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문제 정의
- β-Amylase는 내산성을 가졌고, 누룩 존재 미생물 중 거미줄곰팡이속(Rhizopus)과 누룩곰팡이속(Aspergillus)의 곰팡이 효소들은 β-amylase를 가지고 있다(11)는 점에서 맥주 당화과정에 첨가함으로써 맥주 발효 향상을 위해 사용하는 효소제들을 보충하거나 대체할 수 있는 것으로 판단하였다. 따라서 본 연구는 우리나라 대표 곡물주의 당화발효제인 전통제조방식의 시판 누룩을 맥주 제조 시 당화과정에 첨가함으로써 발효방식 개선과 새로운 관능적 품질을 가진 ale 맥주 제조 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 0의 식초산 완충용액 30 mL를 150-200 mL 플라스크에 넣고 55oC의 항온 물중탕기에서 10분간 예열하고 방치한 후 효소 용액 10 mL를 가하여 60분간 당화 시켰다. 0.5 N NaOH 10 mL를 가하여 효소작용을 중지시킨 후 냉각해 1% 메틸렌블루(methylene blue) 지시약을 2-3방울 가하고 포도당 표준 용액으로 적정하여 당화력(Saccharogenic Power, SP)을 계산하였다. 1 SP는 상기실험조건 하에서 1시간에 효소 1 g이 10 mg의 포도당을 생성하는 양으로 정의하였다.
- 각각 측정 평균값 간의 유의성은 p<0.05 수준으로 Duncan의 다중범위시험법을 사용해 검증하고자 하였다.
- 04% 넣은 고체 배지를 만들어 생균수를 측정하였다. 균수의 측정은 희석법을 이용하여 고체배지에 0.1 mL 도말하여 30oC 항온기에서 48시간 배양한 한 후 집락수를 계수해 콜로니형성단위(Colony Forming Units; CFU/mL)로 나타내었다.
- , Fullerton, Germany)에서 원심분리한 후 사용하였다. 그 후 굴절당도계(Model PR-101, oBrix 0-45%, Nipponoptical works Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 당도를 3회 반복 측정하여 평균값을 구하고 oBrix%로 표시하였다. pH는 맥주 온도를 25oC로 유지하며 10 mL를 pH meter (pH meter, 920A, Orion research, Boston, MA, USA)로 3회 측정하였다.
- 누룩을 첨가한 맥주의 아미노산 측정을 위해 주류분석규정(14)에 따라 95% 에탄올(ethanol)에 페놀프탈레인(phenolphthalein) 0.5g을 용해한 지시약과 포말린(formalin) 50 mL에 지시약을 가하고 0.1 N 수산화소듐(NaOH) 용액으로 담홍색이 될 때까지 중화한 것에 물을 가해 100 mL로 만든 중성 formalin 용액을 사용했다. 시료 10 mL에 phenolphthalein 용액을 가하고 0.
- 당화 후 조리용 채반을 이용하여 맥아를 여과시키고 추가로 78oC의 증류수 3 L를 천천히 부어서 맥아에 붙어있는 당분들을 추출하면서 맥즙을 제조하였다. 여과방식을 통해 얻은 맥즙에 홉을 넣고 가스레인지로 1시간 동안 끓여 홉의 성분을 충분히 추출한 후, 25oC로 냉각시키고 건조 효모 Safale us-05를 투입하였다.
- 맥주를 만드는 방법과 재료의 비율은 에일 맥주를 만드는 방법을 응용하여 만들었으며(6) 맥주에 첨가한 재료의 비율은 Table 1과 같다. 맥아와 분쇄한 누룩을 당화조에 넣고 증류수 3 L를 첨가한 후 3분 간격으로 5회씩 섞어주었고, 45, 55, 65oC로 30분마다 온도를 점차 높여 당화력을 촉진하고 75oC까지 온도를 높여 맥아 자체에 있는 효소를 불활성화 시켰다(6,13).
- 맥주의 색은 주류분석 규정에 따른 SRM (Fig. 6)으로 시료간의 차이를, 색차계(L, a, b) 값으로 제조완성 된 맥주를 측정했다(Table 2). 흡광도를 이용한 맥주 색(SRM)은 발효가 활발하게 이뤄졌던 발효 초기 1일과 2일에 각각 11-16(SRM), 9-11(SRM) 사이로 높은 수치를 보였고 점점 낮아져 5일에는 약 5-6(SRM)의 값을 나타냈다.
