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문제 정의
- 이제 본 연구에서는 이 등12)의 연구결과를 바탕으로 KV 약침을 조제하였고 MIA로 골관절염을 유발한 랫드에 4주간 委中(BL40) 에 실시한 결과, 혈청 내 관절염 유관 인자 및 체중부하 측정, micro-CT, 조직병리학적 검사 등에서 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 본 연구에 사용한 KV 약침(KV Pharmacopuncture, 이하 KV)은 續斷과 杜沖의 비율을 1:1 비율(각각 15 g)로 하여 220 ㎖ 의 정제수에 넣고 150℃의 추출온도에서 1시간 동안 추출을 진행하였다. 이후, 증류된 약침의 이물질 등을 제거하고 멸균을 실시하여 안전성 검사를 통해 안전성이 확보된 약침만을 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 KV 약침(KV Pharmacopuncture, 이하 KV)은 續斷과 杜沖의 비율을 1:1 비율(각각 15 g)로 하여 220 ㎖ 의 정제수에 넣고 150℃의 추출온도에서 1시간 동안 추출을 진행하였다. 이후, 증류된 약침의 이물질 등을 제거하고 멸균을 실시하여 안전성 검사를 통해 안전성이 확보된 약침만을 사용하였다.
- 2주간의 적응기 이후 마취제 (케타민 0.4 ㎖ + 림푼 0.1 ㎖)로 Rat를 마취하여 오른쪽 무릎관절 주변을 깨끗이 제모한 후, 골관절염 유발물질인 MIA를 당뇨주사기를 사용하여 우측 무릎 관절강 내에 60 ㎎/㎖의 농도로 50 ㎕씩 투여하였고 MIA 희석시에는 생리 식염수 (0.9% saline)를 사용하였다.
- 실험군은 관절염을 유발하지 않은 정상군과 퇴행성관절염 유발 후 생리식염수 (0.9% saline)만을 투여한 대조군과 약침 투여군 등 총 3그룹으로 나누었으며, 그룹 배분 시 유발이 되지 않은 동물은 폐사를 진행한 후 그룹 당 6마리씩 분류하였다.
- 약침 투여는 관절염 유발물질을 주입한 1주일 이후부터 매일 1회 50 ㎕씩 오전 10시에 우측 委中 (BL40)에 인슐린 주사기 (BD Ultra-Fine Ⅱ Insulin Syringe : BD Medical-Diabetes Care, U.S.A.)를 통해 실시하였고 실험기간은 총 4주간 진행하였다.
- 뒷발 체중부하 측정은 실험 종료 전 Incapacitance Test Meter를 이용하여 측정하였으며, 기기 설치된 플라스틱 케이지에 비스듬히 세운 후, 각 뒷발에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균 산출하였다. 산출 된 결과는 관절염을 유발한 우측 뒷발에 분포된 체 중의 백분율을 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산한 뒤 다시 대조군을 기준으로 백분율로 표시하였다.
- 뒷발 체중부하 측정은 실험 종료 전 Incapacitance Test Meter를 이용하여 측정하였으며, 기기 설치된 플라스틱 케이지에 비스듬히 세운 후, 각 뒷발에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균 산출하였다. 산출 된 결과는 관절염을 유발한 우측 뒷발에 분포된 체 중의 백분율을 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산한 뒤 다시 대조군을 기준으로 백분율로 표시하였다.
- Micro-CT 측정을 진행하고 남은 그룹 당 3마리의 우측 무릎 부위를 적출하여 포르말린에 고정한 뒤 ㈜옵티팜에 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 의뢰하였다.
- Micro-CT 측정은 실험종료 후 폐사가 진행된 동물 중 그룹 당 임의로 3마리를 선출하여 동국대학교(일산캠퍼스) 측에 의뢰하여 정면과 측면의 촬영결과를 3D로 변환하여 연골 부위를 판독하였다.
- Micro-CT 측정을 진행하고 남은 그룹 당 3마리의 우측 무릎 부위를 적출하여 포르말린에 고정한 뒤 ㈜옵티팜에 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 의뢰하였다. 이후 광학현미경으로 염색슬라이드를 통해 조직의 상태를 관찰하였다.
