본 연구에서는 HPLC를 이용하여 생물전환된 참깨의 lignan 화합물 분석법 검증을 시행하였다. 분석법 검증 결과 표준용액 sesamol, sesamin, sesamolin과 참깨 비발효물 및 발효물의 머무름 시간이 일치하는 것을 확인하였으며, spectrum 분석 결과 동일한 spectrum을 나타내어 특이성을 확인하였다. 직선성의 경우 sesamol, sesamin 및 sesamolin의 검량선은 모두 0.9999로 1에 가까운 우수한 직선성을 보여주었다. 참깨 비발효물의 lignan 함량 측정 결과, intra-day에서 2.67 mg/g 및 inter-day에서 2.42 mg/g으로 나타났으며, sesamolin은 intra-day에서 3.77 mg/g 및 inter-day에서 3.37 mg/g을 나타내었다. 참깨 발효물의 sesamin 함량은 intra, inter-day에서 각각 2.97 mg/g, 2.75 mg/g을 보였으며, sesamolin은 intra-day 4.23 mg/g, inter-day 3.92 mg/g으로 나타났다. 일내 정밀도에서 참깨 비발효물의 경우 0.25~0.43%로 나타났으며 참깨 발효물은 0.47~0.69%를 나타냈다. 일간 정밀도에서 참깨 비발효물은 RSD 0.27~0.64%의 정밀도를 보였으며 참깨 발효물은 1.34~1.94%의 정밀도를 나타내어 모두 RSD 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. 또한, sesamol은 98.43~110.72%, sesamin은 106.45~115.10%, sesamolin은 99.18~112.05%의 범위의 우수한 회수율을 나타내었다. 검출한계는 sesamol $0.34{\mu}g/g$, sesamin $0.26{\mu}g/g$, sesamolin $0.23{\mu}g/g$으로 나타났으며, 정량한계는 각각 $1.03{\mu}g/g$, $0.78{\mu}g/g$, $0.70{\mu}g/g$을 보였다. 본 연구 결과 지표성분 sesamol, sesamin 및 sesamolin의 분석방법이 적합한 분석방법임을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 HPLC를 이용하여 생물전환된 참깨의 lignan 화합물 분석법 검증을 시행하였다. 분석법 검증 결과 표준용액 sesamol, sesamin, sesamolin과 참깨 비발효물 및 발효물의 머무름 시간이 일치하는 것을 확인하였으며, spectrum 분석 결과 동일한 spectrum을 나타내어 특이성을 확인하였다. 직선성의 경우 sesamol, sesamin 및 sesamolin의 검량선은 모두 0.9999로 1에 가까운 우수한 직선성을 보여주었다. 참깨 비발효물의 lignan 함량 측정 결과, intra-day에서 2.67 mg/g 및 inter-day에서 2.42 mg/g으로 나타났으며, sesamolin은 intra-day에서 3.77 mg/g 및 inter-day에서 3.37 mg/g을 나타내었다. 참깨 발효물의 sesamin 함량은 intra, inter-day에서 각각 2.97 mg/g, 2.75 mg/g을 보였으며, sesamolin은 intra-day 4.23 mg/g, inter-day 3.92 mg/g으로 나타났다. 일내 정밀도에서 참깨 비발효물의 경우 0.25~0.43%로 나타났으며 참깨 발효물은 0.47~0.69%를 나타냈다. 일간 정밀도에서 참깨 비발효물은 RSD 0.27~0.64%의 정밀도를 보였으며 참깨 발효물은 1.34~1.94%의 정밀도를 나타내어 모두 RSD 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. 또한, sesamol은 98.43~110.72%, sesamin은 106.45~115.10%, sesamolin은 99.18~112.05%의 범위의 우수한 회수율을 나타내었다. 검출한계는 sesamol $0.34{\mu}g/g$, sesamin $0.26{\mu}g/g$, sesamolin $0.23{\mu}g/g$으로 나타났으며, 정량한계는 각각 $1.03{\mu}g/g$, $0.78{\mu}g/g$, $0.70{\mu}g/g$을 보였다. 본 연구 결과 지표성분 sesamol, sesamin 및 sesamolin의 분석방법이 적합한 분석방법임을 확인할 수 있었다.
