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문제 정의
- 또한 우리나라 병원성 대장균 식중독의 경우 환자에서의 규명 비율은 높은 반면에 식품에서 원인 규명 비율은 낮은 것이 문제점으로 지적되고 있다12). 따라서 본 연구는 유통중인 생닭 및 가열 조리된 닭가공품에서 병원성 대장균의 오염도를 조사하고 병원성 유전자 및 혈청형을 분석하여 병원성 대장균의 특성을 파악하고자 하였다. 이러한 결과는 병원성 대장균에 의한 식중독 발생의 원인 파악의 기초 자료로 활용될 수 있다고 생각된다.
제안 방법
- 3) pic, EHEC-hly, ent, astA 로 tgradient PCR (Biometra, Goettingen, Germany) multiplex PCR을 이용하였다1).
- PCR 반응 조건은 predenaturation 94oC에서 5분 후, 35cycles의 94°C에서 30초, 55°C에서 75초, 68°C에서 75초로 반응하였고 최종 extension은 68°C에서 7분 반응 시켰다.
- STEC를 분석하기 위해 E. coli Antigen group O sera(Denka Seiken, Tokyo, Japan)을 사용하였고 분석방법은 O antigen의 응집반응을 slide에서 확인하였다. 기타 시험방법은 제조사의 메뉴얼에 따라 분석하였다.
- 생닭(N = 132) 및 가열 조리된 닭가공품(N = 224)를 슈퍼마켓이나 대형 유통매장에 유통중인 시료를 구입하였다. 구입된 시료는 교차오염을 방지하기 위해 멸균백에 담아 냉장 운반하였으며 구입 후 4시간 이내 시험을 실시하였다.
- coli Antigen group O sera(Denka Seiken, Tokyo, Japan)을 사용하였고 분석방법은 O antigen의 응집반응을 slide에서 확인하였다. 기타 시험방법은 제조사의 메뉴얼에 따라 분석하였다.
- 반응 산물은 2% Seakem agarose gel (Takara, Kyoto, Japan)에서 100 V, 25분 전기영동 후 ethidium bromide (1 µg/mL) 염색 후 확인하였다.
- 배양 후 전형적인 집락을 선별하여 Vitek 2 (Biomeriux, Marcy L'Etoile, France)를 이용하여 생화학 시험 후 동정하였다.
- 분리한 대장균에 대해서 독성 유전자 존재를 분석하였다. 독성 유전자는 1) uidA, invE, escV, aggR, stx1, 2) eaeA, elt, ipaH, stx2, estIb, 3) pic, EHEC-hly, ent, astA 로 tgradient PCR (Biometra, Goettingen, Germany) multiplex PCR을 이용하였다1).
- 증폭된 DNA는 2% agarose gel (Takara, Kyoto, Japan)을 100 V로 30분간 전기영동 후 ethidium bromide (1 µg/mL)에 염색하여 UV transilluminator로 확인하였다.
대상 데이터
- 독성 유전자는 1) uidA, invE, escV, aggR, stx1, 2) eaeA, elt, ipaH, stx2, estIb, 3) pic, EHEC-hly, ent, astA 로 tgradient PCR (Biometra, Goettingen, Germany) multiplex PCR을 이용하였다1). Primer는 Bioneer (Cheongwon, Chungbuk, Korea)에서 구입하였고 sequence는 Table 1과 같다. PCR은 총 반응액 20 µL으로 accupower multiplex PCR pre mix (Bioneer, Daejon, Korea)에 1U의 taq polymerase 250 µM, 각각 dNTPs, 10 mM Tris-HCl, 1.
- Shiga toxin-producing E. coli (STEC)의 혈청학적 검사를 위해 O26, O157, O145, O111, O121, O103, O91의 혈청형에 대해 rfb (o-specific polysaccharide), wzx (o-unit flippase), wbsD (aminotransferase)의 o-항원 유전자에 특이적으로 결합하는 primer를 사용하였다(Table 2)15,16). PCR 반응액은 1 U Taq polymerase, 250 µM 각 dNTPs, 10 mM Tris-HCl, 30 mM KCl, 1.
- 생닭(N = 132) 및 가열 조리된 닭가공품(N = 224)를 슈퍼마켓이나 대형 유통매장에 유통중인 시료를 구입하였다. 구입된 시료는 교차오염을 방지하기 위해 멸균백에 담아 냉장 운반하였으며 구입 후 4시간 이내 시험을 실시하였다.
