사람 치은섬유모세포에서 잎꼬시래기 에탄올 추출물의 항염증 및 항산화 효과 Anti-Inflammatory and Antioxidative Effects of Gracilaria textorii Ethanol Extract in LPS-PG-Stimulated Human Gingival Fibroblast-1 Cells원문보기
Purpose : Human gingival fibroblast cell is one of the the main cell types in periodontal tissue, which they can show anti-inflammatory activity through the production of numerous lines of inflammatory mediators such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 and interleukins....
Purpose : Human gingival fibroblast cell is one of the the main cell types in periodontal tissue, which they can show anti-inflammatory activity through the production of numerous lines of inflammatory mediators such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 and interleukins. Porphyromonas gingivalis, one of the oral pathogens, has reported to play a critical role in the development of periodontal diseases. This study aimed to investigate anti-inflammatory and antioxidative activities of Gracilaria textorii ethanol extract (GTEE) in P. gingivalis derived lipopolysaccharide (LPS-PG) stimulated human gingival fibroblast (HGF)-1 cell line. Methods : In order to analyze anti-inflammatory and antioxidative activities of GTEE in HGF-1 cell line, NOS enzyme activity, expression levels of iNOS, COX-2, NAD(P)H quinone dehydrogenase (NQO)1 and their transcription factors were estimated by Griess reaction and western hybridization. Results : LPS-PG induced overexpression of iNOS and COX-2, which was significantly attenuated by GTEE treatment in a dose-dependent manner without any cytotoxicity. In addition, intracellular NOS activity was in accordance with the result of iNOS expression. Due to important role in the regulation of inflammatory responses, phosphorylated status of p65 and c-jun, each subunit of nuclear factor (NF)-κB and activator protein (AP)-1, was also dose-dependently ameliorated by GTEE treatment. One of phase II enzymes, NQO1, and its transcription factor, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), were analyzed since elevated phase II enzyme expression inhibited inflammatory response, which was significantly elevated by GTEE treatment in HGF-1 cell line. Conclusion : In conclusion, GTEE mitigated LPS-PG-stimulated inflammatory responses by attenuating NF-κB and AP-1 activation as well as accelerating NQO1 and Nrf2 expression in HGF-1 cell line. These results indicate that GTEE might be utilized a promising strategy for potential anti-inflammatory agent in periodontal diseases.
Purpose : Human gingival fibroblast cell is one of the the main cell types in periodontal tissue, which they can show anti-inflammatory activity through the production of numerous lines of inflammatory mediators such as inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 and interleukins. Porphyromonas gingivalis, one of the oral pathogens, has reported to play a critical role in the development of periodontal diseases. This study aimed to investigate anti-inflammatory and antioxidative activities of Gracilaria textorii ethanol extract (GTEE) in P. gingivalis derived lipopolysaccharide (LPS-PG) stimulated human gingival fibroblast (HGF)-1 cell line. Methods : In order to analyze anti-inflammatory and antioxidative activities of GTEE in HGF-1 cell line, NOS enzyme activity, expression levels of iNOS, COX-2, NAD(P)H quinone dehydrogenase (NQO)1 and their transcription factors were estimated by Griess reaction and western hybridization. Results : LPS-PG induced overexpression of iNOS and COX-2, which was significantly attenuated by GTEE treatment in a dose-dependent manner without any cytotoxicity. In addition, intracellular NOS activity was in accordance with the result of iNOS expression. Due to important role in the regulation of inflammatory responses, phosphorylated status of p65 and c-jun, each subunit of nuclear factor (NF)-κB and activator protein (AP)-1, was also dose-dependently ameliorated by GTEE treatment. One of phase II enzymes, NQO1, and its transcription factor, nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), were analyzed since elevated phase II enzyme expression inhibited inflammatory response, which was significantly elevated by GTEE treatment in HGF-1 cell line. Conclusion : In conclusion, GTEE mitigated LPS-PG-stimulated inflammatory responses by attenuating NF-κB and AP-1 activation as well as accelerating NQO1 and Nrf2 expression in HGF-1 cell line. These results indicate that GTEE might be utilized a promising strategy for potential anti-inflammatory agent in periodontal diseases.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
그러므로 HGF-1 세포에서 LPS-PG에 의해 유발된 염증을 억제할 수 있는 물질은 치주염을 조절할 수 있는 활성을 가진 것으로 생각할 수 있다. 본 연구에서는 LPS-PG로 유도된 HGF-1 세포의 염증에서 GTEE의 항염증 효과를 분석하고자 하였다. GTEE는 HGF-1 세포에서 500 μg/ml의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다.