- 5 mL와 20 mL 2,2,4-trimethylpentane을 넣은 후 250 rpm의 일정한 속도를 유지하며 좌우로 움직이는 항온수조(ESV3025-W, Polyscience, IL, USA)에 넣고 15분간 섞어주었다. 상층액을 취하여 자외선분광광도기(Du730, Beckman coulter, Inc, CA, USA)를 이용하여 275 nm에서 흡광도 A를 측정하였다.
- 맥주의 색은 맥주 5 mL를 투명한 플라스틱페트리접시(plastic petridish; 35×10 mm)에 넣고 색차계(Chroma Meter, CR-300, Minolta, Osaka, Japan)를 사용해 명도를 나타내는 L값(lightness), 적색을 나타내는 a값(redness), 황색을 나타내는 b값(yellowness)을 측정해 나타냈다. 색도(Standard Reference Method; SRM)는 주류 분석규정(14)과 ASBC(15) 방법을 응용해 맥주의 흡광도를 430 nm에서 측정하여 그 값에 10을 곱한 값으로 색도를 계산하였다.
- 1 N 수산화소듐(NaOH) 용액으로 담홍색이 될 때까지 중화한 것에 물을 가해 100 mL로 만든 중성 formalin 용액을 사용했다. 시료 10 mL에 phenolphthalein 용액을 가하고 0.1 N NaOH 용액으로 담홍색이 될 때까지 중화한 후 중성 formalin 용액 5 mL를 가해 유리된 산을 0.1 N NaOH 용액으로 담홍색이 될 때까지 적정하고 소비된 NaOH 용액의 부피(mL)를 A라고 하고 주류분석 규정에 따른 총산의 역가를 F로 하여 아미노산도 공식에 대입하였다.
- 시료의 유리당, 유기산 분석을 위해 시료의 상등액을 취해 3차 증류수로 희석한 후 0.2 μm 막거르개(membrane filter; Whatman, Clifton, NJ, USA)를 이용해 여과하였고, HPLC(2487, Waters Co., Milford, MA, USA)를 이용해 분석하였다.
- C의 증류수 3 L를 천천히 부어서 맥아에 붙어있는 당분들을 추출하면서 맥즙을 제조하였다. 여과방식을 통해 얻은 맥즙에 홉을 넣고 가스레인지로 1시간 동안 끓여 홉의 성분을 충분히 추출한 후, 25oC로 냉각시키고 건조 효모 Safale us-05를 투입하였다. 효모 첨가량은 맥아즙 1 mL 당 1×107 CFU 수준으로 하였으며 첨가 후 air lock을 장착해 효모 활성을 높여주었다(5,6).
- )를 이용하여 210 nm 검출 파장에서 측정하였다. 유리당과 유기산 농도는 각각 성분의 HPLC 면적 값을 표준용액의 검량곡선을 이용해 농도를 측정하였다.
- 저장기간에 따른 맥주의 점도는 실험용점성계(Viscometer, LVDVI prime, Brookfield, Middleboro, MA, USA)를 사용해서 20oC에서 3회 반복 측정하였다.
- 총 균수와 효모균 수를 측정하기 위해 각각 평판우무배지(Plate Count Agar; Difco, NJ, USA)와 YMPGA (Yeast Extract 0.3%, Malt Extract 0.3%, Peptone 0.5%, Glucose 1%, Agar 2%)에 chlortetracycline hydrochloride (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), chloramphenicol (Sigma-Aldrich)를 각각 0.04% 넣은 고체 배지를 만들어 생균수를 측정하였다. 균수의 측정은 희석법을 이용하여 고체배지에 0.
- 효모 첨가량은 맥아즙 1 mL 당 1×107 CFU 수준으로 하였으며 첨가 후 air lock을 장착해 효모 활성을 높여주었다(5,6).
대상 데이터
- Column은 Aminex HPX-87c (300×7.8 mm, Bio-rad Lab, Hercules, CA, USA)를 사용하였으며 Column 온도는 85oC, 이동상 유속은 0.6 mL/min으로 하였고 검출기는 Refractive Index Detector(RI 2414, Waters Co.)를 사용하였다.