The aim of this study was to investigate method validation for determination of sesamol, sesamin, and sesamolin in non-fermented sesame and fermented sesame by bioconversion. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, limits of detection (LOD), and quantification (LOQ) of sesam...
The aim of this study was to investigate method validation for determination of sesamol, sesamin, and sesamolin in non-fermented sesame and fermented sesame by bioconversion. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, limits of detection (LOD), and quantification (LOQ) of sesamol, sesamin, and sesamolin were measured by HPLC. Linearity tests showed that the coefficients of calibration correlation ($R^2$) for sesamol, sesamin, and sesamolin were 0.9999. Recovery rates of lignan contents in non-fermented and fermented sesame were high in the ranges of 100.27~115.10% and 98.43~114.90%, respectively. The inter-day and intra-day precisions of sesamin and sesamolin analyses for non-fermented and fermented sesame were 0.27~1.94% and 0.25~0.69%, respectively. The LOD and LOQ were $0.23{\sim}0.34{\mu}g/g$ and $0.70{\sim}1.03{\mu}g/g$, respectively. These results indicate that the validated method is appropriate for the determination of sesamol, sesamin, and sesamolin.
The aim of this study was to investigate method validation for determination of sesamol, sesamin, and sesamolin in non-fermented sesame and fermented sesame by bioconversion. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, limits of detection (LOD), and quantification (LOQ) of sesamol, sesamin, and sesamolin were measured by HPLC. Linearity tests showed that the coefficients of calibration correlation ($R^2$) for sesamol, sesamin, and sesamolin were 0.9999. Recovery rates of lignan contents in non-fermented and fermented sesame were high in the ranges of 100.27~115.10% and 98.43~114.90%, respectively. The inter-day and intra-day precisions of sesamin and sesamolin analyses for non-fermented and fermented sesame were 0.27~1.94% and 0.25~0.69%, respectively. The LOD and LOQ were $0.23{\sim}0.34{\mu}g/g$ and $0.70{\sim}1.03{\mu}g/g$, respectively. These results indicate that the validated method is appropriate for the determination of sesamol, sesamin, and sesamolin.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 생물전환에 의한 참깨 발효물을 건강기능식품 원료로써 개발 시 원료의 표준화를 위하여 lig-nan 화합물인 sesamol, sesamin 및 sesamolin의 분석방법 및 분석법 검증에 대한 연구를 실시하였다.
생물전환(bioconversion)이란 생물공정(bioprocessing), 생합성(biosynthesis) 등의 용어와 의미상 중복성을 가지며, 미생물 및 효소 등을 이용한 생물학적 방법을 통하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 기술을 뜻한다. 즉 기존 천연물에 함유된 물질의 구조적 변화를 유도하여 유효성분의 함량 증가 및 새로운 기능성분의 생성을 유도하는 기술이다. 기존의 발효공정은 상대적으로 간단한 원료물질에서 출발하는 반면, 생물전환은 효소의 기질에 대한 선택성을 이용하여 전구물질로부터 산물을 생산한다는 점에서 차이를 나타낸다.
제안 방법
정밀성에 대한 검증은 참깨 추출물을 inter-day(일간)와 intra-day(일내)로 나누어 진행하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간별로 3회, 9반복하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 정량한 값은 표준편차를 평균으로 나누어 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 백분율로 나타내었다.
45 μm syringe filter(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다. Lignan 화합물의 HPLC 분석은 식품첨가물의 기준 및 규격 천연첨가물 참깨 유불검화물(17)을 변형하여 실시하였다(Table 1). 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co.