- 본 연구에 사용된 KV 약침은 風濕으로 인한 肢體疼痛 및 각종 風濕性關節炎이 장기간 지속될 때 사용하는 續斷과 杜沖을 활용하였으며, 이 두 배합물은 이전 연구결과12)에서 collagenⅡ로 관절염을 유발한 전임상 동물 실험에서 혈청 내 전염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β)과 IgM 및 다양한 항원의 감소를 통해 관절염 진행 관절부위에서의 효능이 밝혀진 바 있다.
- 이에 본 저자는 이 등의 실험적 효능과 문헌적 근거에 착안하여 MIA로 관절염을 유도한 랫드에게 4주간 KV 약침을 膝關節炎, 膝關節痛 등의 질환에 사용하는 穴位이자 足三里, 陽陵泉, 犢鼻 보 다 골관절염 동물 실험 시 약침 투여가 용이한 委中에 실시하여 골관절염 유관 인자 및 체중부하 측정, micro-CT, 조직병리학적 검사를 통해 관절염 치료제로써의 효능을 확인하였다.
- KV 약침 투여가 골관절염을 악화시키는 인자들을 감소시킴에 따라 골 형성에 도움을 주는 골 대사 지표들을 확인하고자 calcitonin과 glycosaminoglycan 등의 생성량을 확인하였다. Calcitonin은 칼슘의 손실을 예방하고 치료하는 호르몬으로써 갑상선에서 분비되어 혈중 칼슘을 뼈로 유입하는 작용을 하며, glycosaminoglycan은 관절 연골의 주요 성분인 proteoglycan을 형성하고 관절연골에 탄력성을 제공한다17,18).
- 본 연구는 MIA로 관절염을 유발한 랫드에게 續斷과 杜沖 배합으로 만든 KV 약침을 委中에 4주간 실시하여 관절염 유관 인자 및 효능을 혈액, 방사선, 조직병리학적인 방법으로 확인한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 시약은 dulbecco's phosphate buffered saline(Welgene, Korea), ether(Sigma Co., U.S.A.), formaldehyde(Sigma Co., U.S.A.), Rat total MMP-9 quantikine kit, Rat LTB4 parameter ELISA(R&D system, U.S.A.), Rat calcitonin ELISA kit, Rat Cross-Linked C-Terminal Telopeptides of Type Ⅱ Collagen (CTX-Ⅱ) ELISA kit, Rat Glycosaminoglycans ELISA kit(MyBioSouce Co., CA), MIA : Monosodium iodoacetate (Sigma Co., U.S.A.) 등을 사용하였으며, 사용된 기기는 ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.) Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, U.S.A.)등을 사용하였다.
- 수컷 6주령의 SD-Rat (170-200 g)을 (주)라온바이오(Korea)사 에서 공급받았고, 동물은 실험 당일까지 일반 고형사료를 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12 시간(light-dark cycle)의 환경에서 2 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 다시 washing 작업 후 100 ㎕의 substrate solution 용액을 첨가한 후 30분 동안 37℃ incubator에서 빛을 차단한 채 반응시키고 100 ㎕의 stop solution을 넣어 ELISA reader 450 nm 파장에서 측정하였다. 측정결과는 4 parameter logistic curve-fit을 이용하여 계산된 값을 대조군을 기준으로 백분율로 계산하였다.
- 이후, washing 작업을 실행 한 후 50 ㎕의 chromogen solution A와 B를 순차적으로 넣고 15분 동안 incubator에서 반응시키고 50 ㎕의 stop solution을 넣고 ELISA reader 450 nm 파장에서 측정하였다. 측정결과는 log-log fit을 이용하여 계산된 값을 대조군을 기준으로 백분율로 계산하였다.
- The statistical significance of differences between control and KV groups(*** : p<0.001) based on ANOVA with student’s t-test determined.
- 각 처리군의 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA) 방법을 이용하였고, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 검증하였다(p<0.001, p<0.01, p<0.05).
- 본 연구의 실험 결과는 평균값±표준 편차(mean±S.D.)로 표시하였다.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (## : p<0.01) or control and KV groups(** : p<0.01) based on ANOVA with student's t-test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (### : p<0.001) or control and KV groups(** : p<0.01) based on ANOVA with student's t-test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (# : p<0.05) or control and KV groups(* : p<0.05) based on ANOVA with student's t-test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (### : p<0.001) or control and KV groups(*** : p<0.001) based on ANOVA with student's t-test determined.