본 연구에서는 치주조직의 구성세포 중 하나인 사람 치은섬유모세포에서 잎꼬시래기의 항염증 활성과 항산화 활성을 검증하여 천연 생리 활성소재로의 다양한 활용을 위한 기초자료로 삼고자 한다.
제안 방법
1차 항체인 iNOS, COX-2, phospho-p65, NQO1과 2차 항체인 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)와 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체와의 보합반응이 끝난 PVDF membrane은 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 hybridization반응을 하였고 그 후 enhanced chemiluminescence 시약(Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 ECL film (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 감광시켜 단백질의 발현 변화를 측정하였고 Gel Doc EQ system (Bio-Rad)으로 정량하였다.
GTEE가 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증억제에 효과를 보이는 지의 여부를 확인하기 위하여 iNOS와 COX-2의 발현을 western blot으로 분석하였다. 그 결과 Fig 2에서 보는 바와 같이 LPS-PG에 의해 발현량이 증가된 iNOS와 COX-2는 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 GTEE를 처리함에 따라 농도 의존적으로 이들의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
GTEE의 처리가 HGF-1 세포의 생존에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 50, 100, 250, 500 μg/ml 농도의 GTEE를 2시간 동안 처리한 후 LPS-PG(1 μg/ml)를 24시간 동안 처리하였다.
HGF-1 세포의 생존율은 24 well plate에 5×104 cell/well의 농도로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 배양조건에서 24시간 배양 후 50, 100, 250, 500 μg/ml 농도로 GTEE를 처리하고 2시간 후 LPS-PG를 1 μg/ml의 농도로 처리한 후 22시간 배양하였다.
발현이 유도된 2상 효소(phase II enzyme)를 통해 염증조절이 가능한 보고를 토대로 본 실험에서도 2상 효소 중 하나인 NQO1의 발현을 분석하였다(Yang 등, 2015). Fig 5에서 보는 것처럼 GTEE의 처리에 의하여 NQO1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었고 또한 2상 효소의 전사인자인 Nrf-2의 활성 또한 농도 의존적으로 유도되는 것을 확인하였다.
배양 후 EZ-Cytox cell viability assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 사용하여 well당 EZ-Cytox 시약 10 μL를 첨가한 후 1시간 배양하고 microplate reader (Benchmark Plus, Bio-Rad)를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다.
치주조직에 존재하는 주요한 세포의 한 형태인 치은섬유모세포는 LPS로부터 유래하는 염증성 자극에 반응하여 여러 염증매개물질을 분비한다. 본 연구에서는 치주염을 유발하는 원인균 중 하나인 P. gingivalis로부터 분리한 LPS를 이용하여 사람 치은섬유모세포인 HGF-1세포에 염증을 유도한 후 GTEE의 항염증기능과 항산화 기능을 분석하였다. 그 결과 LPS-PG에 의해 과발현된 iNOS와 COX-2는 GTEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 발현이 억제되었고, 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 인산화 또한 동일한 경향으로 발현이 억제되었다.
부착된 세포에 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 GTEE를 처리하고 2시간 배양 후 LPS-PG를 1 μg/ml의 농도로 처리하고 10시간 동안 배양하였다.
세포 추출액 100 μl와 Griess시약 100 μl를 동량 혼합하여 37 °C에서 10분 반응한 후 multiplate reader (Bio-Rad)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, NaNO2로 표준곡선 작성 후 NO의 농도를 계산하였다
염증 매개물질의 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 활성을 분석하기 위하여 p65와 c-jun의 인산화 정도를 western blot으로 분석하였다.
대상 데이터
그리고 1:100∼1,000의 비율로 희석한 1차 항체와 섞은 후 4 ℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 1차 항체인 iNOS, COX-2, phospho-p65, NQO1과 2차 항체인 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)와 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체와의 보합반응이 끝난 PVDF membrane은 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 hybridization반응을 하였고 그 후 enhanced chemiluminescence 시약(Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 ECL film (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 감광시켜 단백질의 발현 변화를 측정하였고 Gel Doc EQ system (Bio-Rad)으로 정량하였다.
textorii ethanol extract; GTEE)은 제주 생물종다양성연구소(Jeju, Korea)에서 분양받아 연구에 활용하였다. P. gingivalis로부터 분리된 LPS (LPS-PG)는 Invivogen (San Diego, CA, USA)에서, bovine serum albumin, skim milk는 Bio-Rad (Hercules, CA, USA)에서, dimethyl sulfoxide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.
