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문제 정의
- 그러한 흐름에 따라, 식품·의약품을 다루는 기관을 대상으로 2013년 7월 「식품·의약품 시험·검사에 관한 법률」 을 제정하여 2015년 7월부터 법정 당연지정 검사기관 및 민간검사기관에 불확도 산출을 의무화함으로서 분석시험결과의 신뢰도를 높이기 위해 노력하고 있다. 이러한 분석신뢰도를 높이기 위한 연구의 실례로서, 의약품에서 LC-MS/MS를 이용한 메틸페니데이트 및 대사체 정량분석에서 회귀분석법을 이용한 통계기법을 사용한 연구결과나 식이보충제로 사용되는 달맞이꽃종자 추출물의 지표물질에 대한 HPLC 분석법의 통계적 검증에 대한 연구결과가 보고된 바 있다 [10,11] 따라서 본 연구에서는 기능성 원료인 히알루론산을 이용하여 건강기능식품으로 시판되고 있는 식이보충제를 대상으로 식약처에서 고시하고 있는 건강기능식품공전 히알루론산 시험법에 따라 분석한 결과를 바탕으로 [6], 시험분석의 각 단계에서 발생하는 실험적 오차요인들을 도출한 후 수리통계학적 관계식으로부터 산출된 불확도 값이 최종 시험결과값에 미치는 영향을 산정하여 이 연구결과를 국내에서 시판하는 히알루론산 품질관리의 기초자료로 사용하고자 하였다 [7,8].
제안 방법
- 기능 (지표)성분을 분석하기 위해 PDA (photodiode array)가 달린 Nanospace SI-2 (Shiseido Co., Japan)를 사용했으며 HPLC 분석조건은 아래와 같다 [6]. 컬럼은 강염기성의 암모늄 음이온교환수지로 코팅된 실리카겔이 충진된 Hypersil GOLD SAX (4.
- 45 mL을 섞어서 효소반응 시켜서 만들었다. 따라서 각 농도별 (1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th)의 불확도는 표준원액으로부터 표준용액 조제시 발생하는 불확도 (자동피펫 및 용량플라스크)와 효소반응 과정의 불확도 (자동피펫)를 각 단계별로 합성하였다. Table 2에 단계별 표준용액 조제시 사용되는 자동피펫 용량플라스크에서 발생 하는 불확도를 정리하였다.
- 0 MΩ 수준으로 정제된 물을 사용하였다. 또한 본 실험에서 무게측정을 위해 사용한 저울 (Precisa, XT220A, Switzerland)은 교정기관에서 표준계측기를 사용하여 교정하였고, 그 밖의 초자류는 표기된 허용오차와 시험환경 조건을 반영하여 불확도를 추정하였다.
- 본 연구에서 건강기능성 식품으로 국내에서 시판되어 사용 되고 있는 히알루론산 식이보충제를 효소로 반응시킨 후, 그 반응물을 HPLC 기기를 이용하여 함량분석하는 분석시험법을 GUM 지침에 따라 불확도를 산정하였다. 불확도 발생의 원인들로는 측정량 계산에 사용되는 시료의 무게, 시험용액 전량, 기기측정값 등이 작용했고, 개별구성요소는 저울의 안정성, 분해능, 재현성, 표준품 순도, 농도, 표준용액 희석, 검량선, 회수율 및 기기 재현성을 고려하였다.
- 측정불확도 (measurement uncertainty)는 여러 측정들이 서로 비교가능할 수 있는 공통된 이해의 토대 위에서, 측정량에 대한 합리적 추정의 불확정함을 잴 수 있고 표현할 수 있게 하는 척도로 정의된다 [7]. 본 연구에서는 이러한 측정불확도의 산출을 위해 GUM [7]과 EURACHEM [8] 측정모델량을 선정하여 불확도 인자를 검토한 후, 요인별 표준불확도 및 자유도 계산을 통해 합성불확도를 구하였다. 불확도 요인은 크게 시료전처리 (저울의 교정성적서 및 안정성, 분해능, 초자의 허용오차, 반복성, 온도팽창계수), 표준용액조제 (표준물질 인증서, 저울의 교정성적서 및 안정성, 초자의 허용오차, 반복성, 온도팽창계수), 표준검량곡선, 시료 반복측정 및 회수율측정으로 나뉘어 각각의 상대표준불확도와 자유도를 구하였다.