참깨의 생물전환공정은 효소처리 및 멸균과정을 거쳐 배양배지화한 표고균사를 접종하여 생물전환 발효공정을 통해 1차 발효물을 생산하였다. 그 후 2차 생물전환 효소처리공정을 실시하였다. 발효미생물로 선정한 표고버섯 균사의 접종량과 배양시간을 최적화하기 위하여 종균배양의 growth curve fitting을 통해 각 발효미생물의 배양상태를 확인한 후 cell mass 농도에 따라 3 point를 선정하고, 접종량을 각각 10%, 20%로 하여 본 발효배양에 접종하여 배양시간 및 접종량을 비교하여 최적화를 진행하였다.
농도를 알고 있는 참깨 비발효물 및 발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을 각각 3가지의 농도(15, 20, 25 μg/mL)로 첨가한 후 HPLC로 분석하였다.
2). 또한, 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다(Fig. 1).
그 후 2차 생물전환 효소처리공정을 실시하였다. 발효미생물로 선정한 표고버섯 균사의 접종량과 배양시간을 최적화하기 위하여 종균배양의 growth curve fitting을 통해 각 발효미생물의 배양상태를 확인한 후 cell mass 농도에 따라 3 point를 선정하고, 접종량을 각각 10%, 20%로 하여 본 발효배양에 접종하여 배양시간 및 접종량을 비교하여 최적화를 진행하였다. 효소처리 최적화는 배양기질인 참깨와 발효배양산물인 배양균사체의 세포벽을 구성하고 있는 유용물질을 세포벽으로부터 효율적으로 추출하기 위하여 β-glucanase, cellulase, hemicellu-lase(DMS Food Specialties, Chilgok, Korea) pectinase, β-glucosidase, amylase, protease(Shin Nihon Chemical Co.
정확성 검증은 농도를 알고 있는 참깨 추출물에 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 각각 15, 20, 25 μg/mL의 세 가지 농도로 첨가하여 분석하였다. 분석한 결과를 다음식을 이용하여 회수율(recovery)로 나타내어 HPLC 분석방법의 정확성을 확인하였다.
정밀성에 대한 검증은 참깨 추출물을 inter-day(일간)와 intra-day(일내)로 나누어 진행하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간별로 3회, 9반복하여 분석하였다.
정확성 검증은 농도를 알고 있는 참깨 추출물에 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 각각 15, 20, 25 μg/mL의 세 가지 농도로 첨가하여 분석하였다.
정확성은 표준물질을 시료에 첨가한 후 분석하여, 표준물질을 가한 시료의 검출반응과 순수 표준물질의 검출반응을 비교하는 spiking과 recovery 방법으로 실험하여 참값을 정확히 회수할 수 있는지 회수율 계산을 통해 확인하였다(24). 농도를 알고 있는 참깨 비발효물 및 발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을 각각 3가지의 농도(15, 20, 25 μg/mL)로 첨가한 후 HPLC로 분석하였다.
직선성에 대한 검증은 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 각각 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125.0, 250.0 μg/mL씩 단계적으로 희석한 다음 각각의 표준물질을 HPLC로 분석하여 3회 반복 측정하였으며, peak 면적비에 대한 농도비의 관계를 표시하는 검량선을 작성하고 작성된 검량선으로부터 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
직선성은 시료 중 분석물질의 양에 대하여 직선적인 측정값을 나타내는 정도로 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 이용하여 각각 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125.0, 250.0 μg/mL의 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 값으로 각 물질의 검량선을 작성하였다.
참깨에 함유된 lignan 화합물의 분석을 위하여 추출물을 0.45 μm syringe filter(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다.
특이성 검증은 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin 및 참깨 추출물을 HPLC로 분석한 후 chromatogram을 비교하여 sesamol, sesamin, sesamolin이 선택적으로 분리가 되는지 확인하였으며 PDA spectrum을 이용하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.