잎꼬시래기 에탄올 추출물(G. textorii ethanol extract; GTEE)은 제주 생물종다양성연구소(Jeju, Korea)에서 분양받아 연구에 활용하였다. P.
데이터처리
3회 반복 시행한 모든 실험 결과는 SPSS 통계 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차(mean ±SD)로 나타내었다.
Values sharing the same superscript are not significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
실험군 간의 유의성 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였고, Duncan's multiple range test 방법으로 사후 검증을 시행하였다.
이론/모형
NOS 효소 활성분석은 4 μM FAD, 4 μM tetrahydrobiopterin, 3 mM DTT, 2 mM L-arginine과 NADPH가 포함된 20 mM Tris–HCl (pH 7.9)에 20 μg의 단백질을 넣고 3시간 동안 37 °C에서 가온한 한 후 Griess reaction을 이용하여 다음과 같이 비색법으로 분석하였다(Vodovotz 등, 1993).
PRO-PREP은 13,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 분리된 상층을 새 튜브로 옮긴 후 단백질 농도는 Bradford법으로 정량하였다.
1ml의 lysis buffer에 세 번의 냉동과 해동을 번갈아가며 세포를 용해하였다. 단백질의 농도는 Bradford 법으로 분석하였다. NOS 효소 활성분석은 4 μM FAD, 4 μM tetrahydrobiopterin, 3 mM DTT, 2 mM L-arginine과 NADPH가 포함된 20 mM Tris–HCl (pH 7.
성능/효과
발현이 유도된 2상 효소(phase II enzyme)를 통해 염증조절이 가능한 보고를 토대로 본 실험에서도 2상 효소 중 하나인 NQO1의 발현을 분석하였다(Yang 등, 2015). Fig 5에서 보는 것처럼 GTEE의 처리에 의하여 NQO1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었고 또한 2상 효소의 전사인자인 Nrf-2의 활성 또한 농도 의존적으로 유도되는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과 GTEE는 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증을 전사인자인 NF-κB의 인산화 억제를 통해 염증 매개물질을 조절하고, Nrf-2의 활성 유도를 통해 NQO1의 발현 증가를 유도함으로써 염증을 억제하는 것을 알 수 있었다.
염증 매개물질의 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 활성을 분석하기 위하여 p65와 c-jun의 인산화 정도를 western blot으로 분석하였다. Fig. 4에서 보는 것과 같이 LPS-PG에 의해 유도된 p65의 인산화가 GTEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 미루어보아 GTEE는 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증 반응을 NF-κB와 AP-1의 활성을 억제함으로써 조절한다는 것을 알 수 있었다.
GTEE는 HGF-1 세포에서 500 μg/ml의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다. LPS-PG 자극으로 과발현된 iNOS와 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 그리고 세포내 단백질 추출 후 NOS의 활성을 분석한 결과 또한 iNOS의 결과와 같은 양상을 보여주었다.
결론적으로 GTEE는 NF-κB와 AP-1과 같은 염증성 전사인자의 억제와 2상 효소 발현 유도를 통해 HGF-1세포에서 LPS-PG의 자극에 의한 염증을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었고, 이는 치주질환의 치료를 위한 항염증제 후보 물질로서 GTEE의 가능성을 제시하는 결과로 생각된다.
결론적으로 GTEE는 NF-κB와 AP-1의 인산화를 억제하고 NQO1 활성을 유도함으로써 HGF-1 세포에서 LPS-PG에 의해 유도된 염증을 억제하는 것으로 사료되고, GTEE는 치주염 억제에 효과적인 항염증 물질의 가능성이 있는 후보물질이 될 수 있을 것으로 생각한다.
그 결과 Fig 2에서 보는 바와 같이 LPS-PG에 의해 발현량이 증가된 iNOS와 COX-2는 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 GTEE를 처리함에 따라 농도 의존적으로 이들의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
그 결과 LPS-PG에 의해 과발현된 iNOS와 COX-2는 GTEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 발현이 억제되었고, 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 인산화 또한 동일한 경향으로 발현이 억제되었다.