- 본 연구에서 건강기능성 식품으로 국내에서 시판되어 사용 되고 있는 히알루론산 식이보충제를 효소로 반응시킨 후, 그 반응물을 HPLC 기기를 이용하여 함량분석하는 분석시험법을 GUM 지침에 따라 불확도를 산정하였다. 불확도 발생의 원인들로는 측정량 계산에 사용되는 시료의 무게, 시험용액 전량, 기기측정값 등이 작용했고, 개별구성요소는 저울의 안정성, 분해능, 재현성, 표준품 순도, 농도, 표준용액 희석, 검량선, 회수율 및 기기 재현성을 고려하였다. 불확도의 산출은 GUM과 EURACHEM/CITAC 방법에 기초하였고, 각 인자들은 A-type으로 산출된 표준불확도와 합성불확도로 계산하였다 [7,8].
- 본 연구에서는 이러한 측정불확도의 산출을 위해 GUM [7]과 EURACHEM [8] 측정모델량을 선정하여 불확도 인자를 검토한 후, 요인별 표준불확도 및 자유도 계산을 통해 합성불확도를 구하였다. 불확도 요인은 크게 시료전처리 (저울의 교정성적서 및 안정성, 분해능, 초자의 허용오차, 반복성, 온도팽창계수), 표준용액조제 (표준물질 인증서, 저울의 교정성적서 및 안정성, 초자의 허용오차, 반복성, 온도팽창계수), 표준검량곡선, 시료 반복측정 및 회수율측정으로 나뉘어 각각의 상대표준불확도와 자유도를 구하였다. 이렇게 얻은 불확도값에서 합성표준불확도와 포함인자 (k)를 이용하여 확장불확도를 계산하고 측정불확도를 산출하였다 [9,11].
- 시료를 5회 반복 측정하여 얻은 결과값을 토대로 표준불확도 (u(IR)) 및 상대표준불확도 (u(IR )/IR) 값을 산출했다. 시험 과정을 반복한 결과의 평균값은 57,747.
- 시료의 기질에 대한 불확도는 반복측정과 회수율 불확도의 상대불확도를 합성하여 구했다. 회수율 시험을 5회 반복 측정한 결과, 평균 및 표준편차는 94.
- 025/25)이었다. 이와 동일한 방법으로 2차 시험용액의 조제과정은 1차 시험용액에서 자동피펫을 이용하여 용량플라스크에 취하고 추출용액으로 표시선에 맞춤으로서 발생하는 불확도를 구하였다. 위와 같은 시험용액 조제시 발생되는 불확도 과정을 Table 1에 정리하였다.
- 측정결과의 값이 여러 가지 요인의 결과로부터 구해지며, 감도계수와 표준불확도, 상관계수를 측정불확도 관계식에 대입하여 구하였다. 이때 합성은 불확도 전파법칙 (law of propagation of uncertainty)에 따라 아래 합성표준불확도 관계식을 유도하였다.
대상 데이터
- 또한 분석을 위한 표준용액 조제를 위해 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 고순도 99±1%의 히알루론산 나트륨과 분해 효소인 콘드로이틴 (chondroitinase) ABC 효소를 함께 구입하여 사용하였다.
- 본 연구를 위한 시험시료로 국내 대형마트에서 시판되고 있는 히알루론산 식이보충제를 구입하여 사용하였다. 또한 분석을 위한 표준용액 조제를 위해 Sigma-Aldrich (St.
- 컬럼은 강염기성의 암모늄 음이온교환수지로 코팅된 실리카겔이 충진된 Hypersil GOLD SAX (4.6×250 mm, 5 μm, Thermo Fisher Scientific company, Waltham, MA, USA)을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 고순도 99±1%의 히알루론산 나트륨과 분해 효소인 콘드로이틴 (chondroitinase) ABC 효소를 함께 구입하여 사용하였다. 트리스염 (Tris base)과 아세트산나트륨 (sodium acetate) 및 염산은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 초순수는 EASY pure system (APS Water Services Corp.
데이터처리
- 검량곡선은 히알루론산의 표준용액 8개의 농도 9.4 µg/mL, 36.4 µg/mL, 66.1 µg/mL, 100.1 µg/mL, 269.1 µg/mL, 487.1µg/mL, 908.5 µg/mL 및 1487.2 µg/mL로 3회 조제하여 분석한 결과의 평균값을 이용하여 선형 최소제곱법으로 계산하였다.
- 불확도 요인은 크게 시료전처리 (저울의 교정성적서 및 안정성, 분해능, 초자의 허용오차, 반복성, 온도팽창계수), 표준용액조제 (표준물질 인증서, 저울의 교정성적서 및 안정성, 초자의 허용오차, 반복성, 온도팽창계수), 표준검량곡선, 시료 반복측정 및 회수율측정으로 나뉘어 각각의 상대표준불확도와 자유도를 구하였다. 이렇게 얻은 불확도값에서 합성표준불확도와 포함인자 (k)를 이용하여 확장불확도를 계산하고 측정불확도를 산출하였다 [9,11].