- Column은 Luna 5 μ C18 (250 nm×4.2 mm, phenomenex, Torrance, CA)를 사용하였으며 Column 온도는 40oC, 이동상 유속은 0.5 mL/min으로 하였고 검출기(UV 2487, Waters Co.)를 이용하여 210 nm 검출 파장에서 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 맥아는 2014년 재배 수확한 2조 보리로 에일 맥아(Pale Ale, Weyermann, Banbery, Germany)를 사용했고, 페일에일, IPA 맥주에 많이 사용되는 cascade 홉(cascade hop AA 5.4% beer school, USA)을 사용했다. 효모(활성 건조효모 Safale us-05, Bision Co.
- 본 실험은 주류학과 관련된 수업을 듣는 S 대학교 학생 55명을 대상으로 9점 척도법(9: 대단히 좋음 5: 보통 1: 대단히 나쁨)으로 이루어졌다. 본 실험에서는 C, N5, N10, N15 4가지 각 시료에 세 자리 난수표로 코드화한 후 Williams’ Latin square 법에 따라 random으로 제시하였고, 관능평가는 ANOVA 및 Duncan의 다범위검정을 통하여 p<0.
- )를 사용하였다. 유기산 분석의 표준물질은 말산(malic acid), 아스코브산(ascorbic acid), 젖산(lactic acid), 아세트산(acetic acid), 시트르산(citric acid), 석신산(succnic acid)으로 특급시약(Sigma-Aldrich)을 사용하였다. Column은 Luna 5 μ C18 (250 nm×4.
- , Milford, MA, USA)를 이용해 분석하였다. 유리당 분석의 표준시약은 포도당(glucose), 설탕(sucrose), 엿당(maltose), 과당(fructose) 및 에탄올(ethanol)로 특급시약(Sigma-Aldrich)을 사용하였다. Column은 Aminex HPX-87c (300×7.
- 4% beer school, USA)을 사용했다. 효모(활성 건조효모 Safale us-05, Bision Co., Sungnam, Korea)는 에일 맥주를 만드는 상면 발효용을 사용했고, 누룩(Sansung Nuruk Co., 국내산, 밀 100%, Busan, Korea)은 크기를 균일하게 하기위해 분쇄기(1022SS, Hanil, Seoul, Korea)를 이용하여 1분 동안 분쇄하였다.
데이터처리
- 5)Means in a column by different superscripts are significantly different at 5% significance level by Duncan’s multiple range test.
- 6)Means in a column by different superscripts are significantly different at 5% significance level by Duncan’s multiple range test.
- 7)Mean, *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 at 5% significance level by Duncan’s multiple range test.
- 본 실험에서는 C, N5, N10, N15 4가지 각 시료에 세 자리 난수표로 코드화한 후 Williams’ Latin square 법에 따라 random으로 제시하였고, 관능평가는 ANOVA 및 Duncan의 다범위검정을 통하여 p<0.05에서 유의적인 차이를 검증하였다.
- 실험결과는 SPSS 프로그램(SPSS 12.0 for windows, SPSS Inc.)을 사용하였고 분산분석(ANOVA)을 실시하였다. 각각 측정 평균값 간의 유의성은 p<0.
이론/모형
- 각 누룩의 당화력 측정은 2% 가용성녹말 용액을 기질로 하여 주류분석규정(14)에 따라 측정하였다. 2%의 물에 녹는 녹말용액 50 mL, pH 5.
- 환원당은 주류분석규정에 명시된 Lane-Yenonoe법 및 Betrand법의 변법을 사용하였으며 실험 방법은 당화력 측정방법과 같다. 아래 식을 이용하여 환원당 함량을 측정하였다(16).
성능/효과
- 또한, 원심분리를 통한 부유물제거 이후 첨가된 설탕은 효모에 의해 사용되어 알코올로 변환되었고, 설탕을 첨가한 후인 6일에 포도당과 과당의 양이 높은 값을 보였다. 6일 이후로 포도당은 숙성기간 내내 줄어드는 경향성을 보였는데 효모가 에너지원으로 사용된 것으로 효모 생균 수 측정결과(Fig. 4)에서 효모의 성장 시기로 확인할 수 있었다. 알코올은 꾸준히 증가하여 저장 마지막인 41일에 N15의 경우 6.
