률은 CBP30 실험구가 대조구, LAPP를 첨가한 실험구와 비교하여 유의적으로 높았다. 사료전환효율은 CBP30 실험구가 LAPP300 실험구와 비교하여 유의적으로 낮았다. 일간성장률은 CBP30, CBP300 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 높았으며, LAPP와 OTC실험구를 비교할 경우 OTC 실험구가 높은 경향을 보였다.
- 9 주간의 사양실험 결과(최종무게, 성장률, 사료전환효율, 일간성장률, 단백질전환효율, 생존율)는 Table 2에 나타내었다. 성장률은 CBP30 실험구가 대조구, LAPP를 첨가한 실험구와 비교하여 유의적으로 높았다. 사료전환효율은 CBP30 실험구가 LAPP300 실험구와 비교하여 유의적으로 낮았다.
- 사료전환효율에서는 CBP 실험구가 LAPP실험구에 비해 높은 효율을 보였다. 이는 합성 비타민 C인 LAPP 첨가에 비해 CBP에 다량 포함되어 있는 천연 비타민 C의 첨가가 어류의 성장과 사료효율에 더 유리할 것이라는 가설을 증명한 결과라 사료된다.
- 사료전환효율은 CBP30 실험구가 LAPP300 실험구와 비교하여 유의적으로 낮았다. 일간성장률은 CBP30, CBP300 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 높았으며, LAPP와 OTC실험구를 비교할 경우 OTC 실험구가 높은 경향을 보였다. CBP30 실험구가 나머지 모든 실험구와 비교하여 유의적으로 높은 단백질전환효율을 보였다.
- 장 직경에서는 LAPP, CBP, OTC를 첨가한 실험구가 대조구에 비해 높은 값을 나타내었지만 유의적인 차이는 없었다. 장 내 융모길이는 LAPP300, CBP30 실험구가 CBP300, OTC실험구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 보였다. Enterocyte height에서는 CBP30 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 높은 값을 보였다.
- 저수온기에서의 사양실험 결과, 사료 내 LAPP, CBP, OTC의 첨가는 넙치 치어의 성장률, 사료전환효율, 단백질전환효율에 유의적으로 영향을 끼쳤다.
- 그 외 혈액분석과 비특이적 면역 분석 결과에서는 유의적인 차이가 없었다. 조직학적 변화를 관찰하기 위한 간중량지수, 장중량지수 및 비만도에서(Table 4) 모든 실험구간에 유의적인 차이가 없었다.
- 배상세포의 수 변화를 관찰한 결과, 대조구가 다른 첨가 실험구에 비해 유의적으로 낮은 수치를 보였다. 특히, LAPP 실험구와 CBP30실험구에서 높은 수의 배상세포 수를 보였는데 이는 비타민 C 첨가가 점액분비를 유도하여 병원균으로부터 장내를 보호하는데 관여한 것으로 사료된다. 참돔을 대상으로 한 8주간의 사양실험에서는 장 상피조직상의 배상세포의 수 변화에서 유의적인 차이는 없었지만 감귤착즙박이나 발효감귤착즙박이 첨가된 실험구에서 경향적으로 많은 배상세포 수가 관찰되었다고 보고되었다(Lee et al.
- Enterocyte height에서는 CBP30 실험구가 대조구에 비해 유의적으로 높은 값을 보였다. 특히, 장 내 배상세포(Fig. 2)의 수는 CBP300을 제외한 LAPP, CBP, OTC를 첨가한 실험구가 대조구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 보였다.
- 본 연구에서의 장 직경 측정 결과, 모든 실험구에서 유의적인 차이는 없었다. 하지만, LAPP300과 CBP30을 첨가한 실험구가 OTC첨가 실험구보다 유의적으로 높은 융모 길이를 보였다. 이는 OTC 보다 LAPP와 CBP가 어류의 소화 흡수에서 더 용이하다고 해석할 수 있겠다.
- (2013)은 저수온 환경에서는 전체적인 사료섭취량이 감소하여 감귤착즙박의 첨가 효능이 참돔의 성장률에 영향을 미치지 못하였다고 보고하였다. 하지만, 본 연구에서는 CBP30 사료를 섭취한 넙치에서 대조구나 LAPP30, LAPP300 사료를 섭취한 넙치에 비해 유의적으로 높은 성장률과 단백질전환효율을 보였다. 비록 낮은 성장률이지만 CBP30 실험구에서 유의적으로 높은 성장률을 보인 이유는 CBP 내에 다량 존재하는 생리활성 polyphenol계 화합물 때문인 것으로 사료된다.
- 혈액분석과 비특이적 면역분석 결과(Table 3), lysozyme 활성에서 CBP30을 첨가한 실험구가 LAPP300 실험구와 비교하여 유의적으로 높은 값을 보였다. 그 외 혈액분석과 비특이적 면역 분석 결과에서는 유의적인 차이가 없었다.
후속연구
- 결론적으로, 사료 내 감귤착즙박의 첨가는 성장률, 사료효율, 생존율, 비특이적 면역력과 조직학적 변화에서 아무런 문제가 없을 것으로 사료된다. 감귤착즙박의 다량 사용에 대한 추가적인 연구가 필요하지만 비타민 C와 항생제 대체제로써 사료 내 약 1% 내외의 소량 사용에는 전혀 문제가 없을 것으로 판단된다. 감귤착즙박은 친환경 양식사료 소재가 될 수 있으며, 특히 질병 발생이 빈번한 저수온기에서 넙치 사료 내 적정 첨가사용은 합성 비타민 C를 대체할 수 있을 뿐만 아니라 항생제 사용을 줄이고 넙치의 선천성 면역력을 높일 수 있을 것으로 사료된다.
- , 2015). 따라서 사료 내 CBP의 첨가는 넙치에서의 배상세포 수를 증가시켜 면역력 증진을 기대 할 수 있고, 합성 비타민 C를 완전 대체하거나 부분 대체할 수 있을 것으로 사료된다. 항생제와 CBP를 비교했을 때도 CBP가 넙치 치어의 성장과 사료효율 및 비특이적 면역에서 비교적 높은 결과를 보임으로서 양어 사료 내 항생제의 사용을 줄이거나 완전 대체하는데 CBP가 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- (2015)은 참돔을 대상으로 한 실험에서 LAPP 혹은 CBP가 첨가된 실험구가 대조구보다 유의적으로 높은 성장률을 보였다고 보고하였다. 하지만, 본 연구 결과로는 알 수 없는 CBP 내 생리활성 물질 효과의 메커니즘에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 사료전환효율에서는 CBP 실험구가 LAPP실험구에 비해 높은 효율을 보였다.
- 따라서 사료 내 CBP의 첨가는 넙치에서의 배상세포 수를 증가시켜 면역력 증진을 기대 할 수 있고, 합성 비타민 C를 완전 대체하거나 부분 대체할 수 있을 것으로 사료된다. 항생제와 CBP를 비교했을 때도 CBP가 넙치 치어의 성장과 사료효율 및 비특이적 면역에서 비교적 높은 결과를 보임으로서 양어 사료 내 항생제의 사용을 줄이거나 완전 대체하는데 CBP가 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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