그 결과 Fig 2에서 보는 바와 같이 LPS-PG에 의해 발현량이 증가된 iNOS와 COX-2는 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 GTEE를 처리함에 따라 농도 의존적으로 이들의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 Griess reaction으로 분석한 세포내 NOS의 활성 또한 GTEE의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig 3).
GTEE의 처리가 HGF-1 세포의 생존에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 50, 100, 250, 500 μg/ml 농도의 GTEE를 2시간 동안 처리한 후 LPS-PG(1 μg/ml)를 24시간 동안 처리하였다. 그리고 WST assay로 세포 생존율을 분석한 결과 본 실험에 사용한 농도의 범위에서는 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig 1).
그 결과 LPS-PG에 의해 과발현된 iNOS와 COX-2는 GTEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 발현이 억제되었고, 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 인산화 또한 동일한 경향으로 발현이 억제되었다. 그리고 발현의 유도가 항염증 효과를 나타내는 것으로 알려진 2상 효소 중 하나인 NQO1과 이의 전사인자인 Nrf-2를 분석한 결과 GTEE의 처리에 의해 효소의 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 GTEE는 NF-κB와 AP-1의 인산화를 억제하고 NQO1 활성을 유도함으로써 HGF-1 세포에서 LPS-PG에 의해 유도된 염증을 억제하는 것으로 사료되고, GTEE는 치주염 억제에 효과적인 항염증 물질의 가능성이 있는 후보물질이 될 수 있을 것으로 생각한다.
본 연구에서 염증 관련 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 인산화 정도를 분석한 결과 GTEE에 의해서 NFκB와 AP-1의 subunit인 p65와 c-jun의 활성이 유의적으로 감소하였고 GTEE는 NF-κB와 AP-1의 활성을 조절함으로써 HGF-1 세포의 염증을 억제하는 것으로 생각된다.
특히, Nrf2의 유도에 의한 NQO1과 HO-1의 과발현이 염증매개물질인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제함을 보여주었다(Yang 등, 2016). 본 연구에서도 GTEE의 처리에 의해 NQO1과 전사인자인 Nrf-2의 활성 유의적으로 유도가 되는 것을 확인하였다.
본 연구의 결과 GTEE는 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증을 전사인자인 NF-κB의 인산화 억제를 통해 염증 매개물질을 조절하고, Nrf-2의 활성 유도를 통해 NQO1의 발현 증가를 유도함으로써 염증을 억제하는 것을 알 수 있었다.
이 결과로 미루어보아 GTEE는 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증 반응을 NF-κB와 AP-1의 활성을 억제함으로써 조절한다는 것을 알 수 있었다.
치주조직을 구성하는 세포 중 하나인 HGF-1 세포는 TNF-α, IL-1β과 같은 염증매개물질의 처리에 의해 NO가 증가되었고, 치주염 동물 모델에서 동일한 결과를 확인할 수 있었다.
후속연구
그러므로 NF-κB와 AP-1의 활성 조절을 통해 염증 매개물질을 억제할 수 있으면 치주염을 포함한 여러 염증 관련 질환의 치료에 효과적인 후보물질이 될 수 있을 것으로 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증 반응을 초기에 줄이는 것이 중요한 이유는 무엇인가?
물리·화학적 자극이나 미생물 감염 등에 기인하여 발생하는 조직의 손상을 복구하기 위한 반응을 염증이라고 한다(Lawrence 등, 2002). 염증이 유발되면 다양한 면역세포의 작용으로 대부분 급성의 상태에서 치유되지만 간혹 만성 염증으로 이행하는 경우 여러 조직이나 장기에 손상을 초래하기도 한다(Kundu & Surh, 2008). 그러므로 염증 반응을 초기에 줄이는 것이 중요하고 이를 위하여 많은 종류의 항염증제가 개발되어 사용되고 있으나 부작용 또한 많이 보고되고 있는 것이 사실이다(Kundu & Surh, 2008).
염증은 무엇인가?
물리·화학적 자극이나 미생물 감염 등에 기인하여 발생하는 조직의 손상을 복구하기 위한 반응을 염증이라고 한다(Lawrence 등, 2002). 염증이 유발되면 다양한 면역세포의 작용으로 대부분 급성의 상태에서 치유되지만 간혹 만성 염증으로 이행하는 경우 여러 조직이나 장기에 손상을 초래하기도 한다(Kundu & Surh, 2008).