즉 다른 물질의 간섭 없이 분리되는 것으로 특이성을 확인할 수 있다(19). 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 spectrophotometer를 사용하여 200 nm에서 400 nm까지의 흡수파장을 분석하였다. 그 결과, sesamol은 296 nm, sesamin은 287 nm, sesamolin은 288 nm에서 각각의 최대흡수파장을 나타내었다(Fig.
효소처리 최적화는 배양기질인 참깨와 발효배양산물인 배양균사체의 세포벽을 구성하고 있는 유용물질을 세포벽으로부터 효율적으로 추출하기 위하여 β-glucanase, cellulase, hemicellu-lase(DMS Food Specialties, Chilgok, Korea) pectinase, β-glucosidase, amylase, protease(Shin Nihon Chemical Co., Ltd., Aichi, Japan) 등의 효소를 0.1~2%로 첨가하여 50~60°C 조건에서 1~3시간 동안 shaker(SI-4000R, Jeio Tech Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 250 rpm에서 효소/기질반응을 수행하였다.
본 연구에 사용한 참깨는 2014년 10월에 수확된 진율 품종으로, 국립식량과학원(Miryang, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 표준물질인 sesamol, sesamin, sesamolin은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.
데이터처리
*Significantly different between non-fermented and fermented sesame at P<0.05 by Student’s t-test.
Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간별로 3회, 9반복하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 정량한 값은 표준편차를 평균으로 나누어 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 백분율로 나타내었다.
이론/모형
HPLC를 이용한 lignan 화합물의 분석방법은 의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(18)을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limits of detection, LOD), 정량한계(limits of quantification, LOQ)를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다.
성능/효과
47%로 나타났다. Inter-day 정밀도에서는 참깨 비발효물 sesamin의 경우 0.27%, sesamolin 0.64%를 보였으며 참깨 발효물에서 sesamin 1.34%, sesamolin 1.94%로 나타나 inter-day, intra-day 모두 RSD 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. 참깨 비발효물의 sesamin 함량의 경우 intra-day에서 2.
정밀성이란 같은 시료에 대하여 연속적인 분석을 통해 얻은 결과 간의 유사함을 의미하는 것으로 참깨 추출물의 정밀성 분석 결과는 Table 2와 같다. Intra-day 정밀성 RSD값은 참깨 비발효물의 sesamin의 경우 0.25%, sesamolin은 0.43%로 나타났으며 참깨 발효물의 sesamin의 경우 RSD 값이 0.69%, sesamolin 0.47%로 나타났다. Inter-day 정밀도에서는 참깨 비발효물 sesamin의 경우 0.
검출한계 및 정량한계의 분석 결과, sesamol의 검출한계는 0.34 μg/g, 정량한계는 1.03 μg/g으로 나타났으며, ses-amin의 경우 검출한계 0.26 μg/g, 정량한계 0.78 μg/g으로 나타났다.
0 μg/mL의 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 값으로 각 물질의 검량선을 작성하였다. 그 결과, sesamol(y=18309x-17636, R2=0.9999), sesamin(y=29746x-33563, R2=0.9999), sesamolin(y=17667x-25926, R2=0.9999)으로 나타났으며 모두 0.9999의 상관계수(R2)를 나타내어 우수한 직선성을 확인하였다.
표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 spectrophotometer를 사용하여 200 nm에서 400 nm까지의 흡수파장을 분석하였다. 그 결과, sesamol은 296 nm, sesamin은 287 nm, sesamolin은 288 nm에서 각각의 최대흡수파장을 나타내었다(Fig. 1). 또한, chromatogram을 비교한 결과 lignan 화합물 3종의 혼합물과 참깨 추출물에서 각 peak의 머무름 시간(retention time)이 각각 4.
1). 또한, chromatogram을 비교한 결과 lignan 화합물 3종의 혼합물과 참깨 추출물에서 각 peak의 머무름 시간(retention time)이 각각 4.6, 9.5, 11.1분대로 다른 물질의간섭 없이 분리되었으며 표준용액의 머무름시간과 참깨 추출물의 머무름시간이 일치하는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 또한, 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다(Fig.