- Body는 C가 5.44±1.64 값으로 가장 높았고, Color, Flavor는 누룩을 가장 많이 첨가한 N15의 기호성이 좋았다.
- 누룩을 첨가한 맥주의 관능적 품질특성의 결과는 Table 4와 같이 나타났다. Color, Bitterness, Sourness, Aftertaste, Overall acceptance는 누룩이 첨가된 시료의 기호도가 대조구보다 높았다. 또한, Sweetness, Bitterness, Sourness, Aftertaste, Overall acceptance는 N5가 각각 4.
- 거품 안정성(Foam stability (Σ))은 C는 135.62±10.28, N5는 228.49±31.81, N10은 316.78±21.24, N15는 368.24±23.25로 누룩의 첨가량이 많을수록 거품 안정성이 유의적으로 높은 값을 보였다.
- 이는 맥주의 부유물이 침전 제거되는 것으로 보고된 결과로 판단하였다(17). 그 이후 원심분리를 통한 여과로 인해 6일에 약간 낮아졌다가 잔당으로 인한 숙성과 저장 기간을 거치면서 6-7(SRM)로 수치가 높아졌고 누룩의 함량이 높을수록 색이 진해지는 경향성을 보였다. 한편, 맥주를 색차계(L, a, b)로 측정하였을 때 명도 L값은 유의적인 차이가 없었고, 적색도 a값은 마이너스로 초록색계통을 나타냈으며 C, N5, N10은 같은 집단으로 분류되었다.
- 맥주효모는 엿당과 말토트라이오스를 세포막을 거쳐 세포 내로 수송하기 위한 투과효소(permease)를 지니고 있는데 이 효소에 의해 세포 내로 수송된 엿당과 말토트라이오스는 포도당 단위로 가수분해 된다(27,28). 또한, 원심분리를 통한 부유물제거 이후 첨가된 설탕은 효모에 의해 사용되어 알코올로 변환되었고, 설탕을 첨가한 후인 6일에 포도당과 과당의 양이 높은 값을 보였다. 6일 이후로 포도당은 숙성기간 내내 줄어드는 경향성을 보였는데 효모가 에너지원으로 사용된 것으로 효모 생균 수 측정결과(Fig.
- 숙성과정 전 원심분리를 통한 여과과정을 거친 6일째에는 약 104-105 CFU/mL 까지 균수가 줄었다가 병입을 하는 과정에서 공기접촉과 숙성과정 중 설탕 첨가로 인한 탄소원의 증가로 다시 효모균이 증가하면서 13일째에는 약 106 CFU/mL으로 다시 증가하였다. 맥주 효모로 쓰인 Saccharomyces cerevisiae는 생육속도가 빠르고 알코올 내성이 우수하므로(6), 효모 증식이 숙성기간 빠르게 회복 증식하는 것을 확인하였다. 숙성 후 4oC에서 4주의 저장 기간을 거치는 동안 효모는 세포 내 대사 조성물들은 세포막을 통해 환경과 반응하며 신진대사를 조절하고 용존산소 이용 여부, 기질 고갈 등을 통해 외부 환경 변화에 적응한다(17).
- 발효 0일에 엿당 농도는 5.83±0.5(%)로 가장 높은 수치를 나타내었고 발효 기간 내내 유의적으로 수치가 낮아졌다.
- 발효, 숙성, 저장 기간에 따른 총 균수(Fig. 4), 효모균 수(Fig. 5)를 계수하였을 때 두 배지에서 비슷한 균수를 나타냈고 균의 대부분은 효모균으로 판단되었다. 발효를 시작하고 효모균은 대체적으로 1일에 약 107 CFU/mL에서 5일은 최대 1.
- 발효를 시작하고 효모균은 대체적으로 1일에 약 107 CFU/mL에서 5일은 최대 1.42×107 CFU/mL의 생균수를 보여 큰 차이 없이 약간 증가하는 경향성을 보였다.