치주질환의 주요한 원인은 무엇인가?
치주질환은 치주염과 치은염으로 분류되고, 잇몸에 발생하는 염증인 치은염이 악화되어 치아 주변 조직까지 염증이 번지는 치주염으로 발전하는 질환이다(Petersen & Ogawa, 2012). 특히, 치주질환은 구강 내에 상재하는 세균에 의해 자주 발생하고 그 중 Porphyromonas gingivalis가 주요 원인균인 것으로 보고되고 있다(Armitage, 1999; Hajishengallis & Lamont, 2014). 치주질환 병소에서 증식하고 열구상피에 침투하는 그람 음성 혐기성 간균인 P.
참고문헌 (27)
Armitage GC(1999). Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Ann Periodontol, 4(1), 1-6.
Holzhausen M, Rossa Jr C, Marcantonio Jr E, et al(2002). Effect of selective cyclooxygenase-2 inhibition on the development of ligature-induced periodontitis in rats. J Periodontol, 73(9), 1030-1036.
Jung KJ, Jung BM, Kim SB(2002). Effect of porphyran isolated from laver, porphyra yezoensis, on liver lipid peroxidation in hyperlipidemic rats and on immunological functions in mice. Kor J Food Sci Technol, 34(2), 325-329.
Kang BK, Ahn NK, Choi YU, et al(2014). Antiinflammatory activity of ethanol extract of Undaria pinnatifida root in RAW 264.7 cells. Kor J Fish Aquat Sci, 47(6), 751-756.
Kim JH, Kang HM, Lee SH, et al(2015). Antioxidant and ${\alpha}$ -glucosidase inhibition activity of seaweed extracts. Kor J Food Preserv, 22(2), 290-296.
Kim MJ, Kim KBWR, Jang MR, et al(2018). Inhibitory properties of gracilaria textorii ethanol extract on the inflammatory immune response. J Kor Soc Food Sci Nutr, 47(4), 387-394.
Kim SA, Kim J, Woo MK, et al(2001). Antimutagenic and cytotoxic effects of ethanol extracts from five kinds of seaweeds. J Kor Soc Food Sci Nutr, 34(4), 451-459.
Kim YH, Kim JH, Kim DH, et al(2016). Synergistic antimicrobial effect of Sargassum serratifolium (C. Agardh) C. Agardh extract against human skin pathogens. Kor J Food Sci Technol, 48(3), 241-246.
Lawrence T, Willoughby DA, Gilroy DW(2002). Antiinflammatory lipid mediators and insights into the resolution of inflammation. Nat Rev Immunol, 2(10), 787-795.
Lee HN, Lim DY, Lim SS, et al(2011). Anti-inflammatory effect of ethanol extract from Eupatorium japonicum. Kor Soc Food Sci Technol, 43(1), 65-71.
Li L, Sun W, Wu T, et al(2017). Caffeic acid phenethyl ester attenuates lipopolysaccharide-stimulated proinflammatory responses in human gingival fibroblasts via NF- ${\kappa}B$ and PI3K/Akt signaling pathway. Eur J Pharmacol, 794, 61-68.
Na HK, Surh YJ(2006). Intracellular signaling network as a prime chemopreventive target of (-)-epigallocatechin gallate. Mol Nutr Food Res, 50(2), 152-159.
Noda D, Hamachi T, Inoue K, et al(2007). Relationship between the presence of periodontopathic bacteria and the expressing of chemokine receptor mRNA in inflamed gingival tissue. J Periodontal Res, 42(6), 566-571.
Petersen PE, Ogawa H(2012). The global burden of periodontal disease: towards integration with chronic disease prevention and control. Periodontol, 60(1), 15-39.
Yang C, Zhang C, Wang Z, et al(2016). Corynoline isolated from corydalis bungeana turcz. Exhibits antiinflammatory effects via modulation of Nfr2 and MAPKs. Molecules, 21(8), 975.
Yang HL, Lin SW, Lee CC, et al(2015). Induction of Nrf2-mediated genes by Antrodia salmonea inhibits ROS generation and inflammatory effects in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages. Food Funct, 6(1), 230-241.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.