농도를 알고 있는 참깨 비발효물 및 발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을 각각 3가지의 농도(15, 20, 25 μg/mL)로 첨가한 후 HPLC로 분석하였다. 분석 결과(Table 3), sesamol의 회수율은 첨가된 농도에 따라 98.43~110.72%를 나타냈으며, sesamin은 106.45~115.10%의 회수율을 보였다. Sesamolin의 경우 99.
37 mg/g을 나타내었다. 참깨 발효물의 sesamin 함량은 intra, inter-day에서 각각 2.97mg/g, 2.75 mg/g을 보였으며, sesamolin은 intra-day 4.23mg/g, inter-day 3.92 mg/g의 함량을 보여 생물전환을 통해 참깨의 sesamin, sesamolin의 함량이 증가하는 것으로 나타났다. Lim 등(20)은 sesamin과 sesamolin 급여 시 간 지방산 산화에 관여하는 다양한 효소의 활성 증가를 보고하였으며, Lee 등(21)은 RAW 264.
후속연구
또한, Jung 등(22)의 연구에서 생물전환을 통한 참깨 발효물에서 lignan 함량의 증가와 더불어 다양한 항산화 모델에서 효능을 증대시켰다. 따라서 본 연구의 생물전환을 통한 참깨 발효물의 sesamin 및 sesamolin의 증가로 인한 추가적인 생리활성이 기대된다. Sesamol의 경우 참깨 비발효물과 발효물에서 모두 검출되지 않았다.
70 μg/g으로 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 참깨의 sesamol, sesamin 및 sesamolin을 유용성분 및 지표성분으로 선정 시 분석법 검증을 통하여 이들 원료의 표준화가 가능할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
참기름의 산화안정성은 참깨의 어떤 성분 때문인가?
)는 참깨과(Pedaliaceae) 참깨속(Sesamum)에 속하는 식물로 예로부터 재배되어 온 주요 유지작물 중 하나이며(1), 주성분은 지질 약 50%, 단백질 약 20%, 탄수화물 약 15%, 회분 약 5%로 구성되어 있다(2). 참깨를 이용하여 기름을 짠 참기름은 고온에서 장시간 방치하여도 산화되지 않는 강한 산화안정성을 가지고 있는데, 이는 참깨의 항산화 성분인 sesamol, sesamin, sesamolin 등의 lignan 화합물에 의한 효과로 알려져 있다(3).
참깨란?
참깨(Sesamum indicum L.)는 참깨과(Pedaliaceae) 참깨속(Sesamum)에 속하는 식물로 예로부터 재배되어 온 주요 유지작물 중 하나이며(1), 주성분은 지질 약 50%, 단백질 약 20%, 탄수화물 약 15%, 회분 약 5%로 구성되어 있다(2). 참깨를 이용하여 기름을 짠 참기름은 고온에서 장시간 방치하여도 산화되지 않는 강한 산화안정성을 가지고 있는데, 이는 참깨의 항산화 성분인 sesamol, sesamin, sesamolin 등의 lignan 화합물에 의한 효과로 알려져 있다(3).
Sesamolin이 방사선과 관련된 효능은?
참깨의 지표성분인 lignan 화합물의 효능으로는 sesamol을 급여한 흰쥐의 항산화 효과(4), 피부 진피세포에서 UV-B에 의하여 유도된 산화적 스트레스에 대한 sesamol의 보호 효과(5) 및 방사선에 의한 DNA 손상 및 지질 과산화물 생성 억제(6) 등이 보고되어 있으며, sesamin의 경우 신경세포 내의 활성산소 저하 작용(7) 및 dopamine 생합성 촉진(8)이 알려져 있다. Sesamolin은 마우스의 간과 신장에서의 과산화지질 억제 효과(9) 및 streptozotocin으로 유도된 당뇨병 모델 마우스에서의 혈관 내 과산화지질 및 산화적 스트레스 감소(10) 등의 효능이 보고되었다.
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