- The statistical significance of differences between normal and control groups (### : p<0.001) or control and KV groups(*** : p<0.01) based on ANOVA with student's t-test determined.
성능/효과
- 실험 종료 후 혈청 내 MMP-9 생성량을 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 MMP-9 생성량이 증가하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타나 정상 군과 비슷한 결과가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 LTB4 생성량을 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 LTB4 생성량이 증가하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타나 정상군과 비슷한 결과가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 CTXⅡ 생성량을 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군과 대조군에서는 그룹간의 차이가 나타나지 않았다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타나 정상군보다 낮은 결과가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 calcitonin 생성량을 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 calcitonin 생성량이 감소하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타나 정상군과 비슷한 결과가 나타났다(Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 glycosaminoglycan 생성량을 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 glycosaminoglycan 생성량이 감소하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타나 정상군보다는 낮았으나 우수한 결과가 나타났다 (Fig.
- 실험 종료 후 혈청 내 glycosaminoglycan 생성량을 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 glycosaminoglycan 생성량이 감소하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타나 정상군보다는 낮았으나 우수한 결과가 나타났다 (Fig. 5).
- 실험 종료 전 뒷발 체중 부하를 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 체중 부하 비율이 감소하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타나 정상군보다는 낮았으나 우수한 결과가 나타났다(Fig. 6).
- 무릎 관절의 H&E 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 약침 투여군은 대퇴골(Femur)과 경골(Tibia) 사이의 연골(Catilage)이 많이 감소된 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 약침 투여군이 대조군에 비해 연골 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다.
- 실험 종료 전 뒷발 체중 부하를 측정한 결과, 관절염을 유발하였을 때 정상군에 비해 체중 부하 비율이 감소하였다. 하지만, KV 그룹은 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 나타나 정상군보다는 낮았으나 우수한 결과가 나타났다(Fig.
- 무릎 관절을 micro CT를 이용하여 정면과 측면을 촬영한 결과, 정상군에 비해 대조군과 약침 투여군의 연골 양 (Catilage volume)이 많이 감소된 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 약침 투여군이 대조군에 비해 연골 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 약침 투여군은 정상군에 비해 대퇴골의 하단 측의 골의 부식과 파괴가 심하게 일어났으나 약침 투여군에서 골의 부식이나 파괴가 적었음을 육안적으로 확인할 수 있었다(Fig.
- 무릎 관절을 micro CT를 이용하여 정면과 측면을 촬영한 결과, 정상군에 비해 대조군과 약침 투여군의 연골 양 (Catilage volume)이 많이 감소된 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 약침 투여군이 대조군에 비해 연골 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 약침 투여군은 정상군에 비해 대퇴골의 하단 측의 골의 부식과 파괴가 심하게 일어났으나 약침 투여군에서 골의 부식이나 파괴가 적었음을 육안적으로 확인할 수 있었다(Fig. 7).
- 무릎 관절의 H&E 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 약침 투여군은 대퇴골(Femur)과 경골(Tibia) 사이의 연골(Catilage)이 많이 감소된 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 약침 투여군이 대조군에 비해 연골 양이 더 보존되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 약침 투여군은 정상군에 비해 연골 주변으로 침윤세포(Infiltrative cell)가 많이 생성되어 있는 것을 확인할 수 있었으나 상대적으로 약침 투여군이 대조군에 비해 침윤세포의 범위나 밀집도가 적음을 육안적으로 확인할 수 있었다(Fig. 8).
- 무릎 관절의 Safranin-O 염색을 실시한 결과, 정상군에 비해 대조군과 약침 투여군은 연골(Catilage) 주변과 활막(Synovial membrane) 내에 붉은색으로 염색된 proteoglycan이 고르게 형성되어 있지 않게 형성된 것을 확인할 수 있었으나 대조군은 proteoglycan이 소실된 개체를 보인 반면, 약침 투여군이 연골 주변과 활막 내 proteoglycan의 분포가 많음을 육안적으로 확인할 수 있었다(Fig. 9).