이론/모형
- 시료의 반복측정시 평균값을 측정값으로 사용하며 이때 표준불확도는 식 (5)를 적용하여 A type으로 구했다. 또한 무게 측정 시 저울의 안정성 등의 반복시험에 대한 불확도는 공통(pooled) 실험표준편차 방법에 따라 식 (6)과 (7)을 적용하여 A type 불확도를 구했다.
- 불확도 발생의 원인들로는 측정량 계산에 사용되는 시료의 무게, 시험용액 전량, 기기측정값 등이 작용했고, 개별구성요소는 저울의 안정성, 분해능, 재현성, 표준품 순도, 농도, 표준용액 희석, 검량선, 회수율 및 기기 재현성을 고려하였다. 불확도의 산출은 GUM과 EURACHEM/CITAC 방법에 기초하였고, 각 인자들은 A-type으로 산출된 표준불확도와 합성불확도로 계산하였다 [7,8]. 그 결과 식이보충제로써 사용되는 히알루론산의 함량과 시험과정중 발생하는 불확도의 추정값은 57,747.
- 측정결과의 값이 여러 가지 요인의 결과로부터 구해지며, 감도계수와 표준불확도, 상관계수를 측정불확도 관계식에 대입하여 구하였다. 이때 합성은 불확도 전파법칙 (law of propagation of uncertainty)에 따라 아래 합성표준불확도 관계식을 유도하였다.
- 포함인자 (k)는 합성표준불확도의 유효자유도 (Veff)를 추정하고, Welch-Satterth-Waite공식 식 (13)을 이용하여 산출하였다. 이 때, 유효자유도가 7 이상인 경우, EURACHEM/CITAC 지침에 따라 95% 신뢰수준에서 포함인자 k를 2로 기준하였다 [8].
성능/효과
- 그 결과 식이보충제로써 사용되는 히알루론산의 함량과 시험과정중 발생하는 불확도의 추정값은 57,747.52± 8,761.46 μg/g (신뢰수준 약 95%, k = 2.0일 때)으로 계산되어, 시험 전 과정에서 발생하는 불확도 추정은 함량 측정값의 15.2%로 산정되었다.
- 042/50)이었다. 따라서, 표준원액에 대한 상대합성표준불확도는 표준물질의 순도, 표준품계량, 플라스크의 상대표준불확도를 제곱합의 제곱근으로 계산하며 그 결과 0.00087로 나타났다. 표준용액 조제는 표준원액을 자동피펫을 이용하여 농도별로 9.
- 또한 각 불확도 인자의 기여율을 살펴보면 9.4 μg/mL 표준원액 조제시 희석단계에서 발생하는 불확도 기여율은 11.8%로 가장 컸으며, 그외 요인에서는 10% 미만의 비슷한 수준의 낮은 기여도를 나타남을 확인할 수 있었다.
- 또한, 각 시험과정에서 발생하는 불확도 요인의 기여도를 확인한 결과, 표준원액을 이용하여 9.4 μg/mL 농도의 표준용액 조제시 11.8%로 가장 컸으며, 그 다음은 표준용액 908.5 μg/mL 농도의 표준용액 조제시 9.8%, 표준용액 1487.2 μg/mL 농도의 표준용액 조제시 8.9%의 기여도를 보였다.
- ) 값을 산출했다. 시험 과정을 반복한 결과의 평균값은 57,747.52이며 표준편차는 2,194.97이였다. 따라서 표준불확도 (u(IR))는 표준편차를 (#)로 나눠준 값인 981.
- 또한 2차 시험용액 조제 시의 자동피펫의 불확도 (허용오차, 반복성, 실험실 온도에 따른 불확도) 요인을 고려했다. 즉, 시료 무게측정 시 저울에 대한 교정성적서상의 불확도는 95% 신뢰수준 (k = 2)에서 0.0005g의 불확도를 가지며, 표준불확도 (u(Wc))는 0.00025 g (0.0005/2)이였다. 이때 저울의 분해능은 0.
- 회수율 시험을 5회 반복 측정한 결과, 평균 및 표준편차는 94.46±1.6%이었으며, 이에 대한 표준불확도 (u(RM))는 표준편차와 같으므로 히알루론산의 표준불확도는 0.016이다.
후속연구
- 9%의 기여도를 보였다. 히알루론산의 분석법의 불확도 산정에 대한본 연구결과는 식이보충제로써 사용되는 국내 히알루론산의 제조 및 유통과정에서 제조사나 시험 · 검사기관의 품질관리를 위한 기초자료로 유용하게 사용되리라 기대한다.
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