이론/모형
- 대장균은 Bacteriological Analytical Manual13) 및 식품공전14) 시험방법으로 분리하였다. 시료 25 g에 225 ml of mTSB broth (Difco, Detroit, MI.
성능/효과
- STEC, EHEC로 분리된 병원성 대장균 25균주를 PCR을 이용해서 7종의 혈청형에 대해서 분석한 결과 escV 유전자를 보유하고 있는 1 균주에서 O26 혈청형이 확인되었다. PCR을 이용해서 확인되지 않은 병원성 대장균을 antisera로 분석한 결과 stx1 유전자를 보유한 EHEC에서는 O152, O1 혈청형이 확인되었으며 EHEC-hly 유전자를 보유한 EHEC에서는 O116 혈청형이 확인되었다(Table 5). 그 밖에 STEC에서는 O26, O25, O119, O153의 혈청형이 각 1개씩 확인되었으며, O26으로 분리된 시료는 PCR과 동일한 결과가 나타났다.
- STEC, EHEC로 분리된 병원성 대장균 25균주를 PCR을 이용해서 7종의 혈청형에 대해서 분석한 결과 escV 유전자를 보유하고 있는 1 균주에서 O26 혈청형이 확인되었다.
- 따라서 본 시험에서 생닭의 분리한 대장균 중 병원성 대장균 검출률은 56.3%로 높았으나 그 중 위해성이 높은 균주는 1균주(0.7%)였다.
- 병원성 대장균 STEC, EPEC는 11균주(13.8%)가 검출되었다. 공존하고 있는 STEC균주는 atypical EPEC에 존재하는 모든 독성 인자를 보유하기 때문에 STEC와 EPEC를 구분하는 것은 불가능하다1).
- 병원성 유전자를 토대로 STEC, EPEC, EHEC, EIEC or EAEC의 병원성 대장균으로 분류한 결과 대장균 80균주에서 병원성 대장균45균주 (56.3%)분리되었다(Table 4).
- 6%의 대장균이 검출되었다. 본 연구 결과 생닭에서의 대장균 검출률은 59.8%로 선행 연구 보다 높게 검출되었다. 대장균의 경우 유통 과정 중 다양한 경로 의해 교차 오염이 될 수 있으므로 완전 포장되어 유통되지 않고, 구매자의 요구에 따라 포장 판매가 되거나 절단이 되는 경우는 대장균이 교차 오염에 의해 검출될 수 있다.
- 그 외 다른 병원성 대장균(O157, O145, O111, O121, O103, O91)은 확인되지 않았다. 분석한 25 균주 중 7균주만 혈청형을 알 수 있었다. 그 밖의 다른 균주는 O serotyping이 불가능했으며 이는 Kim 등18)과 유사하게 serotyping이 불가능한 균주들이 분리되었다.
- 시료에서 분리한 대장균 80균주에 대해서 병원성 유전자를 분석한 결과 astA 유전자가 26균주(32.5%)에서 검출되었으며, escV 유전자는 17균주(21.3%) eaeA 유전자는 16균주(20.0%) 검출되었다. 특히 식품에서 문제가 되는 장출혈성 대장균 유전자 stx1는 3균주(3.
- 공존하고 있는 STEC균주는 atypical EPEC에 존재하는 모든 독성 인자를 보유하기 때문에 STEC와 EPEC를 구분하는 것은 불가능하다1). 식품에서 위해성이 높은 EHEC는 2균주(2.5%)가 검출되었으며, typical EPEC, EIEC and ETEC의 병원성 대장균은 검출되지 않았다. 6균주(7.
- 7%)였다. 조리한 닭의 경우는 대장균의 검출률이 0.4%로 시중 유통중인 조리된 닭의 경우는 안전하게 조리 가열되고 있음을 알 수 있었다. 그러나 생닭에 위해성이 높은 대장균이 존재하므로 생닭은 가공 조리 시 교차오염이 발생하지 않도록 조리 도구, 조리 환경에 대한 철저한 관리가 필요하다고 생각된다.
- 0%) 검출되었다. 특히 식품에서 문제가 되는 장출혈성 대장균 유전자 stx1는 3균주(3.8%)와 stx2, EHEChly는 각 1균주 (1.3%)로 검출되었다(Table 3).
후속연구
- 이러한 결과는 병원성 대장균에 의한 식중독 발생의 원인 파악의 기초 자료로 활용될 수 있다고 생각된다.
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