- 특히, CTXⅡ의 농도의 증가는 무릎에서는 6배, 고관절에서는 8배 이상의 골관절염이 빠르게 진행된다는 연구결과16)가 있어, 관절염 발생에 대한 중요한 지표라 할 수 있다. 본 연구 결과, KV 그룹은 대조군에 비해 MMP-9, CTXⅡ, LTB4 생성량이 유의성 있게 감소하여 관절 연골 및 골 파괴를 방어하는 것으로 나타났다.
- Calcitonin은 칼슘의 손실을 예방하고 치료하는 호르몬으로써 갑상선에서 분비되어 혈중 칼슘을 뼈로 유입하는 작용을 하며, glycosaminoglycan은 관절 연골의 주요 성분인 proteoglycan을 형성하고 관절연골에 탄력성을 제공한다17,18). 본 연구 결과, KV 그룹은 대조군에 비해 calcitonin과 glycosaminoglycan 생성을 정상 군에 가깝게 증가시켜 골 강화에 도움을 주는 것으로 확인되었다.
- 이와 같은 골 파괴 및 강화 등의 골 대사 인자의 유의적인 혈액학적 결과는 실험 종료 전 실시한 뒷발 부하 측정결과와 더불어 micro CT 및 조직병리학적 검사를 통해 육안적으로 KV 그룹이 대조군에 비해 연골 및 proteoglycan의 보존이 잘 되었고 동시에 골 파괴가 적게 일어난 결과들은 KV 약침 투여가 골관절염 개선에 효능이 있음을 더욱 뒷받침하고 있다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, KV 약침이 혈액 및 방사선, 조직학 등 다양한 관절염 유관 인자에 대한 효능이 과학적으로 입증됨으로써 임상에서의 활용성을 제고할 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 관절염 유도 방법과 동물의 개체, 시료 투여 방법에는 차이가 있으나, 두 연구 모두 혈액 및 병리조직학적 결과에서 효능이 나타남에 따라 기본적으로 續斷과 杜沖 배합이 관절염 증상에 있어 효과적인 처방으로 밝혀졌다. 따라서 향후 동일한 동물 및 배 합 조건에서 약침과 경구 투여에 대한 비교 연구와 더불어 임상연구 결과가 보완이 된다면 골관절염에 의해 경제, 사회적으로 손실을 보완해 줄 한의학 치료제로써 활용성이 높을 것으로 사료된다.
- KV 약침은 MMP-9, CTXⅡ, LTB4 등을 유의성 있게 감소시켰으며, calcitonin과 glycosaminoglycan 등을 유의성 있게 증가시켰다. 또한, 뒷발 체중부하와 micro-CT, 조직병리학적 검사에서 대조군에 비해 연골 및 proteoglycan의 보존과 더불어 골 파괴 등이 적게 나타난 것이 확인되었다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, KV 약침이 혈액 및 방사선, 조직학 등 다양한 관절염 유관 인자에 대한 효능이 과학적으로 입증됨으로써 임상에서의 활용성을 제고할 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 관절염 유도 방법과 동물의 개체, 시료 투여 방법에는 차이가 있으나, 두 연구 모두 혈액 및 병리조직학적 결과에서 효능이 나타남에 따라 기본적으로 續斷과 杜沖 배합이 관절염 증상에 있어 효과적인 처방으로 밝혀졌다.
- 또한, 관절염 유도 방법과 동물의 개체, 시료 투여 방법에는 차이가 있으나, 두 연구 모두 혈액 및 병리조직학적 결과에서 효능이 나타남에 따라 기본적으로 續斷과 杜沖 배합이 관절염 증상에 있어 효과적인 처방으로 밝혀졌다. 따라서 향후 동일한 동물 및 배 합 조건에서 약침과 경구 투여에 대한 비교 연구와 더불어 임상연구 결과가 보완이 된다면 골관절염에 의해 경제, 사회적으로 손실을 보완해 줄 한의학 치료제로써 활용성이 높을 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과는 KV 약침이 골 대사에 영향을 주어 관절염 개선의 효능이 있음을 확인하였으며, 향후 임상에서 활용이 가능 한 치료제임을 시사하고 있다.
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