- 맥주 거품의 안정성은 맥아 단백질, β-glucan, 아라비노자일란, 알콜함량 등과 상관관계가 있고 특히, 거품을 생성하는 것은 단백질로부터 기인되는 폴리펩타이드를 통해 거품 품질을 예측할 수 있는 것으로 보고되었다(26). 본 연구에서 폴리펩타이드의 양을 직접적으로 측정하지는 않았으나 거품안정성이 누룩 첨가량에 따라 높아지는 것으로 보아 누룩의 첨가가 거품품질을 향상하는데 도움이 되는 것으로 판단되었다. 또한 누룩에 존재하는 Aspergillus 계통에서 분비되는 acid protease 효소는 맥주의 산성 pH조건에서 peptide bond를 가수분해하여 거품 형성에 유리한 펩타이드를 공급하여 거품 안정성에 기여(11)할 수 있다고 보고된 바 있다.
- 이는 효모의 생물학적 발효과정을 통해 엿당은 분해되고 포도당은 효모의 에너지원으로 소모되어 효모가 에탄올과 이산화탄소를 생산하였으며 에탄올은 1.45±0.1(%)인 대조구에 비해 누룩의 첨가량이 증가할수록1.54-3.07(%)로 높은 수치를 나타내었다.
- 이는 효모가 에너지원으로 맥즙 내 존재하는 유리당을 사용한 것으로 판단된다(17). 일반적으로 효모가 이용할 수 있는 발효성 당류(포도당, 설탕, 엿당, 말토트라이오스(maltotriose))들은 효모의 생리작용을 통해 에탄올 및 이산화탄소로 변환이 이뤄지게 되며(17), 누룩 함량별 가용성 고형분의 유의적인 차이는 없었지만 HPLC로 측정한 유리당(Fig. 7) 결과에서 발효 기간 동안 엿당, 포도당은 누룩 함량이 많을수록 빨리 소모되었고, 발효성 당류가 줄어들면서 생기는 에탄올 또한 대조구보다 누룩 함량이 증가할수록 수치가 높았다. 한편, 발효 기간 5일이 지난 후 여과하여 설탕을 첨가해 효모가 잔당을 발효하고 이산화탄소를 생산하여 그로 인해 숙성기간인 6일째 약 0.
- 환원당 또한 C는 1.67±0.2 낮은 값으로 누룩의 첨가량이 많아질수록 당화력이 높아짐에 따라 환원당이 증가하는 것으로 확인하였다.
- 6)으로 시료간의 차이를, 색차계(L, a, b) 값으로 제조완성 된 맥주를 측정했다(Table 2). 흡광도를 이용한 맥주 색(SRM)은 발효가 활발하게 이뤄졌던 발효 초기 1일과 2일에 각각 11-16(SRM), 9-11(SRM) 사이로 높은 수치를 보였고 점점 낮아져 5일에는 약 5-6(SRM)의 값을 나타냈다. 발효가 완화되면서 화합물의 농도가 감소할 뿐만 아니라 CO2가 생성되면서 발효 5일차에 값이 내려갔다.
후속연구
- 2 낮은 값으로 누룩의 첨가량이 많아질수록 당화력이 높아짐에 따라 환원당이 증가하는 것으로 확인하였다. 아미노산도를 제외하고는 누룩의 첨가량이 증가할수록 점도, 쓴맛이 낮아졌으며, 거품 안정성, 환원당 값들이 증가하는 것을 보았을 때 누룩의 미생물에서 기인한 분해 효소들로 인해 맥주 내 존재하는 폴리페놀, 단백질, 탄수화물과 같은 고분자 분자량 물질들이 분해되어 분자량 크기가 작은 물질들로 분해되어 나온 결과와 연관성이 있었을 것으로 추측할 수 있으나 이 부분에 대해서는 확인이 필요할 것으로 판단된다. 누룩 자체의 당화력은 363±4.
- 대부분 15-25의 쓴맛을 나타내는 영국 브라운 에일과 10-24의 쓴맛을 나타내는 마일드 에일의 쓴맛 정도와 비슷하였다. 효소첨가로 인해 생성된 당 성분 함량의 증가와 함께 단백질 분해로 인해 쓴맛이 상쇄되는 것으로 보인다는(10) 선행연구가 있지만 이 부분에 대한 연구는 더 필요할 것으로 보인다.
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